Name: 双氟铬流式细胞仪对七种免疫细胞子集的判别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学习使用双荧光流式细胞术识别人外周血中的七种免疫细胞亚群，包括CD4+和CD8+T细胞、γδT细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。该方法可记录五种额外标志物，实现深度免疫表型分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所资助，&#60;https://www.niams.nih.gov/&#62;，资助编号 P30-AR053503；Stabler 基金会，&#160;www.stablerfoundation.org；美国过敏与传染病研究所，www.niaid.nih.gov，T32AI007247；Nina Ireland 肺健康项目（NIPLH），https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/。

所有涉及人体材料的研究均经约翰斯·霍普金斯机构审查委员会根据《健康保险可携性和责任法案》批准。患者和对照样本均已去标识化。健康对照者的外周血单个核细胞（PBMCs）和血液均在知情同意后获取。
注意：本方案已在外周血细胞（新鲜或冻存分离）及全血中进行过测试。
1. 细胞准备
<ol>
	<li>从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）
	<ol>
		<li>使用含肝素钠的10 mL绿色盖帽试管采集血液。采血完成后，立即轻轻倒置试管数次，以防止血液凝固。 
		注意： 使用其他抗凝剂（如乙二胺四乙酸（EDTA）或枸橼酸钠）的试管也可获得类似效果。若采集的血量不同，后续操作步骤应相应按比例调整。</li>
		<li>小心将采集的血液转移至50 mL锥形离心管中。加入等体积不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释血液。</li>
		<li>在新的50 mL锥形离心管底部加入15 mL密度梯度介质（例如Ficoll），然后小心地将稀释后的血液叠加在密度梯度介质上方，避免密度梯度介质与稀释血液混合。 
		注意： 此步骤是实现PBMC与红细胞有效分离的关键。</li>
		<li>在室温（RT）下以400 ×g离心30分钟，离心时不要使用刹车，以免破坏界面层。</li>
		<li>离心后，用移液器小心吸去上层液体并弃去，注意不要吸走位于血浆与密度梯度介质界面处的细胞，PBMC即位于此界面。尽可能多地收集界面处的细胞，避免触碰50 mL锥形管底部的红细胞沉淀，将收集的细胞转移至新的50 mL锥形管中。</li>
		<li>加入PBS至终体积为25 mL，轻轻倒置数次混匀。在室温下以300 ×g离心10分钟（开启刹车），以去除细胞悬液中残留的密度梯度介质。</li>
		<li>小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。加入PBS至终体积为25 mL，轻轻倒置数次混匀。在室温下以200 ×g离心10分钟（开启刹车），以去除血小板。</li>
		<li>小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。将PBMC重悬于1 mL PBS/0.1%叠氮化钠中。叠氮化钠可减少抗体的帽化、脱落和内化，并提高细胞回收率，但其毒性可能影响细胞活力。因此，若细胞需用于后续培养实验，所有步骤中均应避免使用叠氮化钠。在不使用叠氮化钠的情况下进行细胞分离和染色，结果与使用叠氮化钠时相似。 
		&#8203;警告： 叠氮化钠可通过影响中枢神经系统导致死亡。接触可能引起皮肤和眼睛灼伤。</li>
		<li>取30 µL PBMC转移至1.5 mL微量离心管中用于细胞计数。然后加入120 µL PBS和150 µL台盼蓝，以确定细胞数量和活力（细胞稀释倍数为1:10）。轻轻重悬细胞。</li>
		<li>取10 µL样品加入血细胞计数板，根据所用计数室的规格计数细胞，并计算活细胞数量。活细胞数 = 台盼蓝阴性细胞总数 × 10（本方案使用的稀释倍数）× 104。 
		注意： 通常情况下，从10 mL血液中可获得7–15 × 106个PBMC。</li>
		<li>将细胞重悬于PBS/0.1%叠氮化钠中，浓度为每毫升含10 × 106个细胞。 
		注意： PBMC可冷冻后长期保存于液氮中。然而，此过程可能改变某些标志物（如趋化因子受体）的表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从冻存PBMC中制备细胞 
	注意： 不同的冻存方法可能影响细胞回收率和活力12。本实验所用PBMC采用特制冻存液或含10%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）冻存，结果相似。 
	&#8203;警告： DMSO在吸入（对肺部有刺激性）、皮肤接触（刺激性、渗透增强剂）、眼睛接触（刺激性）或摄入时可能具有轻微危害性。
	<ol>
		<li>从液氮中取出冻存的PBMC，置于冰上。将冻存管直接从冰上转移至37 °C水浴中。保持冻存管位于水面附近，轻轻摇动直至仅剩少量冰粒。再将冻存管放回冰上。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒擦拭去除管外水分。缓慢加入1 mL 4 °C的PBS/0.1%叠氮化钠，并小心将细胞转移至15 mL锥形离心管中。缓慢加入4 °C的冷PBS/0.1%叠氮化钠，使终体积达到15 mL。</li>
		<li>以300 ×g离心10分钟。小心吸去上清液，将细胞重悬于1 mL PBS/0.1%叠氮化钠中。 
		注意： 细胞也可重悬于含10% FBS的RPMI培养基中，结果相似。</li>
		<li>取30 µL PBMC转移至1.5 mL微量离心管中用于细胞计数。然后加入120 µL PBS和150 µL台盼蓝，以确定细胞数量和活力（细胞稀释倍数为1:10）。轻轻重悬细胞。</li>
		<li>取10 µL样品加入血细胞计数板，根据所用计数室的规格计数细胞，并计算活细胞数量。活细胞数 = 台盼蓝阴性细胞总数 × 10（本方案使用的稀释倍数）× 104。</li>
		<li>将细胞重悬于PBS/0.1%叠氮化钠中，浓度为每毫升含10 × 106个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从全血中制备细胞
	<ol>
		<li>使用含肝素钠的10 mL绿色盖帽试管采集血液。采血完成后，立即轻轻倒置试管数次，以防止血液凝固。 
		注意： 使用其他抗凝剂（如EDTA或枸橼酸钠）的试管也可获得类似效果。若采集的血量不同，后续操作步骤应相应按比例调整。</li>
		<li>将200 µL全血转移至12 mm × 75 mm带盖试管中，加入2 µL叠氮化钠，轻轻涡旋混匀2秒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞染色
注意：选择几乎没有光谱重叠的荧光染料组合对于减少一种荧光染料信号在另一荧光检测通道中的溢出（spillover）导致的数据扩散至关重要。为了实现对所有细胞亚群的最佳鉴定，应选用量子产率高的荧光染料，例如抗体组合 PE-BV421 和 PE-APC。
<ol>
	<li>新鲜与冷冻PBMC的染色
	<ol>
		<li>转移100 µL PBMC（1 × 10⁶细胞）至96孔圆底培养板中6 细胞）加入至96孔V型底板中。 
		注意： 低于 1 x 10 的任意细胞数量6 可产生类似结果2.</li>
		<li>350 x g 离心 g 室温孵育3分钟，小心吸除上清液，勿扰动细胞沉淀。每孔加入100 µL含可固定活/死细胞染料的PBS，该染料可与蛋白质上的游离胺基反应，孵育10分钟以标记死细胞。</li>
		<li>为每个样本准备 30 µL 抗体混合液（包含所有抗体：fluorchrome A 中为抗-CD3、-CD56、TCRγδ，fluorchrome B 中为抗-CD4、CD8、CD19、CD14）。抗体浓度见下文说明。 表1 和 表2在此阶段，也可加入针对不同靶分子且标记不同荧光染料的滴定抗体（例如， 表3). 
		注意： 抗体浓度可能因生产商和批号不同而有所差异，因此应进行预实验以获得最佳信号。使用 PBS、PBS/0.5% BSA、PBS/0.2% 叠氮化钠或 PBS/0.5% BSA/0.1% 叠氮化钠稀释抗体均可获得相似的结果2细胞也可在不同于30 µL的体积中进行染色，以便轻松将本方法整合到已有的染色方案中。</li>
		<li>350 x g 离心 g 室温孵育3分钟，小心吸除上清液，勿扰动细胞沉淀。向每孔加入抗体混合液，轻轻重悬细胞，避免产生气泡。室温避光孵育30分钟。 
		注意： 样品可在 4 °C 下进行染色，结果相似。</li>
		<li>加入150 µL染色缓冲液，以350 x g离心 g 在室温下离心3分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞重悬于200 µL PBS中，并在流式细胞仪上获取数据。若染色体积发生改变，请确保至少将原始抗体混合物稀释20倍，以充分洗涤去除过量抗体。 
		注意： 染色后的细胞可用 PBS/2% 多聚甲醛固定，于 4 °C 冰箱中保存过夜，次日上流式细胞仪检测。 
		注意： 多聚甲醛如吞食有害，可引起皮肤刺激</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全血染色
	<ol>
		<li>向每个12 mm × 75 mm带盖试管中加入抗体混合物（荧光染料A标记的抗-CD3、-CD56、TCRγδ抗体，以及荧光染料B标记的抗-CD4、CD8、CD19、CD14抗体），避光，室温孵育30分钟。抗体浓度见下文说明。 表 4此时，可加入针对不同靶分子、标记不同荧光染料的滴定抗体。抗体浓度可能因生产商和批号而异，因此应进行预实验以确定最佳信号强度。 
		注意： 可在 4 °C 下对样品进行染色，结果相似。</li>
		<li>350 x 离心 g 在室温下孵育3分钟，小心吸走上清液，避免扰动细胞沉淀。按照生产商说明书配制红细胞裂解缓冲液的1倍工作液。 
		注意： 裂解液使用前应置于室温。</li>
		<li>向每管中加入 2.0 mL 1× 红细胞裂解缓冲液，盖紧管盖并反复倒置数次以混匀。用铝箔包裹，静置 15 分钟。</li>
		<li>300 × g 离心 g 5 分钟后，小心吸走上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
		<li>加入 2 mL PBS，以 300 x g 5分钟。 
		注意：此时细胞沉淀应呈淡白色，表明红细胞裂解成功。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并将细胞轻轻重悬于 200 µL PBS 中。</li>
		<li>通过带有40 µm滤帽的12 mm x 75 mm试管过滤细胞，以去除细胞聚集体，并在流式细胞仪上获取数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 抗体滴定
注意：抗体滴定是获得高质量、可重复数据最关键的步骤。抗CD3、-CD8、-CD14、-CD19和-TCR γδ抗体的滴定遵循标准流程，通过最大染色指数确定能够最佳分离阳性与阴性峰的抗体浓度13,14。应选择染色指数曲线上升阶段接近峰值或处于峰值的稀释比例（图1A-C）。抗CD4抗体的滴定应使CD4阳性群体的峰值位于CD3单阳性群体与CD3+/CD8+ T细胞之间，更靠近CD3单阳性信号，以便更好地区分CD8dim亚群（CD8+ γδ T细胞和NK T细胞）。同理，CD56抗体的滴定目标是将NK细胞中CD56+细胞的位置调整至CD3+与CD3-群体之间。
<ol>
	<li>最大染色指数曲线 
	注意： 抗CD3、-CD8、-CD14、-CD19和-TCR γδ的滴定遵循标准流程，通过最大染色指数曲线确定抗体浓度，以实现阳性与阴性峰的最佳分离15如果向检测组合中添加针对其他标志物的抗体，也需要通过最大染色指数曲线进行滴定。
	<ol>
		<li>在96孔板中，用40 µL染色缓冲液填充10个孔，以制备2倍抗体稀释液。在第一孔中，将最终体积增加至80 µL染色缓冲液，并加入目的抗体，其浓度为制造商建议浓度的4倍。</li>
		<li>充分混匀后，取40 µL转移至第二孔。充分混匀，并对所有其他孔重复此步骤。</li>
		<li>按照前述方案，使用30 µL 10种不同的抗体2倍系列稀释液分别对10份PBMC或全血样本进行染色。</li>
		<li>使用流式细胞仪获取数据，并绘制每种稀释度的信号图（图1A).</li>
		<li>对每种抗体浓度的阴性和阳性细胞群进行设门。抗体浓度的增加可能导致背景信号升高，因此应相应调整阴性门的范围。</li>
		<li>对于每种抗体浓度，提取阴性群体荧光强度的中位数和标准差，以及阳性群体荧光强度的中位数。使用以下公式计算每种抗体浓度的染色指数：（阳性群体荧光强度的中位数 - 阴性群体荧光强度的中位数）÷（2 × 阴性群体荧光强度的标准差）图1B).</li>
		<li>绘制染色指数与. 以抗体稀释倍数的分数形式表示抗体浓度（例如，1:10 稀释 = 0.1），并确定具有最大染色指数值的抗体浓度图1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗CD4和抗CD56抗体滴定 
	注意： 抗CD4和抗CD56抗体的滴定依赖于双荧光染料组合中其他标志物的先前滴定结果。对于抗CD4抗体，滴定的目的是将抗CD4信号定位在双阳性CD8+/CD3+ 信号以及 CD3 单阳性细胞群（图1D).
	<ol>
		<li>采用2倍稀释法对抗CD4和CD56抗体进行滴定，如前所述，并在中间增加额外浓度，以精确确定能够区分CD4+&#160;T细胞和NK细胞与其他细胞群体。</li>
		<li>将抗CD4抗体进行滴定，使抗CD4信号位于双CD8之间+/CD3+ 信号以及 CD3 单阳性细胞群（图1D). 
		注意： 应特别注意将 CD4 清晰分离+ CD8 T细胞+ 微弱的群体。</li>
		<li>参照抗CD4抗体的滴定策略，通过将NK细胞置于CD3阴性与CD3阳性细胞群之间，对抗CD56抗体进行滴定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 门控策略
<ol>
	<li>鉴定淋巴细胞和单核细胞群体，并从分析中去除死细胞及大部分残留的红细胞。
	<ol>
		<li>根据前向散射光选择包含淋巴细胞和单核细胞的整个群体 与 侧向散射面积（FSC-A vs SSC-A）。通过前向散射高度 vs 前向散射宽度（FSC-H vs FSC-W）和侧向散射高度 vs 侧向散射宽度（SSC-H vs SSC-W）排除细胞聚集体对分析的干扰。</li>
		<li>使用活/死细胞鉴别标记以排除明亮的阳性死细胞和残留的红细胞。根据不同的FSC-A和SSC-A特征对淋巴细胞和单核细胞进行设门。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>淋巴细胞群体的双荧光染料七标记门控策略 
	注意： 在 CD3 阳性亚群中，CD4+，CD8+ 并且可以使用仅靶向CD4、CD8和γδ受体的抗体来分离γδ T细胞。类似地，在CD3阴性亚群中，可分别利用抗CD19、CD56和CD14抗体唯一鉴定B细胞、NK细胞和单核细胞。
	<ol>
		<li>选择淋巴细胞门，并创建点图，每个轴分别对应本实验方案中使用的两种荧光染料之一图2B).</li>
		<li>CD8门控+ 被鉴定为CD3的T细胞+/CD8+ 点图右上角的双阳性细胞（图2B）。排除可能含有NKT细胞的CD8弱表达群体。圈选CD4+ 位于CD8之间的T细胞群体+ T细胞和CD3单阳性群体。圈选高表达CD3的γδ T细胞。将γδ T细胞进一步分为CD8阳性和CD8阴性亚群。</li>
		<li>NK细胞门控确定为位于CD3阳性与CD3阴性细胞之间的细胞群。将NK细胞进一步划分为CD8阳性与CD8阴性亚群。B细胞门控确定为CD3阴性CD19阳性细胞群+ 点图右下角的细胞群。</li>
		<li>选择单核细胞门控，并创建点图，每个轴分别使用本实验方案中的两种荧光染料之一图2C。对CD3设门-/CD14+ 群体</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%27s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li>
<li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li>
<li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZola%2C+H+%22Leukocyte+and+Stromal+Cell+Molecules%3A+The+CD+Markers%22">Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers</a>. , Wiley. (2007).</li>
<li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li>
<li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes%3A+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li>
<li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li>
<li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source%3A+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li>
<li>Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-023%3A+10-Color%2C+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li>
<li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal%2C+reactive+and+malignant+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li>
<li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-intensity+multiplexing%3A+Simultaneous+seven-marker%2C+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li>
<li>Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li>
<li>Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440(2017).</li>
<li>Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoederer%2C+MK+%22Handbook+of+Experimental+Immunology%22">Handbook of Experimental Immunology</a>. 49, Blackwell Science. (1997).</li>
<li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li>
<li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li>
<li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li>
<li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-017%3A+Human+CD4%2B+helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li>
<li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+%28Th1s%29+and+Th2s%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li>
<li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li>
<li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+%28Th%291%2C+Pre-Th2%2C+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4%2B+Central+Memory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li>
<li>Ye, Z. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710(2012).</li>
<li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD8%2B+T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li>
<li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li>
<li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li>
<li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57%2BCD4%2B+T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li>
<li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD57%2B+T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所展示的方案具有较高的灵活性，且对染色缓冲液、温度以及外周血细胞制备方法的改变不敏感，这主要归因于细胞表面谱系标记物的高表达水平。获得高质量、可重复数据最关键的步骤是抗体滴定。值得注意的是，由于抗体滴定应在流式细胞分析 panel 建立时常规进行，因此该步骤不会为本研究采用的双荧光染料方法额外增加实验操作时间。抗 CD3、CD8、CD14、CD19 和 TCR γδ 抗体的滴定遵循标准操作流程，即通过最大染色指数确定能够最佳区分阳性与阴性峰的抗体浓度。13,14应选择染色指数曲线上接近峰值或上升支靠近峰值处的稀释度（图1A- C）。另一方面，需要对抗-CD4和抗-CD56抗体进行临时滴定。抗-CD4抗体的滴定应使CD4阳性细胞群的峰值位于CD3单阳性细胞群和CD3+/CD8+ T细胞更接近CD3单阳性信号，以更好地区分CD8暗淡 群体（CD8+</s...

流式细胞术是一种用于在每秒数千个事件的速率下对单个颗粒的多个参数进行分析的技术1。通过流式细胞术分析的样本包括但不限于细胞、微球、细菌、囊泡和染色体。流体系统将颗粒引导至检测点，在该位置每个颗粒依次与一个或多个激光束相交，同时记录多个参数以供进一步分析。前向散射光和侧向散射光由激光束的散射产生，分别用于识别目标群体并获取颗粒相对大小及其内部复杂性/颗粒度的信息。流式细胞术分析中的其他所有参数——构成了该分析中大部分数据——均来源于荧光染料标记的探针，这些探针可识别并结合到目标颗粒上的特定靶标。
流式细胞术是免疫学研究中用于鉴定和表征细胞群体的主要工具。为了剖析免疫系统的复杂性，多色检测方案不断优化，以增加可同时检测的标志物数量，从而实现对细胞群体的深度免疫表型分析1。这推动了功能更强大的仪器和荧光染料的开发，近年来高端流式细胞仪的荧光参数已超过20个。由于荧光染料的光谱重叠，这导致实验设计更加复杂，并且与定制抗体标记及熟练操作人员相关的成本也更高。在某些情况下，可通过为不同细胞群使用独立的标记物组合面板来降低复杂性和成本。然而，这种方法容易出错，会减少每个面板中的信息量，并且在细胞数量有限的样本中应用时可能较为困难。此外，增加标记物数量使得在荧光参数较少的仪器上难以进行深入的免疫表型分析。我们此前开发了一种染色方案，用于鉴定主要的人类免疫细胞群体（CD4+ 和 CD8+ T细胞、γδ T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞）在外周血单个核细胞（PBMCs）中的检测，通过结合七种谱系标记物，仅使用两种荧光染料，而非传统方法所需的七种荧光染料 &#34;一种荧光染料对应一种标记物&#34; 方法（www.hcdm.org）2,3.&#160;我们最初的研究探索并验证了使用两种荧光染料联合标记七种标志物进行深度免疫表型分析的可行性。在本报告中，我们提供了一步一步的操作流程，用于分离和染色外周血细胞，重点介绍实际操作要点及染色过程中常见问题的解决方案，以确保染色成功。&#160;
本实验方案基于以下观察结果：谱系标记物在细胞表面具有恒定的表达水平，且每种细胞群体都具有独特的谱系标记物组合。在外周血单个核细胞（PBMCs）中，CD3的表达将免疫细胞分为两大类：CD3阳性的T淋巴细胞和CD3阴性细胞。在CD3阳性亚群中，可通过分别靶向CD4、CD8和γδ受体的抗体区分CD4+、CD8+和γδ T细胞。类似地，在CD3阴性亚群中，可分别利用抗CD19、抗CD56和抗CD14抗体唯一地鉴定B细胞、NK细胞和单核细胞。在传统的单荧光染料标记单个目标分子的方法中，抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD14、抗CD19、抗CD56以及抗TCR γδ抗体需使用七种不同的荧光染料进行检测。我们的方法则将抗CD3、抗CD56和抗TCR γδ抗体组合使用同一种荧光染料（为方便起见标记为荧光染料A），而将抗CD4、抗CD8、抗CD14和抗CD19抗体组合使用另一种荧光染料（荧光染料B）。该策略的实现依赖于抗体滴定与抗原表达水平差异的结合。在荧光染料A中，CD4+和CD8+ T细胞均表现为抗CD3抗体阳性，但可在荧光染料B中通过最大化CD8信号的表达，并通过特异性滴定使CD4信号位于CD8阳性细胞与CD3阳性但CD4/CD8双阴性细胞之间，从而实现两者的分离。γδ T细胞的CD3表达水平高于CD4和CD8 T细胞，因此可被识别为CD3高表达4。通过在荧光染料A中使用抗TCR γδ抗体对γδ T细胞进行标记，可进一步增强该信号，从而改善CD3低表达T细胞与CD3高表达γδ T细胞之间的分辨。B细胞可在荧光染料A中表现为CD3-，在荧光染料B中表现为CD19+。为将CD3阴性的NK细胞与B细胞区分开，在荧光染料A中使用抗CD56抗体，其作用方式类似于抗CD3抗体。该方法可行的原因在于NK细胞表面CD56的表达水平远低于T细胞表面CD3的表达水平5。最后，单核细胞可通过前向散射与侧向散射的光信号特征结合在荧光染料B中CD14的表达情况进行鉴定。
利用两种荧光染料组合多达四种标记物的想法此前已有成功先例6,7,8，并已被应用于临床方案中以鉴定恶性淋巴细胞群体9。先前有研究也使用两种荧光染料组合了七种标记物（其标记物特异性与本研究方案中所用的不同），但该方法依赖于对每种抗体进行复杂标记，即使用不同数量的荧光染料10。相比之下，我们的方法采用市售抗体，可适配不同仪器配置，并能充分利用新一代聚合物荧光染料的优势。
该方法学的总体目标是拓展大多数流式细胞仪的光学检测能力，从而额外记录五个标记物，以研究复杂的细胞群体。因此，仅配备6-10种荧光染料的经济型流式细胞仪即可进行高级免疫学分析，而仅配备2-3种荧光染料的现场检测设备也可在资源有限的地区取得显著成果。高端仪器同样可从该方法中获益，通过使用额外的荧光染料实现更深入的流式细胞术分析，并构建可同时靶向多个细胞谱系的模块化流式细胞术检测 panel11。这种方法有望减少模块化免疫表型流式细胞术中所需的检测 panel 数量，从而降低实验成本、减少错误及操作时间。此外，该方法特别适用于细胞数量有限的临床样本。

<table><tbody><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>562426</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_11152082</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>562751</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_2732054</td></tr><tr><td>TCRgd</td><td>BD Biosciences</td><td>331217</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_2562316</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555347</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_395752</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555367</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_395770</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_395799</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_395813</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>555335</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_398591</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_398601</td></tr><tr><td>TCRgd</td><td>BD Biosciences</td><td>331211</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_1089215</td></tr><tr><td>CCR7</td><td>Biolegend</td><td>353217</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_10913812</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>BD Biosciences</td><td>560674</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_1727497</td></tr><tr><td>CCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>561034</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_10563066</td></tr><tr><td>CCR6</td><td>BD Biosciences</td><td>353419</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_11124539</td></tr><tr><td>CXCR3</td><td>BD Biosciences</td><td>561730</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_10894207</td></tr><tr><td>CD57</td><td>BD Biosciences</td><td>562488</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_2737625</td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD Biosciences</td><td>563083</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_2737994</td></tr><tr><td>CD16</td><td>BD Biosciences</td><td>563784</td><td>用于染色的抗体&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;RRID&lt;/strong&gt;: AB_2744293</td></tr><tr><td>死细胞</td><td>Life technologies</td><td>L-23105</td><td>活/死细胞区分</td></tr><tr><td>带滤网帽的5 mL圆底聚苯乙烯试管（Falcon）</td><td>BD Bioscience</td><td>352235</td><td>在上流式细胞仪前过滤细胞悬液</td></tr><tr><td>5 mL圆底聚苯乙烯试管（Falcon）</td><td>BD Bioscience</td><td>352001</td><td>用于全血染色</td></tr><tr><td>Recovery细胞冻存培养基</td><td>Thermo fisher</td><td>12648010</td><td>细胞冻存</td></tr><tr><td>96孔V型底板</td><td>Thermo fisher</td><td>249570</td><td>染色用板</td></tr><tr><td>FACSAria IIu细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td>De Novo Software</td><td></td><td>FACS分析</td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad software</td><td></td><td>数据分析</td></tr></tbody></table>

通过双荧光染料流式细胞术区分七种免疫细胞亚群

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

免疫细胞的鉴定在很大程度上依赖于多色流式细胞术，通过表面标志物的差异表达来识别不同亚群。构建传统的多色抗体组合需要高端仪器、定制标记的抗体以及精心的实验设计，以尽量减少光谱重叠。我们开发了一种多参数分析方法，仅使用两种荧光染料结合七种谱系标志物，即可鉴定外周血中的主要人类免疫细胞群体（CD4+ 和 CD8+ T 细胞、γδ T 细胞、B 细胞、NK 细胞和单核细胞）。该策略基于以下观察：每种细胞群体均以独特的组合方式持续表达谱系标志物。将此信息与抗体的精确滴定相结合，可使研究人员额外检测五个标志物，从而突破大多数流式细胞仪的光学检测极限。直接比较表明，除 NKT 细胞和 γδ T 细胞等少数群体外，本方法在鉴定外周血中绝大多数免疫细胞群体方面的准确性与经典的 &#34;一种荧光染料对应一种标志物方法&#34;相当，尽管后者在识别这些特定群体时仍更为精确。利用两种荧光染料组合七种标志物，可在价格适中的 6-10 色流式细胞仪上，甚至在资源有限地区的 2-3 色现场检测设备上，实现对复杂免疫细胞群体和临床样本的分析。高端仪器也可从该方法中获益，通过腾出额外的荧光通道实现更深入的流式细胞术分析。该方法还特别适用于细胞数量有限的临床样本中多个细胞群体的筛查。

介绍仅使用两种荧光染料对人外周血细胞进行七种谱系标志物（抗-CD3、-CD4、-CD8、-CD14、-CD19、-CD56 和 -TCR γδ 抗体）染色的流式细胞术实验的建立与分析。
以抗CD8和抗CD56抗体滴定为例，描述了代表性实验结果。针对每种抗体（本例中为抗CD8抗体），记录连续10次两倍稀释的数据，用于绘制染色指数曲线（图1A-C）。最佳抗体浓度由染色指数信号的最大值确定13,14。应选择位于染色指数曲线上升支接近峰值或处于峰值的稀释度。抗CD4和抗CD56抗体的滴定是将外周血细胞与双荧光染料组合面板中的其他标记物（先前已进行滴定）共同染色完成的。对于抗CD4抗体，滴定目标是使抗CD4信号位于双阳性CD8+/CD3+信号与CD3单阳性细胞群之间（<...

本文介绍一种流式细胞术方案，仅使用两种荧光染料而非七种，即可鉴定人外周血中的CD4+和CD8+ T细胞、γδ T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。采用该方法，可在大多数流式细胞仪上额外检测五个标记物。

免疫细胞的表征在很大程度上依赖于多色流式细胞术，通过表面标志物的差异表达来鉴定亚群。

该方法的总体目标是突破大多数流式细胞仪的光学限制，使研究人员能够额外记录五个标记物，以分析复杂的细胞群体。利用此技术，在使用检测器数量较少的仪器或细胞数量有限的样本时，仍可实现深入的免疫表型分析。开始操作前，先将采集的血液小心转移至一个50毫升的锥形管中。将血液与等体积的不含钙和镁的磷酸盐缓冲液混合稀释。在新的50毫升锥形管底部加入15毫升密度梯度介质。小心地将稀释后的血液叠加在密度梯度介质上方，避免密度梯度介质与稀释血液之间发生混合。在室温下以400 × g离心30分钟，不使用刹车，以避免破坏界面。离心后，使用移液器小心吸除并弃去上层液体，注意不要吸走血浆与密度梯度介质之间的界面处的细胞。从界面处尽可能收集外周血单个核细胞（PBMCs），避免触碰50毫升锥形管底部的红细胞沉淀，然后转移至新管中。加入 PBS 至终体积为 25 毫升，反复倒置数次以混匀。然后，按照文中所述方法将 PBMC 洗涤两次。按照文中所述方法去除血小板并计数 PBMC 后，用含 0.1% 叠氮化钠的 PBS 重悬细胞，细胞浓度为每毫升 1 × 10⁷ 个细胞。为进行染色，将每个样本的100微升转移至96孔V型底板中。在室温下以350 × g离心3分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。向每个孔中加入 100 微升含有活/死可固定染料的 PBS，该染料可与蛋白质上的游离胺基发生反应，并小心重悬 PBMC 混合物。随后，将培养板在室温下静置 10 分钟，以标记死细胞。针对每个样本，准备含有全部七种抗体的 30 微升混合液。在此阶段，也可加入针对不同靶分子、标记不同荧光染料的滴定抗体。将96孔板在室温下以350 × g离心3分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。向每孔加入抗体混合液，并轻轻重悬细胞，避免产生气泡。在室温避光条件下孵育30分钟。30分钟后，向每孔加入150微升染色缓冲液，在室温下以350 × g离心3分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于200微升PBS中。细胞现已准备好进行流式细胞术分析。使用最大染色指数曲线对抗CD3、CD8、CD14、CD19和TCR γδ抗体进行滴定。在本方案中，抗体滴定是识别七种免疫细胞亚群最为关键的步骤，该过程使用两种荧光染料。为制备两倍稀释的抗体溶液，向96孔板的10个孔中每孔加入40微升染色缓冲液。在本视频中，仅展示抗CD8抗体的滴定过程。在第一孔中，将染色缓冲液的终体积增加至80微升，并加入浓度为厂家推荐浓度四倍的抗CD8抗体。充分混匀后，取40 µL转移至第二孔。充分混匀，并对所有其他孔重复此步骤。按照先前演示的方案，使用10种不同的两倍稀释浓度的抗CD8抗体各30 µL，对10份PBMC或全血样本进行染色。使用流式细胞仪获取数据，并绘制每个稀释度的信号。根据文中所述方法计算每个抗体浓度的染色指数后，绘制染色指数相对于抗体稀释倍数的分数形式的曲线，确定具有最大染色指数值的抗体浓度。为滴定抗-CD4和抗-CD56抗体，可从之前展示的两倍稀释策略开始，再在其中增加若干中间浓度，以精细确定能够实现CD4阳性T细胞和NK细胞与其他细胞群有效分离的抗体浓度范围。通过将抗CD4抗体信号置于双CD8阳性、CD3阳性信号与CD3单阳性细胞群之间，对抗CD4抗体进行滴定。参照抗CD4抗体滴定的类似策略，将NK细胞置于CD3阴性和CD3阳性细胞群之间，对抗CD56抗体进行滴定。开始这种双荧光染料、七标记门控策略时，选择淋巴细胞门，并使用本方案中的两种荧光染料之一分别作为每个坐标轴，创建点图。在散点图右上角圈选CD8阳性T细胞，即CD3和CD8双阳性细胞。排除CD8弱表达的细胞群，因其可能包含NKT细胞。CD4阳性T细胞位于CD8阳性T细胞与CD3单阳性细胞群之间，据此圈选该细胞群。以高表达CD3的细胞圈定γδ T细胞，并进一步将γδ T细胞划分为CD8阳性和CD8阴性亚群。以位于CD3阳性与CD3阴性细胞群之间的细胞群体圈定NK细胞。将NK细胞分为CD8阳性与CD8阴性。在散点图右下角圈选CD3阴性、CD19阳性的细胞群体以确定B细胞门。选择单核细胞门，并使用本方案中所用的两种荧光染料之一分别在每个轴上创建散点图。对CD3阴性、CD14阳性细胞群设门。采用此策略，根据前向散射和侧向散射特征及流式细胞术图谱，对多发性骨髓瘤患者的淋巴细胞进行设门。通过CD45RA和CCR7的表达情况鉴定CD8阳性记忆亚群和初始T细胞。通过检测HLA-DR和CD57的表达，研究CD8阳性初始T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞以及CD45RA阳性效应记忆T细胞中的T细胞活化状态。类似地，鉴定出CD4阳性初始T细胞和记忆T细胞。在记忆T细胞群体中，利用CCR4和CCR6鉴定CD4阳性T细胞中的辅助性T细胞亚群。通过CD16和CD57的表达特征鉴定NK细胞的不同亚群。该策略用于研究一名接受干细胞移植的多发性骨髓瘤患者纵向样本中免疫细胞群的动态变化。随时间对CD8和CD4亚群进行表征显示，CD4阳性与CD8阳性T细胞持续活化，并且辅助性T细胞向Th1型表型偏移。但在第60天，B细胞的比例显著增加，预示着患者病情复发。正确的细胞制备和抗体滴定是采用该技术获得可靠结果的关键步骤。可添加针对其他标志物的抗体，以实现更深入的流式细胞术分析，并构建可同时靶向多个细胞系的模块化流式细胞术检测 panel。旨在增加可记录标记物数量的类似方法也可利用不同的标记物组合或用于不同的动物模型进行开发。切记叠氮化钠可导致皮肤和眼睛灼伤，因此在操作该试剂时应始终穿戴实验服、防护眼镜和手套。

discrimination-seven-immune-cell-subsets-two-fluorochrome-flow

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

双氟铬流式细胞仪对七种免疫细胞子集的判别

我们展示了多色流式细胞术在恒河猴中对CD4+和CD8+...

多色流式细胞术分析恒河猴的细胞免疫应答

本视频展示了一种基于流式细胞术的技术，使用两种荧光染料对人类外周血单个核细胞（PBMCs）中的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、γδ T 细胞、B...

一种用于鉴定外周血单个核细胞中免疫细胞亚群的流式细胞术检测方法

通过流式细胞术分析纳米颗粒与免疫细胞特定亚群的相互作用。...

通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与主要免疫细胞亚群的相互作用

介绍了一种通过将II-45间皮瘤细胞植入免疫功能正常大鼠的胸膜腔来建立胸膜恶性间皮瘤原位大鼠模型的方法。同时还描述了一种流式细胞术方法，可用于从25...

II-45同系大鼠间皮瘤模型中的原位移植及外周免疫细胞监测

炎症在缺血性脑卒中的发病机制中起着核心作用。越来越多的证据表明，炎症具有双重作用：一方面会加剧早期脑损伤，另一方面也参与后期的修复过程。本方案描述了从缺血脑组织中分离免疫细胞，并对其进行后续流式细胞术表型分析的方法。...

从小鼠缺血脑组织中分离免疫细胞及其流式细胞术分析

本文介绍了光谱流式细胞术，这是一种流式细胞术的新方法，利用发射光谱的形状来区分荧光染料。该方法采用一种算法替代补偿，并可将自发荧光作为一个独立参数进行处理。这种新方法使得对从实体器官中分离的细胞进行准确分析成为可能。...

通过光谱流式细胞术分析从实体组织中分离的细胞悬液

本文描述了一种从人外周血中分离和鉴定CD4+ T细胞亚群的实验方案。通过流式细胞术分析纯化的CD4+...

从外周血中分离CD4+ T细胞并利用六色流式细胞术分析循环滤泡辅助性T细胞（cTfh）亚群

本文介绍了一种从小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏制备单细胞悬液的实验方案，以便进一步通过流式细胞术对这些细胞进行研究。此外，该方案还可用于通过流式细胞术鉴定调节性T细胞的不同亚群。...

利用流式细胞术检测小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中调节性T细胞亚群

本文介绍了一种详细且可重复的流式细胞术方案，利用已建立的小鼠骨关节炎手术模型，通过胞外和胞内染色实验，鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织中的单核细胞/巨噬细胞和T细胞亚群。...

骨关节炎模型中经由流式细胞术分析小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内的免疫细胞亚群

从分离的植入物中提取细胞，并通过流式细胞术对其进行表征，可显著促进对植入物免疫应答模式的理解。本文描述了一种从分离的植入物中精确分离细胞并进行染色以用于流式细胞分析的方法。...

高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

学习使用双荧光流式细胞术识别人外周血中的七种免疫细胞亚群，包括CD4+和CD8+T细胞、γδT细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。该方法可记录五种额外标志物，实现深度免疫表型分析。

通过双荧光染料流式细胞术区分七种免疫细胞亚群

探索更多视频