Name: 利用微阵列研究微环境对癌症细胞表型的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学习使用微环境微阵列（MEMA）平台研究肿瘤微环境对癌细胞表型的影响。该方法通过定义明确的微环境条件，帮助研究人员识别驱动肿瘤细胞行为的关键因素，并可应用于干细胞等非癌症系统。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本手稿中的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）共同基金细胞信号网络文库（LINCS）U54资助项目HG008100（J.W.G.、L.M.H.和J.E.K）以及国家癌症研究所（NCI）癌症系统生物学联盟（CSBC）U54 CA209988资助项目（J.W.G.、L.M.H.和J.E.K）的支持。

注意：整个 MEMA 流程的概述（包括预计时间）如图1所示的流程图中所示。本方案详细描述了在8孔板中制备 MEMA 的方法。该方案可调整用于其他孔板或载玻片。
1. 蛋白质、稀释液和染色缓冲液的制备
<ol>
	<li>将细胞外基质（ECMs）、配体和细胞因子的小瓶平衡至室温（RT），并短暂离心。根据产品数据表中的说明，加入适当体积的相应室温缓冲液。遵循制造商关于储存浓度的建议。 
	注意： 配体和细胞外基质的完整列表及其储存浓度和终浓度见表1和表2。配体和细胞外基质通常使用制造商推荐范围内能够诱导标准2天&#160;培养实验中产生生物学效应的最高浓度。操作蛋白质时应轻柔，并在层流生物安全柜中进行，以避免污染。</li>
	<li>在室温下轻轻摇动孵育小瓶1小时。切勿涡旋蛋白质，以免引起变性。</li>
	<li>为长期储存分装蛋白质，确保每份均为一次性使用，以避免因反复冻融循环导致的降解。除非另有说明，冻干蛋白质应储存于-80 °C，直至使用。注意收集所有元数据以供将来参考，包括：(i) 蛋白质名称，(ii) 制备日期，(iii) 批号/批次号，(iv) 供应商，(v) 目录编号，(vi) 浓度，(vii) 体积，以及 (viii) 制备者。</li>
	<li>制备含20% (v/v) 甘油、10 mM EDTA、200 mM Tris-HCl（pH 7.2）的稀释缓冲液，并过滤除菌。保持该缓冲液无菌，并在室温下储存。</li>
	<li>制备染色缓冲液，成分为磷酸盐缓冲液（PBS）中含2% (w/v) BSA、1 mM MgCl2 和 0.02% NaN3。过滤后于4 °C储存。</li>
</ol>
2. 细胞外基质来源板的制备
<ol>
	<li>取出需打印的细胞外基质（ECM）蛋白分装样品，置于冰上解冻。记录所有批号以用于元数据追踪。</li>
	<li>轻轻弹动已解冻的蛋白管，确保充分重悬，随后在离心机中离心沉淀。</li>
	<li>配制用于液体处理机器人的ECM打印混合物（EPM）及荧光定位标记，该机器人将用于制备随机化的384孔源板。 
	注意： 384孔源板将由接触式点样阵列打印机用于在8孔板中生成打印阵列。
	<ol>
		<li>为每种EPM及定位标记分别标记1.5 mL微量离心管。</li>
		<li>通过将125 µL稀释缓冲液（见步骤1.4）与适量ECM蛋白原液混合，并用PBS补足至总体积250 µL，配制每种EPM。每种EPM管中的终浓度为1x ECM蛋白、5 mM EDTA、10%甘油和100 mM Tris。</li>
		<li>按照生产商指定的缓冲液溶解荧光定位标记，并将250 µL转移至已标记的定位标记管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用液体处理仪制备源板
<ol>
	<li>设计一个384孔板布局，随机化细胞外基质（ECM）的位置，并优化以适配所用阵列打印机的针头。设计定位标记（fiducial）的位置，使其打印在每孔的第1行第1列位置，以辅助阵列方向定位。 
	注意：每种ECM使用14−15个重复，以确保数据的可靠性。额外增加胶原蛋白或其他能产生强附着效果的ECM的重复数，用于评估结合的均匀性。根据感兴趣的ECM种类数量，布局可能需要使用多个384孔板。</li>
	<li>将EPM管转移至液体处理仪中，并通过冷却管架或在低温室内使用液体处理机器人，保持管内温度为4 °C。</li>
	<li>使用液体处理仪的软件运行程序，将每种EPM和定位标记各15 µL转移至384孔源板中预先指定的孔位。</li>
	<li>向所有未使用的孔中加入PBS，以提高湿度，防止打印过程中样品干燥。 
	注意：参见图2，了解一个优化用于4×7针头的384孔源板设置示例，其中包含I型胶原区块和PBS。</li>
	<li>密封板子，并在4 °C保存，直至准备进行打印。</li>
</ol>
4. 使用阵列打印机器人打印 MEMA
注意：本方案的以下部分详细描述了MEMA的制备及其用于研究不同微环境蛋白对MCF7细胞生长和增殖影响的方法。然而，该方案可轻松调整，以使用不同的配体、细胞外基质（ECM）和细胞，从而研究其他细胞系及感兴趣的实验终点。
<ol>
	<li>使用接触式点样打印机，将EPM和定位标记点印制到8孔板中。每种ECM条件需打印多个重复，以确保可重复性。 
	注意：也可使用其他板型或载玻片进行打印，但可能需要优化缓冲液以获得最佳的点样形态。
	<ol>
		<li>使用直径为350 µm的点样针，以4 × 7的打印头排列方式，为MEMA打印ECM。在8孔板中以20列 × 35行的格式打印微阵列，共约700个点。虽然在这些板中可打印更大的阵列，但会增加细胞结合和染色过程中的边缘效应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打印完成后，将板置于干燥器中，至少保存3天后再使用。</li>
</ol>
5. 配体处理板的制备
<ol>
	<li>设计一个96孔板布局，包括感兴趣的配体。为了便于同时处理多个MEMA板，请设计该板的孔间距，使得可以使用带有4个间隔吸头的多通道移液器在8孔MEMA板与96孔板的孔之间转移液体。 
	注意：在本方案中，使用了表2中列出的全部配体。</li>
	<li>将配体置于冰上解冻。轻轻弹动并短暂离心每根管子。</li>
	<li>使用生产商推荐的缓冲液（通常为PBS）将配体稀释至200倍工作浓度。</li>
	<li>将每种200倍浓度的配体储备液各取10 µL，加入96孔板中对应的孔内。</li>
	<li>密封后于-20 °C保存。 
	注意：应批量制备配体处理板，并记录所有元数据以供后续分析。</li>
</ol>
6. 在 MEMA 上培养细胞
<ol>
	<li>用每孔2 mL含1%抗污染封闭剂（材料表）的非污染性封闭缓冲液，在去离子水（ddH2O）中封闭MEMA 20分钟。</li>
	<li>吸除封闭缓冲液，并用PBS洗涤孔三次。为防止干燥，最后一次洗涤后在孔中保留PBS，直至准备进行细胞接种。 
	注意：在MEMA上进行细胞培养步骤时，由两名实验人员协同操作极为有利。一名实验人员负责吸液操作，另一名负责加液操作。建议使用通道间距与8孔板匹配的1 mL多通道移液器进行加样，使用带有两个巴斯德吸管的Y型分流器同时吸取多个孔中的液体。</li>
	<li>每孔接种2 × 105个MCF7细胞，接种体积为2 mL含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。 
	注意：在正式开展完整的MEMA实验前，应先进行细胞滴定实验，以优化细胞接种数量，确保在目标实验周期结束时，MEMA斑点上的细胞数量较高但未达到汇合状态。</li>
	<li>细胞贴壁2−18小时后，吸除培养基，更换为2 mL低生长培养基（含0.1% FBS的DMEM）。 
	注意：此时可采用低血清（例如0.1% FBS）或去除生长因子的培养条件，以单独评估特定配体的刺激作用。</li>
	<li>将配体处理板置于冰上解冻。解冻后以200 × g 离心1分钟。</li>
	<li>从培养板的每个孔中转移200 µL培养基至处理板中对应的孔。上下吹打混匀配体与培养基，再将混合液转移回MEMA板中对应的孔。</li>
	<li>手动轻轻摇动MEMA板，随后将其放回培养箱。在37 °C、5% CO2条件下，继续在配体/细胞外基质（ECM）组合存在下培养至实验所需时长。 
	注意：典型的MEMA实验持续72小时；更长时间的实验可能需要更换培养基并重新添加配体。</li>
	<li>在71小时时，向MEMA各孔加入100倍稀释的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU），使终浓度为10 µM。在实验条件下（37 °C、5% CO2）继续孵育1小时。 
	注意：此时也可使用其他活细胞处理方法。</li>
</ol>
7. 固定和染色 MEMA
<ol>
	<li>72 小时后以及任何活细胞处理结束后，吸去孔内液体。每孔加入 2 mL 2% 多聚甲醛（PFA）固定 MEMA，室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>吸去 PFA。每孔加入 2 mL 0.1% 非离子型表面活性剂&#160;，室温孵育 15 分钟以进行透化处理。</li>
	<li>吸去非离子型表面活性剂，每孔用 2 mL PBS 洗涤一次，吸去 PBS 后，再用含 0.05% 吐温 20（PBS-T）的 PBS 洗涤一次，每孔 2 mL。 
	注意： MEMA 表面具有疏水性，若在染色和抗体孵育前未使用 PBS-T 洗涤，孵育过程中孔内将产生空隙，导致染色伪影。</li>
	<li>吸去 PBS-T。加入 EdU 检测试剂。室温避光振荡孵育 1 小时。孵育 1 小时后，使用随试剂盒提供的商品化淬灭缓冲液终止反应。 
	注意： 为降低成本，EdU 检测及染色/抗体步骤可每孔使用 1.5 mL 试剂。</li>
	<li>吸去淬灭缓冲液，在加入染料或抗体孵育前，用 PBS-T 洗涤一次。</li>
	<li>将 MEMA 孔板与组蛋白 H3K9me3 抗体（1:1,000）和 fibrillarin 抗体（1:400）在染色缓冲液（含 2% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）、1 mM MgCl2 和 0.02% NaN3）中 4 °C 过夜孵育。 
	注意： 在将抗体用于完整的 MEMA 实验前，应先进行抗体滴定实验以确定最佳浓度。</li>
	<li>一抗或染料孵育结束后，用 PBS 洗涤两次，每次每孔 2 mL，再用 PBS-T 洗涤一次。</li>
	<li>加入二抗（驴抗小鼠 IgG 和驴抗兔 IgG，均为 1:300）以及 0.5 µg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。室温避光孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤两次，每次每孔 2 mL，最后一次洗涤后保留 2 mL PBS。</li>
	<li>立即进行成像，或在 4 °C 避光条件下将染色后的 MEMA 保存于 PBS 中以备后续成像使用。</li>
</ol>
8. MEMA的成像
<ol>
	<li>使用配备适当荧光检测通道的自动化成像系统对 MEMA 进行成像。</li>
	<li>将获得的图像数据输出至图像管理系统，利用 CellProfiler8 对细胞进行分割并计算荧光强度水平。</li>
</ol>
9. 数据分析
注意：数据分析包括对由 CellProfiler 获得的原始数据进行归一化、变异校正和汇总。在此示例中，使用 R 环境配合自定义代码完成所有步骤。然而，也可使用任何其他统计环境或软件程序执行等效操作。用于 R 环境分析的开源自定义代码示例可访问：https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486。
<ol>
	<li>对分割的图像数据进行预处理和标准化。</li>
	<li>利用DAPI染色的细胞核确定每个点中的细胞数量。</li>
	<li>自动设门EdU荧光强度，将细胞标记为EdU+。通过每个点中EdU+细胞的比例来评估增殖情况。</li>
	<li>在点水平上对细胞质染色和细胞核形态学测量指标进行中位数汇总。</li>
	<li>对数据执行去除不必要变异（RUV）标准化，以提高数据质量9。 
	注意：该方法针对每种强度和形态学信号独立应用，以矩阵形式处理，其中行代表阵列行，列代表点，具体方法如前所述9。</li>
	<li>对RUV标准化后的残差应用双变量loess标准化，以阵列行和阵列列为独立变量，校正空间位置或强度相关效应。</li>
	<li>完成标准化后，对每种微环境条件下重复样本的测量值进行中位数汇总，用于报告和进一步分析。</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>LaBarge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).</li>
<li>Watson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-Mediated+Mechanisms+of+Resistance+to+HER2+Inhibitors+Differ+between+HER2%2B+Breast+Cancer+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes.</a> Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).</li>
<li>Ranga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+niche+microarrays+for+systems-level+analyses+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate.</a> Nature Communications. 5, 4324(2014).</li>
<li>Malta, D. F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+microarrays+to+study+inductive+signaling+for+endoderm+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification.</a> Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGagnon-Bartsch%2C+JA+%22University+of+California%2C+Berkeley%2C+Department+of+Statistics%2C+University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley</a>. , Report No. 820 (2013).</li>
<li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMERO%3A+flexible%2C+model-driven+data+management+for+experimental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiated+state+of+normal+and+malignant+cells+or+how+to+define+a+%22normal%22+cell+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture.</a> International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).</li>
<li>Serban, M. A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+extracellular+matrices%3A+solutions+for+the+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle.</a> Methods. 45 (1), 93-98 (2008).</li>
<li>Kaylan, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+lung+tumor+cell+drug+responses+as+a+function+of+matrix+context+and+genotype+using+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays.</a> Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).</li>
<li>Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Microenvironments+Impose+a+Continuum+of+Cellular+Responses+to+a+Single+Pathway-Targeted+Anti-cancer+Compound%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound.</a> Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

“&#34;维度”和微环境背景的重要性一直是推动体外培养系统发展的关键因素，该系统被用作通过癌细胞与微环境相互作用来表征癌细胞的工具11；同时，体外培养系统模拟体内环境的能力，也是推动人们不断改进这些培养系统的动力。然而，体外系统之所以仍然是癌症研究的重要工具，正是因为它能够将复杂的体内情况简化为一个简化的模型12。
尽管二维系统可以包含细胞外基质（ECM）和配体，但传统上其通量能力有限，难以对大量组合性扰动因子进行系统性研究。市面上常用的商业 Basement Membrane Extracts 虽支持三维培养，但其蛋白质组成缺乏明确的定义。这些商业提取物通常存在成分未完全明确的问题，可能干扰实验分析，并导致显著的批间差异3,13。MEMA 平台克服了这些障碍，能够研究特定且明确定义的内源性因子调控下，细胞表型变化、代谢活性、分化状态以及细胞生长与增殖差异。
<...

在塑料表面进行二维（2D）单层培养癌细胞系，仍是癌症研究人员的主要实验手段之一。然而，微环境对细胞表型的影响正日益受到重视。在癌症中，肿瘤微环境已被证实可影响多种细胞行为，包括生长、存活、侵袭以及对治疗的反应1,2。传统的单层细胞培养通常缺乏微环境的影响，这促使了更为复杂的三维（3D）细胞培养检测方法的发展，其中包括 commercially available purified basement membrane extracts（商品化的纯化基底膜提取物）。然而，这些纯化基质通常使用复杂，并存在批次间差异3和成分复杂3等技术问题。因此，很难将特定蛋白质的功能归因于其对细胞表型的潜在影响3。
为解决这些局限性，我们开发了微环境微阵列（microenvironment microarray, MEMA）技术，该技术将微环境简化为细胞外基质（extracellular matrix, ECM）与可溶性生长因子蛋白的简单组合4,5。MEMA 平台能够识别影响细胞行为的关键微环境因子。通过采用阵列形式，可在单次实验中检测数千种微环境因子的组合。本文所述的 MEMA 检测了约 2,500 种不同且独特的微环境条件。将 ECM 蛋白点样至孔板中形成细胞生长垫，用于培养细胞。向各个孔中加入可溶性配体，从而在每个不同的位点上形成独特的组合微环境（ECM + 配体），使细胞暴露于其中。细胞培养数天后，进行固定、染色和成像，以评估特定微环境组合对细胞表型的影响。由于微环境为简单的组合形式，因此可直接识别驱动细胞发生显著表型变化的蛋白质。MEMA 已被成功用于鉴定影响多种细胞表型的因子，包括调控细胞命运决定及治疗反应的因子4,5,6,7。这些响应可在简单的二维实验中进行验证，随后可在更充分模拟肿瘤微环境复杂性的条件下进一步评估。只要存在可靠的表型生物标志物，MEMA 平台即可高度适配于多种细胞类型和检测终点。

<table><tbody><tr><td>Aushon 2470</td><td>Aushon BioSystems</td><td></td><td>本方案中使用的阵列机器人系统</td></tr><tr><td>Nikon HCA</td><td>Nikon</td><td></td><td>基于Nikon Eclipse Ti倒置显微镜设计的高内涵成像系统</td></tr><tr><td>BioTek Precision XS液体处理仪</td><td>BioTek</td><td></td><td>本方案中使用的液体处理机器人</td></tr><tr><td>Trizma盐酸缓冲液</td><td>Sigma</td><td>T2069</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Kolliphor P338</td><td>BASF</td><td>50424591</td><td></td></tr><tr><td>384孔微阵列板，圆柱形孔</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab1055</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 8孔培养皿</td><td>Thermo Fisher</td><td>267062</td><td></td></tr><tr><td>16%多聚甲醛溶液</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher</td><td>BP-1600</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cell Mask</td><td>Molecular Probes</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>Click-iTEdU Alexa Fluor</td><td>Molecular Probes</td><td>C10357</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Promo Kine</td><td>PK-CA70740043</td><td></td></tr><tr><td>ALCAM</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>656-AL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>钙黏蛋白-20 (CDH20)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>5604-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>钙黏蛋白-6 (CDH6)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>2715-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>钙黏蛋白-8 (CDH8)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>188-C8</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CD44</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>3660-CD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CEACAM6</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>3934-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>Cultrex</td><td>3442-050-01</td><td>ECM</td></tr><tr><td>II型胶原蛋白</td><td>Millipore</td><td>CC052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>III型胶原蛋白</td><td>Millipore</td><td>CC054</td><td>ECM</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>ECM</td></tr><tr><td>V型胶原蛋白</td><td>Millipore</td><td>CC077</td><td>ECM</td></tr><tr><td>COL23A1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>4165-CL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>桥粒芯糖蛋白-2</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>947-DM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白 (CDH1)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>648-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ECM1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>3937-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>1918-FN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>GAP43</td><td>Abcam</td><td>ab114188</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-500K</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>GLR002</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-50K</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>GLR001</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>720-IC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L6274</td><td>ECM</td></tr><tr><td>层粘连蛋白-5</td><td>Abcam</td><td>ab42326</td><td>ECM</td></tr><tr><td>发光蛋白</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>2846-LU</td><td>ECM</td></tr><tr><td>M-钙黏蛋白 (CDH15)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>4096-MC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>网硬蛋白-1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>2570-ND</td><td>ECM</td></tr><tr><td>骨粘连蛋白/OSAD</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>2884-AD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>骨桥蛋白 (SPP)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>1433-OP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>P-钙黏蛋白 (CDH3)</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>861-PC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>ADP6</td><td>ECM</td></tr><tr><td>腱生蛋白-C</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>3358-TC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>VCAM1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>ADP5</td><td>ECM</td></tr><tr><td>玻璃粘连蛋白</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>2308-VN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>双糖链蛋白聚糖</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>2667-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>核心蛋白聚糖</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>143-DE</td><td>ECM</td></tr><tr><td>骨膜蛋白</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>3548-F2</td><td>ECM</td></tr><tr><td>SPARC/骨粘连蛋白</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>941-SP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>血小板反应蛋白-1/2</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>3074-TH</td><td>ECM</td></tr><tr><td>脑聚糖</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>4009-BC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>弹性蛋白</td><td>BioMatrix</td><td>5052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>原纤维蛋白</td><td>Lynn Sakai 实验室 OHSU</td><td>N/A</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ANGPT2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>623-AN-025</td><td>配体</td></tr><tr><td>IL1B</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>201-LB-005</td><td>配体</td></tr><tr><td>CXCL8</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>208-IL-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>291-G1-200</td><td>配体</td></tr><tr><td>TNFRSF11B</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>185-OS</td><td>配体</td></tr><tr><td>BMP6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>507-BP-020</td><td>配体</td></tr><tr><td>FLT3LG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>308-FK-005</td><td>配体</td></tr><tr><td>CXCL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>275-GR-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>DLL4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1506-D4-050</td><td>配体</td></tr><tr><td>HGF</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>294-HGN-005</td><td>配体</td></tr><tr><td>Wnt5a</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>645-WN-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>CTGF</td><td>Life_Technologies_Own</td><td>PHG0286</td><td>配体</td></tr><tr><td>LEP</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>398-LP-01M</td><td>配体</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma_Aldrich_Own</td><td>SRP4037-50UG</td><td>配体</td></tr><tr><td>FGF6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>238-F6</td><td>配体</td></tr><tr><td>IL7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>207-IL-005</td><td>配体</td></tr><tr><td>TGFB1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>246-LP-025</td><td>配体</td></tr><tr><td>PDGFB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>220-BB-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>WNT10A</td><td>Genemed_Own</td><td>90009</td><td>配体</td></tr><tr><td>PTN</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>252-PL-050</td><td>配体</td></tr><tr><td>BMP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>113-BP-100</td><td>配体</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>314-BP-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>TNFSF11</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>390-TN-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>CSF2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>215-GM-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>BMP5</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>615-BMC-020</td><td>配体</td></tr><tr><td>DLL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1818-DL-050</td><td>配体</td></tr><tr><td>NRG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>296-HR-050</td><td>配体</td></tr><tr><td>KNG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1569-PI-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>GPNMB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>2550-AC-050</td><td>配体</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>350-NS-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>IL15</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>247-ILB-005</td><td>配体</td></tr><tr><td>肿瘤坏死因子</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>210-TA-020</td><td>配体</td></tr><tr><td>IGFBP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>675-B3-025</td><td>配体</td></tr><tr><td>WNT3A</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>5036-WNP-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>PDGFAB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>222-AB</td><td>配体</td></tr><tr><td>AREG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>262-AR-100</td><td>配体</td></tr><tr><td>JAG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1277-JG-050</td><td>配体</td></tr><tr><td>BMP7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>354-BP-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>TGFB2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>302-B2-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>VEGFA</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>293-VE-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>IL6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>206-IL-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>351-FS-010</td><td>配体</td></tr><tr><td>NRG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>378-SM</td><td>配体</td></tr><tr><td>IGFBP2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>674-B2-025</td><td>配体</td></tr><tr><td>SHH</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1314-SH-025</td><td>配体</td></tr><tr><td>FASLG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>126-FL-010</td><td>配体</td></tr></tbody></table>

利用微阵列技术探究肿瘤微环境对细胞表型的影响

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

理解微环境对细胞表型的影响是一个难题，因为在体内微环境中存在可溶性生长因子和基质相关蛋白的复杂混合物。此外，目前常用的体外微环境建模试剂通常依赖成分复杂且未完全明确的蛋白质混合物，且存在批次间差异的问题。微环境微阵列（MEMA）平台能够在单次实验中评估数千种简单的微环境蛋白组合对细胞表型的影响。MEMA在孔板中制备，可在含有阵列化细胞外基质（ECM）蛋白的不同孔中分别加入单独的配体。每种可溶性配体与打印的ECM组合形成独特的微环境组合。一次典型的MEMA实验可在单次检测中使细胞暴露于超过2,500种不同的组合微环境中。以乳腺癌细胞系MCF7作为测试案例，在MEMA平台上进行培养。对该实验的分析鉴定出能够促进或抑制这些细胞生长与增殖的多种因子。MEMA平台具有高度灵活性，可拓展应用于癌症研究以外的其他生物学问题。

为了简化微环境对细胞生长和增殖的影响，并鉴定促进或抑制细胞生长和增殖的条件，按照本实验方案所述，将乳腺癌细胞系 MCF7 接种于一组八联 8 孔 MEMA 上。该检测使细胞暴露于 48 种不同的细胞外基质（ECM）和 57 种不同的配体，共组合成 2736 种微环境条件。细胞培养 71 小时后，加入 EdU 进行脉冲标记，随后固定、透化，并用 DAPI、EdU 检测试剂、抗 fibrillin 抗体和抗 H3K9me3 抗体进行染色。利用高内涵显微镜对细胞成像。图像上传至 Omero 服务器10，使用 CellProfiler8 进行图像分割，并在 R9 中进行标准化和分析。下述结果主要聚焦于 DAPI 和 EdU 信号。
MEMA 的图像分析平台可产生一些与流式细胞术方法相似的结果，例如基于 DAPI 荧光强度和面积，显示经特定配体处理后细胞中 2N 和 4N 亚群的 DNA 含量图谱（图 3</...

本文所述方法的目的是展示如何制备微环境微阵列（MEMA），并利用其研究数千种简单组合微环境对培养细胞表型的影响。

理解微环境对细胞表型影响的问题因可溶性生长因子与……的复杂混合而变得困难

由于肿瘤微环境具有复杂性，对其进行研究十分困难。我们开发了微环境微阵列（MEMA），该阵列由简单的组合式微环境构成，可用来识别驱动肿瘤细胞表型的主要因素。MEMA 平台的主要优势在于，由于所有微环境条件均被明确定义，因此能够直接鉴定出驱动特定表型的微环境因子。MEMA 平台在其他非癌症系统中具有广泛的应用性，包括原代细胞株和干细胞。我们开发了多种工程技巧和步骤，以加快湿实验操作并简化实验方案。首先，使用接触式点样打印机将细胞外基质打印混合物点样到八孔板的定位标记位点上。使用直径为350微米的针头，以四乘七的打印头配置，在微环境微阵列（MEMAs）上打印细胞外基质。胶原蛋白块以网格形式打印到MEMAs上。含有PBS的孔提供额外湿度，防止细胞外基质打印混合物源板干燥。在八孔板中以20列×35行的形式打印阵列，共700个点。打印后，将板置于干燥器中至少存放三天，方可使用。首先，设计一个96孔板的布局，其间距应允许使用带有四个间隔吸头的多通道移液器，以便可同时处理多个MEMA板。然后从冷冻机中取出配体，在超净工作台中的冰上解冻。轻轻弹击并短暂离心每个离心管。使用生产商推荐的缓冲液将配体稀释至200倍工作浓度。用移液器将每种200倍配体储备液各10微升加入96孔板中对应的孔内。使用封板膜密封96孔板，并于-20摄氏度保存。配体处理板应分批制备，并记录所有元数据以供下游分析使用。在培养细胞之前，每孔加入两毫升防非特异性吸附的封闭缓冲液，封闭20分钟。使用带有两根巴斯德吸管的Y型分流器，可同时吸除多个孔中的封闭缓冲液，随后用PBS洗涤三次。为防止孔内干燥，在准备接种细胞前，保留最后一次PBS洗涤液于孔内。在进行完整的 MEMA 实验之前，通过细胞滴定实验优化 MCF7 细胞的接种浓度。理想的点样区域应具有足够的细胞数量以提取数据，但又不能过多，以免区域过度融合。在 MEMA 中，吸除残留的 PBS，并在 2 毫升接种培养基中每孔接种 30,000 至 35,000 个 MCF7 细胞。将 MEMA 置于 37 摄氏度的培养箱中。在培养箱中孵育过夜后，吸除培养基，并更换为两毫升的低浓度生长培养基，以分离特定配体的刺激作用。随后将预先冷冻的配体处理板置于冰上解冻。将解冻的培养板在200 × g离心1分钟。从MEMA培养板的每个孔中转移200 µL培养基至配体处理板中相应的孔。用移液器吹打混匀配体与培养基，然后将此混合液转移回MEMA培养板中相应的孔。用手轻轻摇动，然后将 MEMA 板放回培养箱中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下培养配体-ECM 组合。71 小时后，向 MEMA 孔中加入 100 倍体积的 EdU，使其终浓度为 10 微摩尔。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下继续孵育 1 小时。最后一次孵育后，吸出各孔中的液体。每孔加入2毫升2%多聚甲醛（PFA），室温下固定15分钟。然后吸出孔中的PFA溶液。每孔加入2毫升0.1%非离子型表面活性剂，室温孵育15分钟进行透化处理。吸除表面活性剂，随后每孔依次加入2毫升PBS和PBS-T洗涤。然后，每孔加入1.5毫升EdU检测反应试剂。室温下孵育一小时，期间轻轻振荡并避光。然后每孔加入1.5毫升商用淬灭缓冲液终止反应。再次吸去液体，用PBS-T洗涤，随后加入优化浓度的染料或抗体进行孵育。将MEMA孔板与一抗在染色缓冲液中孵育，于4摄氏度轻轻摇动过夜。一抗孵育结束后，用PBS洗涤孔板，随后用PBS-T洗涤。将二抗用染色缓冲液稀释后加入，终浓度为0.5微克/毫升DAPI。室温避光振荡孵育一小时。用 PBS 洗涤两次，每次每孔 2 毫升，并在最后一次加入 2 毫升 PBS 后保留。为成像染色后的 MEMA，将其置于配备适当荧光检测通道的自动成像系统的显微镜载物台上。将生成的图像数据输出至图像管理系统。使用 CellProfiler 对细胞进行分割并计算荧光强度水平。在本方案中，一个八孔板中按区间分组的 DAPI 强度值与细胞计数所绘制的细胞周期分布图，可指示处于 G1 期与 G2 期的细胞。这对应于处于早期生长期细胞中的两份核DNA含量，以及即将进行有丝分裂的细胞中的四份核DNA含量。图中展示了配体和细胞外基质（ECM）微环境对细胞数量和EdU掺入的影响。红色表示较高的细胞数量，蓝色表示较低的细胞数量。许多效应是由配体驱动的，因为细胞外基质（ECM）条件对细胞数量或EdU阳性率影响不大。Natagen 1 是一个明显例外，该ECM分子的存在会抑制MCF7细胞的黏附和生长。诸如FGF6和神经调节蛋白-1α之类的配体可增加细胞数量，并具有较高的EdU掺入率，而诸如双调蛋白和神经调节蛋白-1 SMDF之类的配体则会抑制细胞的黏附和生长。在经神经调节蛋白-1α处理的MEMA位点上生长的MCF7细胞示例显示EdU掺入率较高，表现为粉红色细胞核。该图像中，绿色染色为细胞膜标记，蓝色为DAPI染色。由于完整的MEMA实验成本较高，因此在开展完整实验前进行优化步骤（如细胞和血清滴定）至关重要。一旦利用MEMA平台确定了感兴趣的微环境条件，便可借助传统的二维和三维细胞培养系统对特定的配体和细胞外基质蛋白进行更深入的研究。

using-microarrays-to-interrogate-microenvironmental-impact-on

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

利用微阵列研究微环境对癌症细胞表型的影响

本文描述了一种组合功能性筛选方法，用于深入了解微环境分子组成对细胞功能的影响。该方法利用现有的基于微阵列的技术，构建支持细胞黏附和功能分析的、具有明确组合特征的微环境阵列。...

微环境微阵列（MEArrays）的制备与应用

本视频介绍了利用抗体微阵列检测特定基因表达，以研究转染miRNA的肺癌细胞中蛋白质表达水平的技术。在本视频展示的实验方案中，我们采用抗体微阵列来鉴定联合miRNA治疗在抑制细胞周期和血管生成中的活性。...

抗体芯片：一种研究经miRNA处理的肺癌细胞中蛋白质表达的技术

实现对细胞过程的系统水平理解是当代细胞生物学的目标。本文介绍了利用全基因组规模的RNA干扰文库，通过多重荧光素酶报告系统检测多种细胞功能终点以研究基因功能的策略。...

一种基于多重荧光素酶的筛选平台用于在培养细胞中研究癌症相关信号转导

雌激素和微小RNA（microRNA）的分子信号转导在乳腺癌的发生和发展中至关重要。雌激素可激活作为转录因子的雌激素受体。许多转录因子能够调控微小RNA的表达，而受雌激素调控的微小RNA可通过多种高通量技术进行表达谱分析。...

乳腺癌细胞中雌激素调控的microRNA分析

我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。...

肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

细胞分化受到多种微环境因素的调控，包括基质成分和基底材料特性。本文介绍一种技术，该技术结合细胞微阵列与牵引力显微镜，用于评估在不同微环境背景下细胞的分化状态以及细胞与基底之间的生物力学相互作用。...

一种用于细胞分化与牵引力相关性分析的高通量细胞微阵列平台

本文介绍一种分离和富集已建立的皮下肿瘤中肿瘤免疫及非免疫微环境组分的方法。该技术可分别分析肿瘤免疫浸润细胞和非免疫肿瘤组分，从而实现对肿瘤免疫微环境的全面表征。...

在已建立的小鼠皮下肿瘤中富集与表征肿瘤免疫及非免疫微环境

本文介绍了一种利用抗体芯片检测多种细胞模型中信号通路变化的实验方案。这些变化可由药物、缺氧、紫外光、辐射，或基因过表达、表达下调、基因敲除等因素引起，在多种疾病模型中具有重要意义，有助于判断某种疗法是否有效，或揭示药物耐药的潜在机制。...

利用抗体芯片检测信号转导通路评估对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性

miRNA 治疗在调控癌症进展方面具有重要意义。本文展示了用于鉴定联合 miRNA...

联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析

本文描述了一种动物模型的建立，该模型可用于直接检验肿瘤缺氧对转移的影响，并解析其作用机制。尽管本文所述实验主要针对尤文肉瘤，但类似方法也可应用于其他类型的肿瘤。...

体内 模型用于检测缺氧对肿瘤转移的影响

学习使用微环境微阵列（MEMA）平台研究肿瘤微环境对癌细胞表型的影响。该方法通过定义明确的微环境条件，帮助研究人员识别驱动肿瘤细胞行为的关键因素，并可应用于干细胞等非癌症系统。

利用微阵列技术探究肿瘤微环境对细胞表型的影响

探索更多视频