人外周血中性粒细胞分离用于通过检测Rab10磷酸化研究帕金森病相关LRRK2激酶通路

本实验的总体目标是提供一种评估人外周血中内源性 LRRK2 激酶活性的方法。该方法通过监测 LRRK2 介导的 Rab 蛋白磷酸化，并利用 Michael J. Fox 基金会提供的磷酸化特异性 Rab 单克隆抗体来实现。本文重点以外周血中性粒细胞为研究对象，因其为同质性较高的细胞群体，且 Rab2 和 Rab10 的表达水平均较高。

中性粒细胞的分离基于负向选择法，可在40分钟内完成操作，获得纯度达99%且具有活性的中性粒细胞，同时还能获得较高含量的蛋白质。采集10毫升血液至采血管中。轻轻颠倒混匀7到8次。

将10毫升血液转移至50毫升锥形管中。向血液中加入100微升EDTA储存液1（0.1摩尔EDTA PBS溶液），轻轻混匀。向全血样本中加入500微升分离试剂盒中的分离混合液（每毫升血液加入50微升），来自中性粒细胞分离试剂盒。

使用中性粒细胞分离试剂盒中的磁珠前，先将磁珠涡旋振荡30秒，以重悬极细小的磁珠。向血液样本中加入500 µL磁珠，通过轻轻翻转离心管数次进行混匀。室温孵育5分钟。

用EDTA储存液2将试管补至50毫升，得到1毫摩尔/升EDTA PBS溶液。轻轻吹打混匀2到3次。

将试管放入磁铁中，并取下管盖以避免后续操作中试管晃动。室温孵育10分钟。小心吸取含有中性粒细胞的富集细胞悬液，转移至新的50毫升锥形管中。

不要触碰与磁铁接触的管壁，并避免收集和扰动管底的红细胞。在管底留下约10毫升红细胞悬液。使用前将磁珠涡旋振荡30秒，并向含有富集中性粒细胞的管中加入0.5毫升磁珠。

轻轻翻转离心管混匀。室温孵育5分钟。将离心管放入磁力架中，并取下管盖以避免后续震荡。

在室温下孵育五分钟。小心地将含有中性粒细胞的富集细胞悬液用移液器转移至新的50毫升锥形管中。切勿触碰与磁铁接触一侧的管壁。

在离心管底部保留约五毫升的悬液。为确保从细胞混合物中完全去除磁珠，将含有富集细胞的离心管置于磁力架中，室温孵育10分钟。

将含有纯化中性粒细胞的富集细胞悬液小心地用移液器转移至新的50毫升锥形管中。切勿触碰与磁铁接触一侧的管壁。在管底留下约5毫升的悬液。

用1毫摩尔EDTA储存液2补足分离的细胞，终体积约为41毫升。用移液器吹打混匀。将溶液等分为两管，每管约20毫升。

将两个离心管在335G条件下离心五分钟。离心过程中，从-80摄氏度冰箱中取出MLi-2抑制剂储备液（200微摩尔/1000倍浓度），置于室温下以备后续使用。离心结束后立即进行操作，不要振荡离心管，小心倾倒上清液，避免扰动中性粒细胞沉淀。

在室温下，用移液器轻轻吹打细胞4次，将每份细胞沉淀重悬于10毫升细胞培养基中。标记其中一管为DMSO，另一管为MLi-2。向标记为DMSO的管中加入10微升DMSO，向标记为MLi-2的管中加入10微升200微摩尔的MLi-2储备溶液，轻轻吹打混匀。

将样品在室温下孵育30分钟。孵育期间每10分钟轻轻颠倒混匀一次。在30分钟LRRK2激酶抑制剂处理期间，从−80°C冰箱中取出0.5摩尔的DIFP储备液，置于冰上并放入通风橱中。

然后，将一毫克每毫升的微囊藻毒素-LR 储存液从负80摄氏度冰箱中取出，置于室温下解冻。从冰箱中取出0.25毫升裂解缓冲液，于室温下解冻后，再置于冰上以备后续使用。配制一毫升含一微升DMSO的RPMI培养基，将其称为DMSO重悬缓冲液。

准备1毫升含1微升200微摩尔MLi-2或替代性LRRK2激酶抑制剂的RPMI培养基，并将此溶液称为MLi-2重悬缓冲液。30分钟孵育结束后，同前，将两个管在335×g下离心5分钟。小心弃去每管中的上清液，避免扰动中性粒细胞沉淀。

对于标记为 DMSO 的试管，用一毫升 DMSO 重悬缓冲液轻轻重悬沉淀。对于标记为 MLi-2 的试管，用一毫升 MLi-2 重悬缓冲液重悬沉淀。将重悬后的细胞沉淀转移至相应标记为 DMSO 和 MLi-2 的离心管中，并在 335×g 下离心 3 分钟。

离心步骤期间，准备裂解缓冲液。在通风橱中，向 0.25 毫升裂解缓冲液中小心加入 0.25 微升 0.5 摩尔的 DIFP 溶液以及 0.25 微升 1 毫克/毫升的微囊藻毒素-LR。混匀后置于冰上，待用。

离心结束后，立即用移液器小心且彻底地吸除所有上清液，避免扰动中性粒细胞沉淀，将离心管置于冰上。立即向每根离心管中加入 100 µL 含 DIFP 和微囊藻毒素-LR 的裂解缓冲液。使用 100 至 200 µL 移液器，通过上下吹打约 5 至 10 次，重悬细胞沉淀。

将细胞置于冰上 10 分钟。然后在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心 15 分钟，以去除细胞碎片。将含有中性粒细胞裂解物的 DMSO 和 MLi-2 上清液转移至新的离心管中。

弃去碎片沉淀。中性粒细胞裂解物现可直接使用，或可置于液氮中速冻后于-80 °C保存以供后续分析。根据公开可用的导入数据库中的数据，该图显示LRRK2和Rab10蛋白在人外周血中性粒细胞和单核细胞中丰度特别高。

采用此方法分离人外周血中性粒细胞可获得较高但不纯的细胞得率。上方表格显示了从三位健康供体各10毫升外周血中分离得到的细胞总数。同时列出的还有分离细胞的纯度和活力，以及总蛋白裂解物的得率。

在使用或不使用LRRK2激酶抑制剂MLi-2处理后，中性粒细胞在强效蛋白酶抑制剂DIFP存在下被裂解。左侧图B中，每泳道上样10微克全细胞提取物，并用指定抗体进行多重定量免疫印迹分析。右侧图C表明DIFP在防止蛋白水解降解（特别是大分子量LRRK2蛋白）方面具有重要作用。

相比之下，单独使用高浓度PMSF的效果较差。结果显示，在携带杂合VPS35 D620N突变的遗传性帕金森病患者的外周血中性粒细胞中，由LRRK2调控的Rab10磷酸化水平较对照组显著升高约三倍。上方图为多重免疫印迹分析结果，下方图为相应定量结果。

这表明VPS35 D620N突变通过一种尚未明确的机制激活了LRRK2激酶通路活性。综上所述，我们介绍了一种简便且稳健的检测方法，通过检测人外周血来源中性粒细胞中Rab蛋白（如Rab10）的磷酸化水平来测量LRRK2激酶通路活性，该方法使我们能够评估LRRK2通路活性，并确定突变、疾病状态或抑制剂如何调节LRRK2通路活性。