Name: 用原生动物给鱼作动物感染的载体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 了解利用尾草履虫作为载体对斑马鱼幼虫进行食源性感染的方法。该技术可模拟人类胃肠道感染动态，减少组织损伤，为研究微生物定植与宿主相互作用提供活体可视化模型。

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感谢Krachler课题组成员对本文手稿的审阅和宝贵意见。本工作由德克萨斯大学系统STAR奖、英国生物技术和生物科学研究所（BBSRC）以及美国国立卫生研究院（NIH，项目编号R01AI132354）资助。&#160;

此处所述的斑马鱼饲养、繁殖和实验均遵循《实验动物护理和使用指南》，并已获得德克萨斯大学健康科学中心机构动物福利委员会批准，方案编号为AWC-16-0127。
1. Paramecia 的培养与维持
<ol>
	<li>从斑马鱼国际资源中心（Zebrafish International Resource Center, ZIRC）等来源获取活体草履虫培养物。</li>
	<li>从正在生长的活体培养物中，取1 mL草履虫培养物，加入1 mL大肠杆菌MG1655（E. coli MG1655）培养物（重悬于1×E3溶液中，OD600为1.0–2.0；1×E3成分为：0.29 g/L NaCl、13 mg/L KCl、44 mg/L CaCl2、81 mg/L MgSO4、0.48 g/L HEPES，pH 7.0，经灭菌处理）以及8 mL 1×E3溶液，共同加入至10 mL组织培养瓶中。轻轻摇匀后，于22 °C保存。</li>
	<li>为维持培养物，每两周将1 mL草履虫培养物传代至一个新的10 mL组织培养瓶中，并加入9 mL新鲜的1×E3培养基，其中含有以1×E3溶液重悬的大肠杆菌MG1655（E. coli MG1655），浓度为108 CFU/mL。</li>
</ol>
2. 斑马鱼给药细菌剂量的测定
<ol>
	<li>测定细菌在体内的半衰期 草履虫 
	注意： 通过平板培养法测定细菌在草履虫体内的半衰期 E. coli 从草履虫中回收，如下所述。
	<ol>
		<li>经过2小时的细菌培养（OD600 在22 °C条件下，将浑浊度为1.0的草履虫与细菌共培养物混合，转入50 mL锥形管中，用1× E3缓冲液洗涤草履虫，并计数每毫升草履虫数量（具体操作见下文步骤3.2.7和3.2.8）。</li>
		<li>计数草履虫数量后，每隔一小时（暴露后6小时内）取出50 µL草履虫与细菌的共培养液，将每份样品加入新的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>加入950 µL的1%非离子表面活性剂（参见 材料表将磷酸盐缓冲液（PBS）溶液加入每个1.5 mL离心管中，涡旋震荡1分钟以裂解草履虫。使用无菌PBS作为稀释液，对每个样品进行1:10稀释（即100 µL样品加入900 µL PBS中）。</li>
		<li>将每种稀释液各取 100 µL 接种至选择性平板（LB 四环素培养基：1 g/L 胰蛋白胨，0.5 g/L 酵母提取物，1 g/L NaCl，30 µg/mL 四环素），于 37 °C 培养 16 小时。次日，仅计数并记录平板上分离良好且界限清晰的单个细菌菌落（菌落形成单位，CFUs）。选择菌落数在 30–300 CFU 范围内的稀释度平板进行鉴定。</li>
		<li>确定所用的稀释倍数。例如，若将1 µL细菌培养物与99 mL无菌PBS混合，则为1:100（0.01）的稀释倍数。该数值即为稀释液中的菌落形成单位（CFU）数量。针对每个时间点，通过以下计算确定原始样品中的CFU数量： 
		<img alt="Colony-forming unit calculation formula; CFU from dilution, dilution factor, volume plated equation." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq1.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 1"></li>
		<li>计算并绘制可存活细胞数量 E. coli/草履虫，根据步骤 3.3.1 计算的草履虫浓度，对应暴露后的小时数，并确定其在草履虫体内的半衰期（图1).</li>
		<li>根据每个时间点计算出的菌落形成单位（CFU）数值，计算并绘制活菌数量 E. coli 纵轴为每个草履虫的数量，横轴为孵育后的小时数，使用步骤3.3.1中计算的草履虫浓度绘制曲线，并确定草履虫内的半衰期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据细菌的半衰期和捕食速率确定细菌的给药剂量。 
	注意： 确定细菌剂量时，必须考虑细菌在草履虫体内的半衰期以及斑马鱼对草履虫的捕食率（见步骤3.4）。
	<ol>
		<li>使用以下公式计算草履虫体内细菌的衰减速率： 
		(1)  <img alt="Exponential decay formula \( N(t) = N_0 e^{-k\tau} \) equation." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq2.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 2"> 
		其中 N0 是2小时孵育后每只草履虫内的初始细菌数量，Nt 是经过时间 t 后剩余的细菌数量，τ 是活菌数量减半所需的时间，k 为衰变常数。</li>
		<li>根据降解实验，利用细菌的半衰期（即活菌/草履虫数量减半所需的时间）确定衰变常数 k。 
		(2)  <img alt="Exponential decay equation, ln(Nt/No) = -k*τ, chemical kinetics, formula image." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq3.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 3"> 
		半衰期的测定 <img alt="Population decay equation, Nt/No=1/2, mathematical formula, exponential decay concept." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq4.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 4"> 和 
		(3)  <img alt="Exponential decay equation, ln(1/2)=-kτ, related to kinetics, displayed in formula format." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq5.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 5"> 或 
		(4)  <img alt="Chemical reaction rate constant equation, k = -ln(1/2)/τ, mathematical formula." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq6.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 6"> 
		注意： 根据 图1，其半衰期为 E. coli 在草履虫中约为2.3小时。因此，利用公式（4），可得衰变速率常数k为 E. coli 是： 
		(5)  <img alt="Exponential decay equation, rate constant k calculation, showing process and final result." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq7.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 7"></li>
		<li>根据半衰期实验确定衰变速率（k），以计算斑马鱼幼鱼在捕食时间（t）后摄入的活菌剂量（Nt），其中（P）为捕食速率，即每条鱼每小时摄食的草履虫数量： 
		(6)  <img alt="Exponential decay formula ln(Nt/No·P)=-kt; kinetic study; mathematical equation." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq8.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 8"> 或 
		(7)  <img alt="Dosage calculation formula, exponential decay equation, mathematical expression, educational use" src="/files/ftp_upload/58949/58949eq9.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 9"> 
		注意： Per 图1，每个草履虫体内的初始细菌数量（N0孵育2小时（t）后，菌落数为790 CFU。每 视频 1 和 图2，捕食率（P）为1539。</li>
		<li>利用这些数值代入方程（7），计算斑马鱼在2小时孵育后摄入的细菌剂量为： 
		(8)  <img alt="Dosage calculation equation for bacteria count; formula showing CFU calculation result." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq10.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 10"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 斑马鱼的食物源性感染
<ol>
	<li>将细菌与孵育 草履虫.
	<ol>
		<li>准备一种草履虫与 E. coli MG1655 感染前夜。将 8 mL E3 培养基、1 mL 正在培养的四膜虫培养物和 1 mL 的 E. coli MG1655 菌株培养（OD600 = 1.0) 重悬于 T25 组织培养瓶中的 1× E3 溶液中，在室温（RT）下孵育过夜。每种处理条件需准备两瓶草履虫。</li>
		<li>接种细菌生长培养基（LB：1 g/L 胰蛋白胨，0.5 g/L 酵母提取物，1 g/L NaCl），使用无菌接种环从平板上挑取单个细菌菌落，接种至培养基中。将液体培养物于37 °C孵育，并以每分钟110转（rpm）的转速振荡培养过夜。 
		注意： 处理传染性病原体时应穿戴个人防护装备（实验服和手套），并使用生物安全二级设施。</li>
		<li>第二天，测定OD值600 过夜培养物的体积。计算达到目标OD值所需的培养物体积600 重悬于11 mL培养基中时，其值为1。</li>
		<li>通过在6,000 x g条件下离心，收集步骤3.1.2中的细菌体积 g 5分钟，每个草履虫培养瓶加入等体积。弃去上清液，将细菌沉淀重悬于1 mL E3培养基中。</li>
		<li>可选地，用荧光染料对细菌进行预染色。
		<ol>
			<li>加入1 µL FM 4-64FX细菌染料（5 mg/mL储存液）。用铝箔包裹管子以避免光漂白，并在室温下旋转孵育（端对端）15分钟。</li>
			<li>通过用1x E3洗涤去除多余的染料：离心收集细菌沉淀 通过 6,000 × 离心 g 孵育1.5分钟，然后将沉淀重悬于1 mL E3培养基中。重复洗涤步骤两次。</li>
			<li>收获染色后的细菌 通过 6,000 × 离心 g 5 分钟后弃去上清液，将细菌沉淀重悬于 1 mL E3 培养基中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向两份新鲜的草履虫培养物中分别加入1 mL细菌悬液。在室温下孵育2小时。 
		注意： 若处理染色后的细菌，需在室温避光孵育2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤细菌/草履虫共培养物。
	<ol>
		<li>将两个锥形瓶中的草履虫/细菌共培养物合并至一个50 mL离心管中。在300 x g 在15 °C下离心10分钟。确保离心机在此步骤前已预冷。</li>
		<li>使用血清移液管移除约 10 mL E3 上清液，并向锥形管中加入约 10 mL 新鲜的 1x E3。 
		注意： 在所有洗涤步骤中，去除上清液时必须迅速操作，因为草履虫会开始从沉淀中游出。每次仅对一个离心管进行离心并去除上清液，以确保此步骤操作足够迅速，避免草履虫随上清液丢失。</li>
		<li>离心样品 通过 在15 °C下以300 x g离心5分钟。使用血清移液管移除约10 mL E3上清液，并向锥形管中加入约10 mL新鲜的1x E3溶液。重复此步骤两次。</li>
		<li>300 x g 离心样品 g 在15 °C下离心5分钟。小心移除约10 mL E3上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于剩余的10 mL E3培养基中，取500 µL悬液转移至新的1.5 mL微量离心管中。以300 x g离心，沉淀500 µL的草履虫。 g 5分钟内计数草履虫的数量。</li>
		<li>从500 µL样品中移除400 µL E3上清液。向剩余的100 µL草履虫中加入20 µL 36.5%甲醛溶液，轻轻重悬，并在22 °C孵育5分钟。 
		注意： 此步骤可杀死草履虫，以便进行计数。</li>
		<li>使用移液器测量实际总体积并记录。用0.4%台盼蓝溶液将草履虫悬液按1:1体积比稀释。</li>
		<li>使用细胞计数器或血细胞计数板对每毫升死亡的草履虫数量进行计数。 
		注意： 由于先前的固定步骤，大多数草履虫在此时已经死亡，但该数值反映的是共孵育实验中活草履虫的数量。作者未发现细菌共孵育会导致草履虫死亡率显著增加，因此在此可忽略其作为影响因素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共孵育 草履虫 和斑马鱼幼鱼。
	<ol>
		<li>计算草履虫的浓度： 
		<img alt="Dilution factor formula, 500 µL/volume from step 3.2.7, laboratory calculation diagram." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq11.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 11"> 
		<img alt="Equation for calculating original paramecia concentration; involves measured values and dilution factor." src="/files/ftp_upload/58949/58949eq12.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 12"> 
		注意： 该计算可得出第3.2.5步中50 mL锥形管内草履虫的浓度。</li>
		<li>计算达到 2 x 10 浓度所需的洗涤后草履虫体积5 每毫升草履虫数在3 mL E3培养基的终体积中。 
		注意： 可根据所需的细菌剂量调整草履虫的浓度，该浓度需进一步优化。</li>
		<li>用三卡因（tricaine）加入100 mM Tris（pH 8.0）中，配制成终浓度为100 mg/L的溶液，将斑马鱼麻醉。将10条斑马鱼转移至6孔板的每个孔中，每孔总体积为3 mL含有适当浓度草履虫（按步骤3.3.2计算）的新鲜E3培养液。转移幼鱼时应尽量减少携带的液体量，以确保其在受体孔中恢复麻醉状态。</li>
		<li>在光照条件下，于30 °C昼夜培养箱中孵育2小时，以确保捕食所需的理想光照条件。</li>
		<li>将斑马鱼转移至新的孔中，每次加入含100 mg/L三卡因的新鲜E3培养基3 mL，重复换液至少5次。 
		注意： 切勿在清洗步骤中省略三卡因。在未麻醉状态下转移活动的幼虫会增加动物受损和痛苦的风险。</li>
		<li>可选步骤：将斑马鱼置于黑色壁的6孔板中，用3 mL 1%低熔点琼脂糖包埋，以备成像。低熔点琼脂糖用1×E3溶液配制，并在微波炉中加热至融化。待琼脂糖完全熔化后，加入三卡因（tricaine），使其终浓度为160 mg/mL。在体视显微镜下，使用剪切过的凝胶上样枪头将斑马鱼调整至头部朝左、尾部朝右的位置（图3等待5分钟使琼脂糖凝固，然后在包埋的斑马鱼上覆盖含160 mg/mL三卡因的1× E3溶液，用于成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定捕食率。 
	注意： 无需单独设置实验来确定捕食率，而可在3.3.4步骤期间按以下所述进行。
	<ol>
		<li>在步骤 3.3.4 中，使用体视显微镜观察捕食中的斑马鱼，并录制其捕食行为的视频。</li>
		<li>对视频录像进行评分。斑马鱼向猎物发起攻击是捕食行为的特征。每次攻击计为一次捕食事件，尽管这仅为近似值（参见 讨论).</li>
		<li>根据多个视频片段计算每小时平均捕食事件次数，每个视频片段代表一条不同的斑马鱼幼鱼（图2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+prey+capture+in+larval+zebrafish+is+controlled+by+identified+reticulospinal+neurons+downstream+of+the+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).</li>
<li>Westphal, R. E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+locomotor+maneuvers%2C+and+improving+sensory+capabilities%2C+give+rise+to+the+flexible+homing+strikes+of+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 108(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处描述的基本方案已针对病原体进行优化 E. coli，并已成功应用于其他细菌种类，包括 肠道沙门氏菌 和 霍乱弧菌对于某些通过浸泡感染无法定植斑马鱼肠道的物种，包括某些肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）菌株和一些厌氧菌，可采用本文所述的食源性感染方法成功建立定植。与显微灌胃法相比，食源性感染在技术上难度较低，所需专用设备较少，而显微灌胃法也常用于在幼鱼肠道内建立高负荷的细菌感染。然而，应针对拟使用的细菌种类和菌株优化关键实验参数，例如细菌与草履虫共培养步骤中的细菌和草履虫密度：若草履虫体内的细菌数量较低，可通过提高共培养阶段的细菌密度来改善。某些细菌种类可能对草履虫宿主造成损伤，应通过显微镜检查进行评估。&#160;
本方案中的另一个重要因素是斑马鱼对猎物的捕食。此处描述的捕食率基于一个假设：每次捕食攻击都会导致一条草履虫被摄食。本方案中使用了每条鱼较高密度的草履虫，以确保较高的捕食率。然而，捕食行为依赖于系统中草履虫的密度；在草履虫浓度极低的培养条件下，捕食率可能低至每小时13–15条草履虫21,22。一个局限性在于，捕食率还高度依赖光照条件，在黑暗环境下的捕食率比光照条件下低80%21，因此在设计实验时应充分考虑这一因素。如果需要延长与猎物的接触时间以优化定植效果，则必须考虑通过粪便造成的细菌二次暴露问题。在上述条件——即2小时猎物暴露时间下——这种暴露可以忽略不计，因为细菌在肠道中的通过时间超过1小时，且载体中的细菌浓度远高于粪便中的浓度。然而，若显著延长猎物暴露时间，这一因素可能变得显著。&#160;
本方案中应包含适当的对照，例如用含有非致病性E. coli MG1655的草履虫喂养斑马鱼以观察定植情况。若需比较多种细菌菌株在斑马鱼宿主中的定植能力，则需验证这些菌株在草履虫体内的半衰期是否相近。某些细菌突变（包括影响细胞壁完整性和酸感应的突变）可能会影响其在草履虫体内的稳定性。在此类情况下，必须调整斑马鱼的喂养方案，以校正因剂量差异带来的影响。&#160;
此处所述方案可用于研究细菌定植及其后果，包括如上所述对斑马鱼体内细菌定植进行成像，以及通过组织匀浆测定每条斑马鱼的菌落形成单位（CFU）3，或评估感染相关的发病与死亡情况。理想情况下，为实现细菌可视化，应使用表达荧光蛋白（如mCherry或红色荧光蛋白RFP）的细菌菌株。这将有助于观察细菌种群的生长情况。若细菌菌株不具备遗传操作可行性，或因其他原因无法使用荧光蛋白表达，则可在与四膜虫共培养前，用荧光染料（如FM 4-64FX）对细菌进行染色。采用本方案时，与四膜虫共培养不会降低染料的荧光强度，且染色后的细菌在斑马鱼肠道中清晰可见。然而，若细菌在斑马鱼宿主体内发生显著增殖，染料信号将随时间推移而被稀释。无论采用何种方法，均优先选择红色荧光细菌而非绿色荧光细菌，因为组织自发荧光在绿色通道通常高于红色通道。&#160;
已发现该方案可适用于需氧菌和微需氧菌细菌物种。尽管尚未通过实验验证，但该方案或许也可改造用于孢子和真菌物种的培养。

斑马鱼在形态和功能上与哺乳动物具有保守的特征，包括粒细胞系（例如中性粒细胞）、类似单核细胞/巨噬细胞的细胞、Toll样受体、促炎性细胞因子以及抗菌肽1。斑马鱼的肠道在受精后6天（dpf）已完全发育，并在形态和功能上与哺乳动物胃肠道具有保守性，例如肠道上皮细胞中保守的转录调控机制2。这使得斑马鱼成为研究肠道微生物定植和致病机制的优良模型。已有大量肠道微生物在斑马鱼模型中被研究，包括肠出血性Escherichia coli3、Vibrio cholerae4,5、Salmonella enterica6、斑马鱼微生物群7,8，以及益生菌在肠道免疫中的作用9。斑马鱼模型的一个显著优势是，可在不破坏内源性微生物群的情况下被多种微生物定植，从而允许在混合微生物群落背景下研究微生物行为3,6。目前，大多数斑马鱼胃肠道定植与疾病模型依赖于浸泡法接种微生物，即将斑马鱼置于细菌悬液中孵育一定时间10。然而，该方法难以确定确切的细菌接种剂量，且导致部分微生物（尤其是非致病菌）的定植效率有限。另一种方法是通过口服灌胃将细菌悬液递送至鱼类体内11，但该技术操作难度较高，且仅适用于较年长的幼鱼和成鱼。
本方案描述了单细胞原生动物的使用方法 Paramecium caudatum 作为将微生物经食物递送至斑马鱼幼鱼胃肠道的载体。草履虫易于培养且成本低廉，能够摄食多种微生物，包括藻类、真菌和细菌，并通过纤毛口沟将其内化。12,13,14细菌被内化后，会存在于囊泡中，这些囊泡最终酸化，其内容物在数小时内逐渐降解。15斑马鱼幼鱼在孵化后约3–4天（取决于温度）即可捕食草履虫等天然猎物16，高效地将其摄取。从检测到捕获，猎物捕食过程平均耗时1.2秒。17，且捕获的草履虫在斑马鱼前肠中被迅速消化，从而使内化的活菌释放到肠道中3因此，草履虫可作为一种快速简便的方法，将高剂量且稳定的细菌递送至斑马鱼的胃肠道。所递送的细菌可经改造以表达荧光蛋白（例如本文所述的mCherry），或对于难以进行遗传操作的细菌，可通过预先用荧光染料染色，从而实现在胃肠道内的可视化观察。
本方案描述了通过食源性途径递送肠致病性大肠杆菌的方法 E. coli （肠出血性） E. coli [EHEC] 和黏附侵袭性 E. coli [AIEC]，以及 Salmonella enterica ssp. Typhimurium。两者均为致病性 E. coli 和 S. typhimurium 被传递 通过 粪-口途径18,19，并可被获取 通过 受污染的食物，例如肉类、蔬菜和乳制品。使用 P. caudatum 作为载体， E. coli 和 S. typhimurium 可在与草履虫载体共孵育30–60分钟内成功定植于斑马鱼幼鱼。所达到的细菌载量足以通过组织匀浆平板计数来观察定植情况并测定载量。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Paramecium caudatum&lt;/em&gt;，活体</td><td>Carolina</td><td>131554</td><td>切勿将培养物在低于室温条件下储存</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8154-20ML</td><td>液体，经无菌过滤，适用于细胞培养；溶于0.81%氯化钠和0.06%磷酸氢二钾中</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td>储存于溶剂安全柜中</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;，MG1655</td><td>ATCC</td><td>ATCC 700926</td><td>可用其他任何非致病性&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;菌株替代</td></tr><tr><td>FM 4-64FX 染料</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34653</td><td>分装后冷冻保存</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma</td><td>F8775-4X25ML</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Sigma</td><td>L3397-1KG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma</td><td>87128-25G</td><td>有毒，具刺激性</td></tr><tr><td>三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Sigma</td><td>93595-50ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 低熔点琼脂糖</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板或细胞计数仪</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热振荡培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水生生物饲养设施</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>繁殖用培养缸</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用原生动物paramecium caudatum作为斑马鱼幼虫食源性感染的载体

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

由于其透明性、易于进行遗传操作以及便于饲养等特点，斑马鱼（斑马鱼已成为研究传染病的常用脊椎动物模型。斑马鱼幼鱼会自然捕食单细胞原生动物 Paramecium caudatum本方案描述了以下方法的使用 P. caudatum 作为幼年斑马鱼食源性感染的载体。 P. caudatum 可吞噬多种细菌，且细菌细胞在数小时内仍保持活性。随后，斑马鱼会捕食这些细菌 P. caudatum消化草履虫后，细菌载量在前肠中释放&#160;载体，细菌定植于肠道。本方案详细描述了草履虫的培养、细菌负载、细菌降解程度与剂量的测定，以及通过喂食草履虫感染斑马鱼的方法。该食源性感染方法的优势在于能更真实地模拟人类疾病中的感染途径，与浸泡感染法相比可实现更稳定的定植效果，并可用于研究多种病原体。在斑马鱼模型中进行食源性感染，可用来探究细菌在宿主内的基因表达、宿主与病原体的相互作用，以及病原性的典型特征，包括细菌载量、定位、播散和发病情况。

Paramecium caudatum 可轻易将多种细菌内化至储存液泡中。细胞内细菌密度取决于共培养体系中细菌与草履虫的密度，以及所用的细菌种类。随着时间推移，液泡逐渐酸化，随之发生细菌降解。所有菌株的降解速率均需单独测定。对于致病性E. coli，初始细菌密度为 790 个细菌/paramecium，其降解半衰期约为 2.3 小时（图 1）。
<img alt="随时间变化的CFU下降曲线及微生物学研究中草履虫的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig1.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图1"> 
图1：测定草履虫体内细菌的半衰期。（A）将E. coli与P. caudatum共孵育2小时后，清洗草履虫并转移至不含细菌的培养基中。在指定时间点，通过在选择性琼脂平板上进行梯度稀释涂布，测定存活的E. coli细胞数量。结果以均值±均值标准误（SEM；n = 3）表示。（B）携带内化细菌的草履虫典型图像，包括明场（Bi）、荧光标记细菌（Bii）及通道合并图像（Biii）。比例尺 = 20 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
此外，还研究了斑马鱼的捕食率，即斑马鱼在共孵育过程中摄取载菌草履虫的速率。斑马鱼幼体通常从5 dpf开始捕食并捕捉活体猎物20，但研究发现，当在30 °C条件下培养时，幼体发育加快，从4 dpf起即表现出捕食行为。捕食行为伴随一种特征性的攻击动作20（图2A），而捕食率的测定基于每次攻击会导致一条草履虫被摄入这一假设，尽管该假设仅可视为一种近似估计（见讨论部分）。根据本文所述对捕食性斑马鱼幼体的观察，草履虫的摄取速率约为每小时1,539条（图2B）。
<img alt="时间推移显微镜分析草履虫捕食率；包含猎物动态图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig2.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图 2"> 
图 2：斑马鱼捕食率的测定。 （A）捕食视频中的静态图像，显示一条斑马鱼幼体（5 日龄）捕食携带荧光细菌的草履虫。时间为[秒]。箭头指示攻击过程中的主要运动轴线。 （B）基于 n = 10 段视频（覆盖完整的 2 小时暴露时间）计算的捕食率（每小时摄入草履虫数量）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
在摄入草履虫后，斑马鱼能够高效地在前肠中降解猎物，从而将感染性细菌释放到消化系统中。如本文所述，草履虫的降解过程迅速，捕食开始后30分钟内即可在肠道中检测到游离的细菌。随后，游离细菌从前肠迁移至中肠和后肠，通常在捕食开始后约1–2小时可被检测到（图3）。细菌在肠道中的持续存在时间取决于菌种和剂量，对于E. coli和S. enterica而言，可持续数小时至数天不等。S. enterica主要定位于肠黏膜，并伴有一定程度的上皮细胞侵袭（Figure 3D），进而引发中性粒细胞浸润至上皮组织（图3C）。
<img alt="显示细胞中DNA、F-肌动蛋白与沙门氏菌相互作用的荧光显微镜图像；图示A-D。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58949/58949fig3.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图3"> 
图3：斑马鱼的细菌定植。 5日龄斑马鱼未感染（A）或定植表达mCherry的（B）E. coli 或（C）S. enterica。感染实验可在野生型（A 和 B）斑马鱼或转基因品系（例如Tg(MPO::EGFP)i114，其表达绿色荧光中性粒细胞，如图（C）所示）中进行。直肠开口由箭头标示。（D）经全胚包埋后感染Salmonella enterica的幼鱼肠道切片的高倍放大图像。（Di）蓝色 = 标记细胞核的Hoechst染料，（Dii）紫色 = 标记F-肌动蛋白的鬼笔环肽，（Diii）红色 = 沙门氏菌，（Div）合并图像。比例尺 = 5 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/58949fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像、细胞结构、光发射分析、红色荧光染色。" src="/files/ftp_upload/58949/58949mov1.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Movie 1"> 
视频 1：捕食过程的视频影像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58949/PreyCapture.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

斑马鱼（Danio rerio）正成为研究微生物定植与致病机制的常用脊椎动物模型。本实验方案描述了利用纤毛原生动物尾草履虫（Paramecium caudatum）作为载体，建立斑马鱼幼鱼食源性感染的方法。P. caudatum 可高效摄取细菌，并通过斑马鱼幼鱼的自然捕食行为被摄入体内。

利用原生动物Paramecium caudatum作为斑马鱼幼虫食源性感染的载体

由于其透明性、遗传可操作性强以及易于饲养，斑马鱼（Danio rerio）已成为广泛使用的脊椎动物模型，用于……

该方法有助于解答微生物学领域中关于微生物在胃肠道内定植与感染动态的关键问题。该技术的主要优势在于，与口服灌胃法相比，它更能代表人类食源性感染的情况，并且可减少鱼类潜在的组织损伤。由于草履虫具有高度运动性，该方法的洗涤步骤操作难度较大，因此对该方法进行可视化演示至关重要。从正在生长的活体培养物中，取一毫升草履虫培养物和一毫升大肠杆菌 MG1655（e-coli MG1655）培养物，加入含有八毫升 E3 培养基的十毫升组织培养瓶中。轻轻摇匀后，置于 22°C 培养。每两周将共培养物一毫升传代至新的含有九毫升新鲜 E3 培养基的十毫升组织培养瓶中，并补充浓度为每毫升 108 个菌落形成单位的大肠杆菌 MG1655。为测定草履虫体内细菌的半衰期，需从光密度为 600 的草履虫-细菌共培养物中计数草履虫数量，并每隔一小时取 50 微升上清液，加入新的 1.5 毫升微量离心管中，持续六小时。向各管中加入950微升含1%非离子型表面活性剂的PBS溶液。通过涡旋振荡1分钟裂解各样品中的草履虫，然后用无菌PBS对各样品进行10倍稀释。取每种稀释液100微升接种于选择性培养板上，在37°C条件下培养16小时。第二天，仅计数分离且界限清晰的单个菌落，以确定平板上的细菌菌落数量。并选择一个稀释度合适、菌落数在30-300个之间的平板。在感染前一天，通过离心收集每种处理条件下等体积、光密度为600的培养物中的细菌。将沉淀物重新悬浮于每管1毫升E3培养基中。接着，向每种细菌悬液中加入1 µL适当的细菌染色剂。用铝箔包裹试管以防止光漂白。在室温下将细菌样品进行15分钟的端对端旋转孵育之前，孵育结束后，用大量E3培养基将细菌洗涤两次，以去除多余的染料，并将菌体沉淀重悬于每管1毫升新鲜E3培养基中。然后，每种条件下，向两份新鲜草履虫的锥形瓶中各加入1毫升细菌悬液，在室温下孵育2小时。将每种条件下两个锥形瓶中的内容物转移至各自的50毫升离心管中，并通过离心收集样品沉淀。使用无菌移液管，通过离心法进行3次洗涤，每次用10毫升新鲜E3培养基替换每根试管中约10毫升的E3上清液。最后一次洗涤后，小心移除约10毫升E3上清液，注意不要扰动沉淀，然后将沉淀重悬于剩余的10毫升E3培养基中。将每种悬液各500微升转移至各自的1.5毫升微量离心管中，并通过离心沉淀四膜虫。弃去上清液 400 微升，向剩余的 100 微升草履虫悬液中加入 20 微升 36.5% 的甲醛溶液，轻轻吹打混匀。室温放置 5 分钟后，用移液器测量每管的实际总体积，再计数每毫升中死亡草履虫的数量。对于通过食物传播的斑马鱼感染实验，将草履虫样品稀释至每毫升 E3 培养基含 2 × 10⁵ 个草履虫的浓度。每种草履虫培养物取3毫升，按不同条件分别加入6孔板的每个孔中。接着，将十条麻醉后的斑马鱼转移至各孔，液体体积保持最小。然后，在30摄氏度的昼夜循环培养箱中，于光照条件下共培养两小时。为了确定捕食率，在体视显微镜下观察摄食中的斑马鱼，同时记录其捕食行为的视频。斑马鱼向猎物发起攻击被视为一次捕食事件。每次攻击被估算为一次猎物捕获事件。孵育结束后，将斑马鱼在5个不同的孔中进行清洗，每孔加入3毫升新鲜E3培养基，并补充100毫克/升的三卡因。然后将每条斑马鱼包埋于黑色底六孔板的3毫升1%低熔点琼脂糖中。当所有鱼均包埋完成后，将六孔板置于体视显微镜下，使用剪去尖端的加样枪头调整位置，确保每个视野中斑马鱼的头部位于左侧，尾部位于右侧。等待琼脂糖凝固5分钟，然后用添加了三卡因的新鲜E3培养基覆盖包埋的斑马鱼，并在荧光显微镜下对斑马鱼进行成像，以评估细菌感染的进展情况。对于致病性大肠杆菌，每个草履虫中的初始细菌密度为每只草履虫790个细菌，细菌在每个草履虫切片的液泡内被降解，半衰期约为2.3小时。捕食行为伴随着一种特征性的攻击动作，捕食率的确定基于每次攻击会导致1个草履虫被内化这一假设。消化后，游离细菌从前肠移至中肠和后肠，通常在开始捕食后约1至2小时可检测到。例如，鼠伤寒沙门菌主要定位于肠黏膜，并伴有部分上皮细胞侵袭，导致中性粒细胞浸润至肠上皮。请注意，操作某些类型的细菌可能具有极高危险性，在进行该实验操作时，务必采取适当个人防护装备等安全措施。

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