Name: 人类外周血神经细胞分离通过评估Rab10磷酸化来询问帕金森氏症相关的LRRK2激酶途径 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 了解如何通过分离人类外周血中性粒细胞并检测Rab10磷酸化水平来评估LRRK2激酶活性。该方法为研究遗传性帕金森病提供了可靠的生物标志物检测手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢所有健康志愿者为本研究慷慨捐献血液。我们感谢帕金森病研究迈克尔·J·福克斯基金会（MJFF）以及Fox BioNet研究团队（FBN）对本方案撰写及视频制作提供的支持与建议。我们感谢奥地利维也纳大学的Alexander Zimprich教授对本实验方案的测试与合作。我们珍视Paul Davies（MRC蛋白质磷酸化与泛素化单位，PPU总负责人）对本项目所做出的贡献。我们还感谢MRC蛋白质磷酸化与泛素化单位（PPU）提供的出色技术支持，特别是化学合成团队（Natalia Shpiro负责MLi-2的合成）以及PPU试剂与服务部门的抗体纯化团队（由Hilary McLauchlan和James Hastie协调）。我们感谢Vivomotion公司的Mhairi Towler和Fraser Murdoch在视频与动画制作过程中提供的帮助。我们感谢81 films公司的Steve Soave在最终剪辑过程中提供的协助。Esther Sammler获得了苏格兰高级临床学术奖学金的支持，并获得了帕金森病英国组织（Parkinson's UK，项目编号K-1706）的资助。

根据英国当地规定，所有涉及人血的操作和移液均在二级生物安全柜中进行。所有实验步骤均符合当地伦理审查委员会的要求，所有参与者均已签署知情同意书。
1. 准备
<ol>
	<li>配制含有 100 mM EDTA 的磷酸盐缓冲液（PBS）100 mM EDTA 储存液 0.1 mL。</li>
	<li>配制含有 1 mM EDTA 的磷酸盐缓冲液（PBS）1 mM EDTA 储存液 60 mL。</li>
	<li>配制裂解缓冲液，包含 50 mM Tris-HCl（pH = 7.5）、1%（v/v）Triton X-100、1 mM EGTA、1 mM Na3VO4、50 mM NaF、10 mM β-甘油磷酸钠、5 mM 焦磷酸钠、0.27 M 蔗糖、0.1%（v/v）β-巯基乙醇、1× 蛋白酶抑制剂混合物、1 μg/mL 微囊藻毒素-LR 和 0.5 mM 二异丙基氟磷酸酯（DIFP）。 
	注意：作者通常使用不含 EDTA 的产品，但含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物也应有效。裂解缓冲液可预先配制，但不加入 β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂、微囊藻毒素-LR 和 DIFP，于 4 °C 保存至使用前。确保 β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂、微囊藻毒素-LR 和 DIFP 仅在使用前立即添加。 
	注意：DIFP 具有毒性，应在通风橱中谨慎操作，并遵循当地健康与安全风险评估要求。DIFP 可加入裂解缓冲液后立即使用。或者，可将包含所有组分（包括 DIFP）的完整裂解缓冲液分装后于 -80 °C 保存，至少可稳定使用 4 周。</li>
</ol>
2. 从全血中分离中性粒细胞
<ol>
	<li>将10 mL血液采集至采血管中，轻轻倒置管体7−8次进行混匀。</li>
	<li>将10 mL血液转移至一个50 mL锥形管中。</li>
	<li>向血液中加入100 μL EDTA储存液1，轻轻混匀。</li>
	<li>从嗜中性粒细胞分离试剂盒（材料表）中取分离用混合液（50 μL/mL），向全血样本中加入500 μL。</li>
	<li>使用前将嗜中性粒细胞分离试剂盒中的磁珠涡旋振荡30秒，以充分重悬极细小的磁珠。</li>
	<li>向血液样本中加入500 μL磁珠，通过反复倒置管体数次进行轻柔混匀。</li>
	<li>室温（RT）孵育5分钟。</li>
	<li>用EDTA储存液2将管内液体补至50 mL，通过极其轻柔地吹吸2–3次进行混匀。</li>
	<li>将管子放入磁架中，并取下管盖，以避免后续操作中产生扰动。</li>
	<li>室温（RT）孵育10分钟。</li>
	<li>小心地将含有嗜中性粒细胞的富集细胞悬液用移液器转移至一个新的50 mL锥形管中。 
	注意：不要触碰与磁铁接触一侧的管壁，避免收集和扰动管底的红细胞。在管底留下约10 mL红细胞悬液。</li>
	<li>使用前将磁珠涡旋振荡30秒，向含有富集嗜中性粒细胞的管中加入0.5 mL磁珠，通过倒置管体进行轻柔混匀。</li>
	<li>室温（RT）孵育5分钟。</li>
	<li>将管子放入磁架中，并取下管盖，以避免后续扰动。</li>
	<li>室温（RT）孵育5分钟。</li>
	<li>小心地将含有嗜中性粒细胞的富集细胞悬液用移液器转移至一个新的50 mL锥形管中。 
	注意：不要触碰与磁铁接触一侧的管壁。在管底留下约5 mL悬液。</li>
	<li>为确保从细胞混合物中完全去除磁珠，将含有富集细胞的管子再次放入磁架中。</li>
	<li>室温（RT）孵育10分钟。</li>
	<li>小心地将现在含有纯化嗜中性粒细胞的富集细胞悬液用移液器转移至一个新的50 mL锥形管中。 
	注意：不要触碰与磁铁接触一侧的管壁。在管底留下约5 mL悬液。</li>
	<li>用1 mM EDTA储存液2将分离的细胞混匀，终体积约为41 mL。通过上下吹吸混匀。</li>
	<li>将溶液等分为两份，每管约20 mL。</li>
	<li>在335 x g条件下离心5分钟。</li>
	<li>在离心过程中，从-80 °C冰箱中取出MLi-2抑制剂储存液（200 µM/1,000倍浓度），置于室温下以备后续使用。</li>
	<li>离心结束后立即进行下一步操作，避免扰动管体，倾去上清液时不要破坏嗜中性粒细胞沉淀。在室温下，用移液器轻柔吹吸4次，将每个细胞沉淀重悬于10 mL细胞培养基（材料表）中。</li>
</ol>
3. 纯化中性粒细胞的 LRRK2 激酶抑制剂处理
<ol>
	<li>标记一个试管为&#34;DMSO&#34;，另一个试管为&#34;MLi-2&#34;。</li>
	<li>向标记为&#34;DMSO&#34;的试管中加入10 µL DMSO，并用10 mL移液器轻轻吹打2次以混匀。向标记为&#34;MLi-2&#34;的试管中加入10 μL 200 μM MLi-2储备液（终浓度为200 nM），并用10 mL移液器轻轻吹打2次以混匀。</li>
	<li>将样品在室温下孵育30分钟。孵育期间每10分钟轻轻颠倒混匀一次。</li>
	<li>在孵育期间，从-80 °C冰箱中取出0.5 M DIFP储备液，置于冰上并放入通风橱中。从-80 °C冰箱中取出1 mg/mL微囊藻毒素-LR（microcystin-LR）储备液，置于室温下解冻。从冰箱中取出一份裂解缓冲液（0.25 mL），在室温下融化后置于冰上备用。</li>
	<li>准备1 mL含有1 μL DMSO的细胞培养基，称为DMSO重悬缓冲液。另准备1 mL含有1 μL 200 μM MLi-2的RPMI培养基，称为MLi-2重悬缓冲液。</li>
	<li>30分钟孵育结束后，将两个试管在335 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>小心弃去每个试管中的上清液，避免扰动中性粒细胞沉淀。</li>
	<li>对于标记为DMSO的样品，用1 mL DMSO重悬缓冲液轻轻重悬沉淀；对于标记为MLi-2的试管，用1 mL MLi-2重悬缓冲液重悬沉淀。</li>
	<li>将重悬后的细胞沉淀转移至相应标记为&#34;DMSO&#34;和&#34;MLi-2&#34;的离心管中，在335 × g条件下离心3分钟。</li>
	<li>在离心过程中，准备裂解缓冲液。在通风橱中，向0.25 mL裂解缓冲液中小心加入0.25 μL 0.5 M DIFP溶液和0.25 μL 1 mg/mL微囊藻毒素-LR溶液。混匀后置于冰上待用。 
	注意：应在细胞裂解前15分钟内将DIFP加入裂解缓冲液，因为DIFP在水溶液中相对不稳定。</li>
	<li>离心结束后立即用移液器小心且彻底地吸除所有上清液，避免扰动中性粒细胞沉淀，并将试管置于冰上。</li>
	<li>立即向每个试管中加入100 µL含DIFP和微囊藻毒素-LR的裂解缓冲液。使用100–200 μL移液器上下吹打5–10次，以重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞在冰上裂解10分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下以20,000 × g离心15分钟，以去除细胞碎片。</li>
	<li>将含有中性粒细胞裂解物的&#34;DMSO&#34;和&#34;MLi-2&#34;上清液转移至新的离心管中。弃去碎片沉淀。 
	注意：中性粒细胞裂解物现已可用于后续实验，或可迅速在液氮中冷冻后于-80 °C保存以供后续分析。</li>
</ol>

<ol><li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+Potent%2C+Selective%2C+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Therapies+for+Parkinson%27s+Disease%3A+From+Genetics+to+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2%3A+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).</li>
<li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+kinase+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li>
<li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li>
<li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2+serines+955+and+973+is+disrupted+by+Parkinson%27s+disease+mutations+and+LRRK2+pharmacological+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Parkinson%27s+disease+LRRK2+kinase+pathway+activity+by+assessing+Rab10+phosphorylation+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).</li>
<li>Scott, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+3-%284-Pyrimidinyl%29+Indazole+%28MLi-2%29%2C+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li>
<li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+serine+proteases%3A+specific+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li>
<li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson%27s+disease+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li>
<li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+VPS35%5BD620N%5D+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li>
<li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li>
<li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32(2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

有力的临床、遗传和生化证据表明，LRRK2（富含亮氨酸重复序列的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2）在其激酶功能方面在帕金森病中发挥着重要作用7。目前已有LRRK2激酶抑制剂被开发出来，并正在进入临床试验阶段2,4,12。因此，有必要将LRRK2作为靶点参与度以及患者分层的生物标志物加以利用。本方案描述了一种稳健且简便的检测方法，用于分析LRRK2激酶通路的激活情况，该激活通过人外周血中性粒细胞均一细胞群中其生理底物Rab10的磷酸化水平来反映11,14。在进行定量免疫印迹分析时，我们强烈推荐使用高选择性的磷酸化特异性Rab10抗体（MJFF-pRab10单克隆抗体）14,17。</...

迄今为止，试图减缓或阻止帕金森病（PD）进展的努力均未成功。富含亮氨酸重复序列的激酶2（LRRK2）基因中存在激活突变，这些突变可导致或增加患帕金森病的风险，这一发现推动了LRRK2激酶抑制剂的开发1,2,3。目前，这些抑制剂已进入临床试验阶段4。LRRK2的确切功能尚不明确，但近年来取得的重要进展是发现了一类Rab GTP酶蛋白（包括Rab10）作为LRRK2激酶首个真正意义上的生理底物5,6,7。在疾病修饰治疗时代，面临的主要挑战是寻找能够反映LRRK2激酶激活状态的生化标志物，以及评估LRRK2激酶抑制剂靶点结合效果的指标。
迄今为止，体内LRRK2抑制剂的主要药代动力学标志物是LRRK2上一组组成型磷酸化的丝氨酸残基，特别是丝氨酸935，该位点在多种LRRK2抑制剂作用下会发生去磷酸化8,9。然而，丝氨酸935的磷酸化水平并不能反映细胞内LRRK2激酶的内在活性，因为该位点并非由LRRK2直接磷酸化，且在激酶失活型LRRK2中仍可被磷酸化10。LRRK2激酶活性与丝氨酸1292的自磷酸化状态高度相关，但由于目前尚无针对该位点可靠且具有磷酸化特异性的抗体，因此在实际操作中无法通过全细胞裂解液的免疫印迹分析来有效检测内源性LRRK2激酶活性10,11。
我们开发了一种稳定且简便的检测方法，用于定量人类外周血细胞中LRRK2激酶通路的活性，该方法通过检测LRRK2在其生理底物蛋白Rab10的苏氨酸73位点（Thr73）所介导的磷酸化水平来实现11。外周血可通过静脉穿刺轻松获取，该操作风险低、耗时短，且几乎不会引起不适。我们重点关注人类外周血中性粒细胞，因为这类细胞数量丰富（占所有白细胞的37–80%），细胞群体均一，并且表达相对较高水平的LRRK2和Rab1011。此外，可通过免疫磁珠负向分离法快速高效地分离外周血中性粒细胞。为确保后续观察到的Rab10磷酸化确实由LRRK2介导，每批分离的中性粒细胞均需在有或无强效且特异性LRRK2激酶抑制剂的条件下进行孵育（我们使用并推荐MLi-2）2，12。随后，在含有蛋白酶抑制剂二异丙基氟磷酸（DIFP）的裂解缓冲液中裂解细胞，该步骤对于抑制中性粒细胞中已知较高的内源性丝氨酸蛋白酶活性至关重要13。在后续的定量免疫印迹分析中，我们推荐使用MJFF-pRab10兔单克隆抗体，该抗体可特异性识别Rab10 Thr73位点的磷酸化表位，且不会与其他磷酸化的Rab蛋白发生交叉反应14。该抗体的选择性和特异性已在多种Rab蛋白的过表达模型以及A549 Rab10基因敲除细胞系中得到验证14。因此，我们通过比较在有或无强效特异性LRRK2激酶抑制剂处理条件下中性粒细胞裂解物中Rab10磷酸化水平的差异来评估通路活性2。此外，样本也可采用其他方法进行分析，例如定量质谱法。
综上所述，由 LRRK2 调控的 Rab10 磷酸化是比 LRRK2 在丝氨酸 935 位点磷酸化更优的 LRRK2 激酶活性标志物，而人外周血中性粒细胞是研究 LRRK2 相关帕金森病（PD）的宝贵资源。我们的实验方案提供了一种稳健且简便的检测方法，可用于检测外周血中性粒细胞中 LRRK2 信号通路的活性，并能够对 LRRK2 激酶活性升高的个体进行生物化学分层15。重要的是，这类个体可能在未来受益于 LRRK2 激酶抑制剂的治疗。

<table><tbody><tr><td>1 mL 移液器吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>10 mL 移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025&amp;nbsp;</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.113</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>15 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>25 mL 移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>50 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Hemogard 封口塑料 K2-EDTA 管</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>BD 367525</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Allegra X-15R 离心机</td><td>贝克曼</td><td></td><td>或配备适用于15 mL和50 mL Falcon管、转速为1000–1200 × g的水平转子离心机</td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete（不含EDTA）蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>DIFP（二异丙基氟磷酸酯）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0879</td><td>使用异丙醇配制 0.5 M 储存液，并采取特殊预防措施&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>6250</td><td></td></tr><tr><td>干冰或液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14190094</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep 磁力架&amp;nbsp;</td><td>干细胞</td><td>18002</td><td>用于放置1个50 ml离心管</td></tr><tr><td>EasySep Direct 人中性粒细胞分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>干细胞</td><td>19666</td><td>这包含称为的溶液 &amp;ldquo;分离混合液&amp;rdquo; 和 &amp;ldquo;RapidSpheres 磁珠</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5417R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>喷雾瓶中的乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（无水级）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，1%（v/v）Triton X-100，1 mM EGTA，1 mM Na3VO4，50 mM NaF，10 mM） &amp;beta;-甘油磷酸盐，5 mM 焦磷酸钠，0.27 M 蔗糖，0.1% (v/v) &amp;beta;-巯基乙醇，1× cOmplete（无EDTA）蛋白酶抑制剂混合物（Roche），1 &amp;mu;g/ml 微囊藻毒素-LR，0.5 mM 二异丙基氟磷酸酯（DIFP）。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>或者，可使用不含微囊藻毒素-LR和DIFP的裂解缓冲液，分装后冻存，试剂可从MRC-PPU试剂库获取（http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/）</td></tr><tr><td>默克LRRK2抑制剂II（MLi-2）</td><td>默克</td><td>438194-10MG</td><td>或同等效力的（强效且选择性LRRK2抑制剂）</td></tr><tr><td>微囊藻毒素-LR</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-350-012-M001</td><td>1 mg/ml 储存液，溶于DMSO，-80 oC保存。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Na₃VO₄</td><td>Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx 扫描式 Western 印迹成像系统</td><td>奥德赛</td><td></td><td></td></tr><tr><td>永久性记号笔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>个人防护装备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>21875034</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>Sigma</td><td>S22</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;建议用于蛋白质印迹的抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗RAB10（磷酸化T73）抗体 [MJF-R21]</td><td>abcam</td><td>ab230261</td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;-tubulin</td><td>细胞信号传导技术</td><td>5174</td><td>以1:2000稀释比例使用</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IRDye 680LT</td><td>LI-COR</td><td>926-68020</td><td>以1:10,000稀释比例使用</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IRDye 800CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>以1:10,000稀释度使用</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 标记的山羊抗兔抗体</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td>以1:10,000稀释度使用</td></tr><tr><td>MJFF-total Rab10 小鼠抗体</td><td>由 nanoTools (nanotools.de) 生成</td><td>不适用*</td><td>2处使用 &amp;mu;g/ml 终浓度；* 由 nanoTools（www.nanotools.de）[11] 开发的 MJFF-total Rab10 抗体将于 2018 年由迈克尔·J·福克斯基金会进行商业化</td></tr><tr><td>小鼠抗LRRK2 C端抗体</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>&amp;nbsp;75-253</td><td>1 处使用 &amp;mu;g/ml 终浓度</td></tr><tr><td>pS935-LRRK2</td><td>MRC PPU 试剂与服务</td><td>UDD2</td><td>1 处使用 &amp;mu;g/ml 终浓度</td></tr></tbody></table>

人外周血中性粒细胞分离用于通过检测rab10磷酸化研究帕金森病相关lrrk2激酶通路

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

富含亮氨酸重复序列的激酶2（LRRK2）是遗传性帕金森病（PD）中最常发生突变的基因，所有致病性LRRK2突变均会导致其激酶功能过度激活。本文介绍一种简便且稳健的检测方法，通过检测LRRK2对其生理底物Rab10在苏氨酸73位点（Thr73）的磷酸化水平，来定量评估人外周血中性粒细胞中LRRK2激酶通路的活性。该免疫印迹分析需要使用完全特异性的、针对LRRK2磷酸化Rab10 Thr73表位的磷酸化特异性抗体，例如MJFF-pRab10兔单克隆抗体。本方法采用人外周血中性粒细胞，因为外周血易于获取，且中性粒细胞数量丰富、细胞组成均一。重要的是，中性粒细胞中LRRK2和Rab10的表达水平相对较高。中性粒细胞的一个潜在缺点是其内在丝氨酸蛋白酶活性较强，因此裂解缓冲液中必须加入高效蛋白酶抑制剂，例如有机磷神经毒素二异丙基氟磷酸酯（DIFP）。尽管如此，中性粒细胞仍是研究体内LRRK2激酶通路活性的宝贵资源，应考虑将其纳入帕金森病生物样本库的采集范围。

本实验通过检测LRRK2依赖性的Rab10蛋白磷酸化水平，用于评估帕金森病相关LRRK2激酶在人外周血中性粒细胞中的活化状态。中性粒细胞是一种均一且数量丰富的外周血白细胞群体，其LRRK2和Rab10蛋白的表达水平均较高（图1）。在外周血单个核细胞（PBMCs）中，仅有单核细胞同时具有较高水平的这两种蛋白，但其仅占白细胞总数的2–12%。这表明外周血中性粒细胞是研究LRRK2调控的Rab10磷酸化的更适宜生物基质。
采用我们的方法从10 mL血液中分离外周血中性粒细胞时，每位供体可获得0.5–0.75 mg的总蛋白裂解液（图2A），足以进行大量免疫印迹分析，因每条凝胶加样孔仅需10 μg蛋白。尽管细胞纯度和活力检测非常规操作，但我们通过对三位健康供体的检测证明，分离所得中性粒细胞的纯度为94–98%，细胞活力约为99%，该结果通过流式细胞术分析获得，其中使用CD66b−异硫氰酸荧光素标记中性粒细胞，采用4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色评估细...

富含亮氨酸重复序列的激酶2基因（LRRK2）的突变可导致遗传性帕金森病。我们开发了一种简便且稳健的方法，用于检测人外周血中性粒细胞中受LRRK2调控的Rab10磷酸化水平。该方法可能有助于识别LRRK2激酶通路活性升高的个体。

人外周血中性粒细胞分离用于通过检测Rab10磷酸化研究帕金森病相关LRRK2激酶通路

富含亮氨酸重复序列的激酶2（LRRK2）是遗传性帕金森病（PD）中最常发生突变的基因，所有致病性LRRK2……

本实验的总体目标是提供一种评估人外周血中内源性 LRRK2 激酶活性的方法。该方法通过监测 LRRK2 介导的 Rab 蛋白磷酸化，并利用 Michael J. Fox 基金会提供的磷酸化特异性 Rab 单克隆抗体来实现。本文重点以外周血中性粒细胞为研究对象，因其为同质性较高的细胞群体，且 Rab2 和 Rab10 的表达水平均较高。中性粒细胞的分离基于负向选择法，可在40分钟内完成操作，获得纯度达99%且具有活性的中性粒细胞，同时还能获得较高含量的蛋白质。采集10毫升血液至采血管中。轻轻颠倒混匀7到8次。将10毫升血液转移至50毫升锥形管中。向血液中加入100微升EDTA储存液1（0.1摩尔EDTA PBS溶液），轻轻混匀。向全血样本中加入500微升分离试剂盒中的分离混合液（每毫升血液加入50微升），来自中性粒细胞分离试剂盒。使用中性粒细胞分离试剂盒中的磁珠前，先将磁珠涡旋振荡30秒，以重悬极细小的磁珠。向血液样本中加入500 µL磁珠，通过轻轻翻转离心管数次进行混匀。室温孵育5分钟。用EDTA储存液2将试管补至50毫升，得到1毫摩尔/升EDTA PBS溶液。轻轻吹打混匀2到3次。将试管放入磁铁中，并取下管盖以避免后续操作中试管晃动。室温孵育10分钟。小心吸取含有中性粒细胞的富集细胞悬液，转移至新的50毫升锥形管中。不要触碰与磁铁接触的管壁，并避免收集和扰动管底的红细胞。在管底留下约10毫升红细胞悬液。使用前将磁珠涡旋振荡30秒，并向含有富集中性粒细胞的管中加入0.5毫升磁珠。轻轻翻转离心管混匀。室温孵育5分钟。将离心管放入磁力架中，并取下管盖以避免后续震荡。在室温下孵育五分钟。小心地将含有中性粒细胞的富集细胞悬液用移液器转移至新的50毫升锥形管中。切勿触碰与磁铁接触一侧的管壁。在离心管底部保留约五毫升的悬液。为确保从细胞混合物中完全去除磁珠，将含有富集细胞的离心管置于磁力架中，室温孵育10分钟。将含有纯化中性粒细胞的富集细胞悬液小心地用移液器转移至新的50毫升锥形管中。切勿触碰与磁铁接触一侧的管壁。在管底留下约5毫升的悬液。用1毫摩尔EDTA储存液2补足分离的细胞，终体积约为41毫升。用移液器吹打混匀。将溶液等分为两管，每管约20毫升。将两个离心管在335G条件下离心五分钟。离心过程中，从-80摄氏度冰箱中取出MLi-2抑制剂储备液（200微摩尔/1000倍浓度），置于室温下以备后续使用。离心结束后立即进行操作，不要振荡离心管，小心倾倒上清液，避免扰动中性粒细胞沉淀。在室温下，用移液器轻轻吹打细胞4次，将每份细胞沉淀重悬于10毫升细胞培养基中。标记其中一管为DMSO，另一管为MLi-2。向标记为DMSO的管中加入10微升DMSO，向标记为MLi-2的管中加入10微升200微摩尔的MLi-2储备溶液，轻轻吹打混匀。将样品在室温下孵育30分钟。孵育期间每10分钟轻轻颠倒混匀一次。在30分钟LRRK2激酶抑制剂处理期间，从−80°C冰箱中取出0.5摩尔的DIFP储备液，置于冰上并放入通风橱中。然后，将一毫克每毫升的微囊藻毒素-LR 储存液从负80摄氏度冰箱中取出，置于室温下解冻。从冰箱中取出0.25毫升裂解缓冲液，于室温下解冻后，再置于冰上以备后续使用。配制一毫升含一微升DMSO的RPMI培养基，将其称为DMSO重悬缓冲液。准备1毫升含1微升200微摩尔MLi-2或替代性LRRK2激酶抑制剂的RPMI培养基，并将此溶液称为MLi-2重悬缓冲液。30分钟孵育结束后，同前，将两个管在335×g下离心5分钟。小心弃去每管中的上清液，避免扰动中性粒细胞沉淀。对于标记为 DMSO 的试管，用一毫升 DMSO 重悬缓冲液轻轻重悬沉淀。对于标记为 MLi-2 的试管，用一毫升 MLi-2 重悬缓冲液重悬沉淀。将重悬后的细胞沉淀转移至相应标记为 DMSO 和 MLi-2 的离心管中，并在 335×g 下离心 3 分钟。离心步骤期间，准备裂解缓冲液。在通风橱中，向 0.25 毫升裂解缓冲液中小心加入 0.25 微升 0.5 摩尔的 DIFP 溶液以及 0.25 微升 1 毫克/毫升的微囊藻毒素-LR。混匀后置于冰上，待用。离心结束后，立即用移液器小心且彻底地吸除所有上清液，避免扰动中性粒细胞沉淀，将离心管置于冰上。立即向每根离心管中加入 100 µL 含 DIFP 和微囊藻毒素-LR 的裂解缓冲液。使用 100 至 200 µL 移液器，通过上下吹打约 5 至 10 次，重悬细胞沉淀。将细胞置于冰上 10 分钟。然后在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心 15 分钟，以去除细胞碎片。将含有中性粒细胞裂解物的 DMSO 和 MLi-2 上清液转移至新的离心管中。弃去碎片沉淀。中性粒细胞裂解物现可直接使用，或可置于液氮中速冻后于-80 °C保存以供后续分析。根据公开可用的导入数据库中的数据，该图显示LRRK2和Rab10蛋白在人外周血中性粒细胞和单核细胞中丰度特别高。采用此方法分离人外周血中性粒细胞可获得较高但不纯的细胞得率。上方表格显示了从三位健康供体各10毫升外周血中分离得到的细胞总数。同时列出的还有分离细胞的纯度和活力，以及总蛋白裂解物的得率。在使用或不使用LRRK2激酶抑制剂MLi-2处理后，中性粒细胞在强效蛋白酶抑制剂DIFP存在下被裂解。左侧图B中，每泳道上样10微克全细胞提取物，并用指定抗体进行多重定量免疫印迹分析。右侧图C表明DIFP在防止蛋白水解降解（特别是大分子量LRRK2蛋白）方面具有重要作用。相比之下，单独使用高浓度PMSF的效果较差。结果显示，在携带杂合VPS35 D620N突变的遗传性帕金森病患者的外周血中性粒细胞中，由LRRK2调控的Rab10磷酸化水平较对照组显著升高约三倍。上方图为多重免疫印迹分析结果，下方图为相应定量结果。这表明VPS35 D620N突变通过一种尚未明确的机制激活了LRRK2激酶通路活性。综上所述，我们介绍了一种简便且稳健的检测方法，通过检测人外周血来源中性粒细胞中Rab蛋白（如Rab10）的磷酸化水平来测量LRRK2激酶通路活性，该方法使我们能够评估LRRK2通路活性，并确定突变、疾病状态或抑制剂如何调节LRRK2通路活性。

human-peripheral-blood-neutrophil-isolation-for-interrogating

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

人类外周血神经细胞分离通过评估Rab10磷酸化来询问帕金森氏症相关的LRRK2激酶途径

富含亮氨酸重复序列的激酶2是一种大型多结构域激酶，其突变是帕金森病最常见的遗传病因。对该蛋白激酶活性的分析已被证明是理解其生物学功能及功能障碍的关键工具。本文中 体外...

检测LRRK2的激酶活性 体外

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有多个结构域的蛋白质，包含GTP酶和激酶结构域，并可在细胞内发生磷酸化。本文中，我们介绍一种在细胞中使用32P正磷酸盐标记LRRK1和LRRK2的实验方案，从而提供一种检测其在细胞内总体磷酸化水平的方法。...

富含亮氨酸重复序列激酶1和2的放射性磷酸盐代谢标记

脂氧合酶（LOX）同工酶可生成可能增强或减弱神经炎症与神经变性的产物。 通过基因-环境相互作用研究，可识别特定LOX同工酶的作用。利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的黑质纹状体损伤模型，在两种LOX同工酶缺陷的转基因小鼠品系中，可比较LOX同工酶对多巴胺能完整性和炎症反应的贡献。...

基因-环境相互作用模型揭示帕金森病易感机制

中性粒细胞不仅在宿主防御侵入性微生物方面发挥重要作用，还参与对肿瘤细胞的免疫监视。本文描述了具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离技术，以及监测抗肿瘤中性粒细胞功能的方法。 体外 和 体内.

具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征

本研究描述了一种检测富含亮氨酸重复序列激酶2对Rab10内源性磷酸化水平的简单方法。...

利用含磷酸结合标签的SDS-PAGE检测LRRK2活性介导的Rab10磷酸化

本方案概述了一种针对人原代胰岛样本中β细胞的线粒体自噬蛋白复合物形成进行定量分析的方法。该技术因而能够利用有限的生物材料进行线粒体自噬分析，这对于珍贵的人胰腺β细胞样本至关重要。...

利用邻近连接技术原位可视化人胰岛β细胞中的内源性线粒体自噬复合物

本研究分析了在帕金森病临床前模型中诱导神经炎症、神经变性及运动功能障碍所需的病毒载体剂量和暴露时间。这些编码人源α-突触核蛋白的载体被递送至黑质 ，以重现与帕金森病相关的突触核蛋白病理变化。...

分析由编码人α-突触核蛋白的腺相关病毒载体诱导的帕金森病小鼠模型

本明确的实验方案描述了一种实时高通量显微镜技术，用于在体外可视化并定量人中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的释放。in vitro...

实时、高通量显微定量人中性粒细胞胞外诱捕网释放及拮抗剂药理学评估

肽竞争实验在多种分子和免疫学实验中被广泛应用。本文描述了一种详细的肽竞争实验方法 体外...

寡肽竞争法测定磷酸化位点

本文介绍了一种从血浆和血清中纯化外泌体的方案，可显著减少非外泌体血液蛋白的共纯化。优化后的方案包括超滤、蛋白酶处理和尺寸排阻色谱。外泌体的高效纯化有助于后续分析，包括对外泌体更准确的定量以及蛋白质组学表征。...

蛋白质消化、超滤和尺寸排阻色谱法优化人血浆和血清中外泌体的分离

了解如何通过分离人类外周血中性粒细胞并检测Rab10磷酸化水平来评估LRRK2激酶活性。该方法为研究遗传性帕金森病提供了可靠的生物标志物检测手段。

人外周血中性粒细胞分离用于通过检测Rab10磷酸化研究帕金森病相关LRRK2激酶通路

探索更多视频