通过双荧光染料流式细胞术区分七种免疫细胞亚群

该方法的总体目标是突破大多数流式细胞仪的光学限制，使研究人员能够额外记录五个标记物，以分析复杂的细胞群体。利用此技术，在使用检测器数量较少的仪器或细胞数量有限的样本时，仍可实现深入的免疫表型分析。开始操作前，先将采集的血液小心转移至一个50毫升的锥形管中。

将血液与等体积的不含钙和镁的磷酸盐缓冲液混合稀释。在新的50毫升锥形管底部加入15毫升密度梯度介质。小心地将稀释后的血液叠加在密度梯度介质上方，避免密度梯度介质与稀释血液之间发生混合。

在室温下以400 × g离心30分钟，不使用刹车，以避免破坏界面。离心后，使用移液器小心吸除并弃去上层液体，注意不要吸走血浆与密度梯度介质之间的界面处的细胞。从界面处尽可能收集外周血单个核细胞（PBMCs），避免触碰50毫升锥形管底部的红细胞沉淀，然后转移至新管中。

加入 PBS 至终体积为 25 毫升，反复倒置数次以混匀。然后，按照文中所述方法将 PBMC 洗涤两次。按照文中所述方法去除血小板并计数 PBMC 后，用含 0.1% 叠氮化钠的 PBS 重悬细胞，细胞浓度为每毫升 1 × 10⁷ 个细胞。

为进行染色，将每个样本的100微升转移至96孔V型底板中。在室温下以350 × g离心3分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。

向每个孔中加入 100 微升含有活/死可固定染料的 PBS，该染料可与蛋白质上的游离胺基发生反应，并小心重悬 PBMC 混合物。随后，将培养板在室温下静置 10 分钟，以标记死细胞。针对每个样本，准备含有全部七种抗体的 30 微升混合液。

在此阶段，也可加入针对不同靶分子、标记不同荧光染料的滴定抗体。将96孔板在室温下以350 × g离心3分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。向每孔加入抗体混合液，并轻轻重悬细胞，避免产生气泡。

在室温避光条件下孵育30分钟。30分钟后，向每孔加入150微升染色缓冲液，在室温下以350 × g离心3分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于200微升PBS中。

细胞现已准备好进行流式细胞术分析。使用最大染色指数曲线对抗CD3、CD8、CD14、CD19和TCR γδ抗体进行滴定。在本方案中，抗体滴定是识别七种免疫细胞亚群最为关键的步骤，该过程使用两种荧光染料。

为制备两倍稀释的抗体溶液，向96孔板的10个孔中每孔加入40微升染色缓冲液。在本视频中，仅展示抗CD8抗体的滴定过程。在第一孔中，将染色缓冲液的终体积增加至80微升，并加入浓度为厂家推荐浓度四倍的抗CD8抗体。

充分混匀后，取40 µL转移至第二孔。充分混匀，并对所有其他孔重复此步骤。按照先前演示的方案，使用10种不同的两倍稀释浓度的抗CD8抗体各30 µL，对10份PBMC或全血样本进行染色。

使用流式细胞仪获取数据，并绘制每个稀释度的信号。根据文中所述方法计算每个抗体浓度的染色指数后，绘制染色指数相对于抗体稀释倍数的分数形式的曲线，确定具有最大染色指数值的抗体浓度。为滴定抗-CD4和抗-CD56抗体，可从之前展示的两倍稀释策略开始，再在其中增加若干中间浓度，以精细确定能够实现CD4阳性T细胞和NK细胞与其他细胞群有效分离的抗体浓度范围。

通过将抗CD4抗体信号置于双CD8阳性、CD3阳性信号与CD3单阳性细胞群之间，对抗CD4抗体进行滴定。参照抗CD4抗体滴定的类似策略，将NK细胞置于CD3阴性和CD3阳性细胞群之间，对抗CD56抗体进行滴定。开始这种双荧光染料、七标记门控策略时，选择淋巴细胞门，并使用本方案中的两种荧光染料之一分别作为每个坐标轴，创建点图。

在散点图右上角圈选CD8阳性T细胞，即CD3和CD8双阳性细胞。排除CD8弱表达的细胞群，因其可能包含NKT细胞。CD4阳性T细胞位于CD8阳性T细胞与CD3单阳性细胞群之间，据此圈选该细胞群。

以高表达CD3的细胞圈定γδ T细胞，并进一步将γδ T细胞划分为CD8阳性和CD8阴性亚群。以位于CD3阳性与CD3阴性细胞群之间的细胞群体圈定NK细胞。

将NK细胞分为CD8阳性与CD8阴性。在散点图右下角圈选CD3阴性、CD19阳性的细胞群体以确定B细胞门。选择单核细胞门，并使用本方案中所用的两种荧光染料之一分别在每个轴上创建散点图。

对CD3阴性、CD14阳性细胞群设门。采用此策略，根据前向散射和侧向散射特征及流式细胞术图谱，对多发性骨髓瘤患者的淋巴细胞进行设门。通过CD45RA和CCR7的表达情况鉴定CD8阳性记忆亚群和初始T细胞。

通过检测HLA-DR和CD57的表达，研究CD8阳性初始T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞以及CD45RA阳性效应记忆T细胞中的T细胞活化状态。类似地，鉴定出CD4阳性初始T细胞和记忆T细胞。在记忆T细胞群体中，利用CCR4和CCR6鉴定CD4阳性T细胞中的辅助性T细胞亚群。

通过CD16和CD57的表达特征鉴定NK细胞的不同亚群。该策略用于研究一名接受干细胞移植的多发性骨髓瘤患者纵向样本中免疫细胞群的动态变化。随时间对CD8和CD4亚群进行表征显示，CD4阳性与CD8阳性T细胞持续活化，并且辅助性T细胞向Th1型表型偏移。

但在第60天，B细胞的比例显著增加，预示着患者病情复发。正确的细胞制备和抗体滴定是采用该技术获得可靠结果的关键步骤。可添加针对其他标志物的抗体，以实现更深入的流式细胞术分析，并构建可同时靶向多个细胞系的模块化流式细胞术检测 panel。

旨在增加可记录标记物数量的类似方法也可利用不同的标记物组合或用于不同的动物模型进行开发。切记叠氮化钠可导致皮肤和眼睛灼伤，因此在操作该试剂时应始终穿戴实验服、防护眼镜和手套。