Name: 与腺相关病毒的向量的生产、纯化和质量控制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习腺相关病毒载体的生产、纯化和质量控制方法，使用HEK细胞转染和碘克沙醇密度梯度超速离心技术。该方案可获得高滴度、高纯度AAV载体，适用于体外和体内基因治疗研究。

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M.R. 获得佛兰德斯科学基金（Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen，FWO）博士后奖学金（133722/1204517N）的支持，并感谢哥伦比亚心血管基金会和科学技术创新行政部（Grant CT-FP44842-307-2016，项目编号 656671250485）的持续支持。M.M. 获得佛兰德斯科学基金（FWO）博士生奖学金（1S48018N）的支持。M.G.H. 获得VIB机构资助以及Thierry Latran基金会（SOD-VIP）、阿尔茨海默病研究基金会（SAO-FRA）（P#14006）、佛兰德斯科学基金（FWO）（Grant 1513616N）和欧洲研究理事会（ERC）（启动资助 281961 - AstroFunc；概念验证资助 713755 - AD-VIP）的外部支持。作者感谢Jeason Haughton在小鼠饲养方面的帮助，Stephanie Castaldo在尾静脉注射操作中的协助，以及Caroline Eykens提供转染的HEK293T细胞图像。M.G.H. 感谢Michael Dunlop、Peter Hickman和Dean Harrison。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的重组腺相关病毒（AAV）载体的制备方法使用了大多数分子生物学实验室和细胞培养设施中常见的材料和设备。该方法可使使用者获得高纯度、适用于临床前研究的AAV载体，可用于靶向多种细胞和组织类型，适用于多种体外（in vitro）和体内（in vivo）应用。与其它方法（例如基于氯化铯的纯化方法）相比，本方案最大的优势之一是所需操作时间更短。在HEK293T细胞初次转染后，最多6个工作日内即可获得可直接使用的AAV载体。
多种因素可能对腺相关病毒（AAV）载体的最终产量或质量产生不利影响。转染效率低下是导致病毒产量低的主要原因之一。33一个主要建议是使用未经传代的 HEK293T 细胞&#160;超过20代，且在转染时细胞汇合度不超过90%21此外，所选择的转染方法对实验结果具有重要影响。本实验方案基于使用PEI。PEI是一种阳离子聚合物，可通过与核酸形成聚合物-核酸复合物（称为polyplexes）将外源DNA递送至细胞核，这些复合物可被细胞摄取&#160;被细胞摄取并转运 通过 内体34PEI介导的转染操作简便快速，与其他常用方法（如DNA与磷酸钙共沉淀法）相比具有明显优势。35此外，与一些新引入的方法（如阳离子脂质转染和磁珠介导转染）相比，基于PEI的转染成本要低得多。36.
纯化策略在本实验方案中起着关键作用。与其他方法相比，基于碘克沙醇的纯化通常含有较高比例的空病毒颗粒（20%）20。然而，这一缺点在一定程度上被以下事实所抵消：基于碘克沙醇的纯化通常可获得粒子与感染性比值低于100的AAV载体制剂。这与传统的基于氯化铯（CsCl）的方法相比具有显著改进，后者据报道会造成病毒粒子感染性的大幅损失37。另一种常见的AAV载体纯化方法是基于层析的纯化。然而，该方法存在一个主要缺点，即每种使用的载体衣壳都需要特定的层析柱：例如，虽然AAV2通常可使用肝素柱进行分离，但该方法不适用于AAV4和AAV5，因为它们的衣壳上缺乏肝素结合位点38。考虑到层析纯化成本也较高，因此对于希望小规模制备高质量AAV载体批次的实验室而言，基于碘克沙醇的纯化通常更为合适33,39,40。然而，为了最大化最终载体的产量和纯度，在制备碘克沙醇梯度时必须格外小心。应使用无菌的巴斯德移液管将不同浓度的碘克沙醇组分转移至超速离心管中，移液管尖端需接触管壁，并缓慢而连续地将碘克沙醇从移液管中排出。由于载体颗粒会聚集在40%碘克沙醇层中，因此必须小心操作以避免梯度界面混合20。最后，应使用规格不超过20 G的不锈钢钝头针插入离心管来回收含有载体的组分。为最大化载体回收率，应完整收集透明组分。在此步骤中，时间控制至关重要。为避免影响制剂纯度，必须在收集到其他（污染性）梯度组分之前停止收集。
所获得的载体&#160;滴度差异也可能归因于载体&#160;自身产生包装&#160;病毒颗粒的内在能力。不同AAV血清型之间的比较表明，某些AAV载体比其他类型（例如AAV2）更难获得高滴度41。在脱盐步骤中载体发生沉淀可能是导致滴度降低的一个原因，可通过避免过度浓缩而轻易避免33。此外，碘克沙醇梯度纯化效率在不同血清型之间也可能存在轻微差异，因此使用不同血清型时所获得的滴度可能出现差异41。
最后需要指出的是&#160;尽管qPCR是一种非常精确的DNA定量方法&#160;该技术本身可能存在一定的固有变异性。滴定结果的准确性主要取决于所有溶液的精确移液和充分涡旋混合。为获得最准确的滴定值，可独立重复进行qPCR检测，并对所得数值取平均值。本方案中所选用的引物基于本实验室所使用的pTransgene质粒中CBA启动子的序列。CBA启动子是一种强效的合成型启动子，在载体领域被广泛用于驱动多种细胞类型的基因表达。该启动子包含多个元件，如巨细胞病毒（CMV）早期增强子元件；CBA基因的启动子、第一外显子和第一内含子；以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体。然而，引物可针对表达盒内的几乎所有元件（包括启动子、目的基因和调控元件）进行设计。只要使用针对不同载体中共有序列区域的引物，即可实现不同批次间滴度的比较。
总之，本方案可用于生产具有多种衣壳、基因组构型和启动子类型的AAV载体&#160;和转基因载体。这将使用户能够轻松调整其载体的最终特性，以最适配实验需求。在代表性结果示例中，使用可高效穿越血脑屏障（BBB）的 PHP.B 衣壳，获得了&#160;尾静脉注射后中枢神经系统中高效的基因表达32中枢神经系统可穿透性载体的全身给药在潜在副作用方面具有显著优势2,17,32一种可能替代外周注射且避免侵入性技术局限性的方法是鞘内给药，该方法包括&#160;将AAV载体递送至脑脊液中。该递送途径已被证实有效，显示出&#160;中枢神经系统内转基因的广泛表达、外周器官脱靶效应较小以及免疫反应水平较低42然而，鞘内注射的难度要大得多，因其所需的技术水平高于尾静脉注射。
进一步优化该技术的衣壳开发将由腺相关病毒（AAV）载体在基因治疗应用中的机遇所推动。这类方法为治疗目前无法治愈的中枢神经系统疾病提供了极具吸引力的可能性，例如肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症&#160;、帕金森病和阿尔茨海默病18。

在过去的30年中，野生型AAV经过改造被用于构建重组AAV载体，这些载体已被证明是向中枢神经系统（CNS）进行基因转移&#160;1,2,3,4,5,6以及开展疾病基因治疗（包括已获美国FDA和欧洲EMA批准的疗法）4,7的极为有用的工具。AAV载体适用于CNS的主要原因在于其能够感染中枢神经系统中常见的非分裂、终末分化细胞8。此外，AAV载体还具有可实现任何特定治疗性转基因长期表达4,9的优势，同时相较于其他病毒载体引发的免疫反应更轻微7,8,10,11,12。
AAV 载体的主要组分是基因组和衣壳。野生型 AAV 是单链（ss）DNA 病毒，其基因组大小约为 5 千碱基（kb）13用于重组AAV载体的生产， rep 和 帽 基因（对基因组复制和病毒衣壳组装至关重要）从野生型 AAV 的基因组中被删除，并另行提供 在转染中，为包含转基因的表达盒预留空间14,15腺相关病毒（AAV）载体中仅保留了原始病毒基因组的反向末端重复序列（ITRs），因为这些序列对于病毒的复制和包装至关重要。3,10,14腺相关病毒载体可经过改造以增强外源基因的表达；其中一个ITR的突变可导致发夹环结构的形成，从而有效促进互补DNA链的合成。3,7,15. 这种构型被称为自互补（sc）基因组，其主要优势在于无需经过&#160;在腺相关病毒（AAVs）传统生命周期中典型的第二条链合成，显著加快了外源基因表达的速度并提高了表达水平1然而，使用scAAV基因组会将载体的载荷容量减少至约2.4 kb，其中包括转基因序列以及启动子或miRNA结合位点等调控序列，以限制在特定细胞类型中表达16.
AAV 衣壳决定了载体与宿主细胞的相互作用，并赋予特定 AAV 血清型一定程度的细胞类型或组织嗜性，这一特性也可被用于将转基因表达限制在特定部位。自然界中存在多种 AAV 血清型，而另一些则通过实验室中的重组技术产生（例如 PHP.B）。此外，某些衣壳还具备其他有益特性，例如能够穿越血脑屏障（BBB），从而在全身给药后实现转基因在整个中枢神经系统（CNS）的递送。这一现象已在 AAV9 以及近期报道的 PHP.B 衣壳中得到证实17。因此，这些血清型在针对&#160;神经退行性疾病1,17,18的新型基因治疗策略中正显示出尤为重要的意义。
本方案旨在介绍一种经济高效的小规模制备高滴度、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的方法。尽管本文展示的结果使用了PHP.B衣壳和scAAV表达盒，但该方案适用于多种AAV载体血清型和基因组构型的制备，具有最大的实验灵活性。然而，载体产量和最终纯度可能因所选血清型的不同而有所差异。
该方案本身是病毒载体生产中经典三重转染方法的一种变体，并结合使用碘克沙醇梯度进行载体纯化。与传统的氯化铯（CsCl）梯度方法相比，该方法已被报道能够以更高效的时间获得纯度更高的腺相关病毒（AAV）载体19,20,21。
转染、纯化&#160;和浓缩步骤应在适用于病毒载体操作的组织培养实验室中，按照良好实验室规范（GLP）进行。&#160;各项操作必须遵守与病毒载体生产及使用相关的当地和国家法律法规。所有工作必须在超净工作台内无菌条件下进行。在病毒载体实验室内，除常规组织培养实验服外，建议穿戴实验围裙，并始终佩戴两副手套以及塑料鞋套。
在开始载体生产之前，确保所有必需的设备和质粒均已备齐。1) pCapsid 质粒包含 rep 编码四种复制所必需的非结构蛋白的基因，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，以及 帽 编码三种结构衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的基因。2）pHelper质粒包含这些基因 E4，E2A，以及 VA 来自腺病毒，可在HEK293T细胞中促进AAV的产生。3) pTransgene质粒包含由两个ITR侧翼包围的转基因表达盒。这些质粒可被合成 从头合成 在实验室中利用在线可获取的序列22用于质粒的制备 从头合成，尤其是含有新转基因的质粒，需要进行测序以确保转基因序列和ITRs正确无误。或者，也可通过在线质粒库直接获取预制质粒。必要时，可根据制造商说明书，使用标准试剂盒对质粒进行扩增和纯化23.
病毒载体滴度和纯度可能对载体的转导能力产生不利影响。另提供相关实验方案以评估所制备载体的质量。最终获得的载体将有助于研究中枢神经系统细胞在体内外的功能 体外 和 体内 应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;质粒制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTransgene 质粒</td><td>&lt;em&gt;从头设计&lt;/em&gt;，或从质粒库中获取</td><td>N/A</td><td>详见主方案第1步</td></tr><tr><td>pCapsid</td><td>&lt;em&gt;从头&lt;/em&gt;设计，或从质粒库中获取</td><td>N/A</td><td>详见主方案第1步</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>质粒&lt;em&gt;Plus&lt;/em&gt;大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>AAV 无辅助病毒系统</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养与转染&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM），高糖，无谷氨酰胺</td><td>Life technologies</td><td>11960-044</td><td>在 DMEM 中添加胎牛血清（FBS，1% 或 10% v/v）和 GlutaMAX 200 mM（1% v/v），然后使用 0.22 &amp;micro;m 滤器过滤除菌</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GIBCO</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>GIBCO</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>(200 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 瓶顶式真空过滤系统</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（DPBS），无钙无镁</td><td>GIBCO</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td>American Tissue Culture Collection</td><td>CRL3216</td><td>收到后立即解冻并按方案所述进行培养。经过最少次数的传代后，将部分细胞分装冻存以备将来使用。&amp;nbsp;始终使用传代次数低于20次的细胞。一旦培养细胞传代超过20次，需从冻存的分装细胞重新开始培养</td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Greiner Cellstar</td><td>639160</td><td>直径15 cm的培养皿</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>VWR</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>将粉末状 PEI 溶于去离子水（&lt;sub&gt;dd&lt;/sub&gt;water）中，配制成 1 &amp;micro;g/&amp;micro;L 的溶液，pH=2（使用 HCl 调节）。在烧杯中配制，搅拌 2–3 小时。溶解后，用 NaOH 将 pH 调回至 7。过滤除菌后，将重悬的储备液分装为 1 mL 每份，于 -20 &amp;deg;C 保存。PEI 分装液可多次冻融</td></tr><tr><td>Virkon 溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9821357</td><td>使用 Virkon 溶液对所有接触过组装病毒载体颗粒的材料进行消毒</td></tr><tr><td>长袖式 Mutexi 防护围裙</td><td>Fisher Scientific</td><td>11735423</td><td>在常规实验服外穿戴围裙</td></tr><tr><td>Fisherbrand 最大防护型一次性鞋套</td><td>Fisher Scientific</td><td>15401952</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AAV 纯化与脱盐&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optiprep 密度梯度介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep 是碘克沙醇在水中的 60%（w/v）溶液（无菌）。注意：在层流罩中操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>注意：在层流罩中操作</td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z627992</td><td>使用前需灭菌</td></tr><tr><td>OptiSeal 聚丙烯管</td><td>Beckman</td><td>361625</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶（250 U/&amp;micro;L）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>以即用型溶液形式提供</td></tr><tr><td>Acrodisc 注射器滤器</td><td>Pall corporation</td><td>4614</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 注射器（5 mL）</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td></td></tr><tr><td>钝头注射器针头</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z261378</td><td>不锈钢 316 注射器针头，移液用钝头 90&amp;deg; 尖端，16 号，长度 4 英寸。文中称为钝端针头</td></tr><tr><td>Aqua Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td>无菌无内毒素水。文中称为“超纯水”</td></tr><tr><td>Amicon ultra-15 离心过滤装置</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td>通过连续离心步骤截留病毒载体颗粒，实现终产物的浓缩</td></tr><tr><td>Pluronic F68（100x）</td><td>Thermo Fisher</td><td>24040032</td><td>非离子型表面活性剂。使用时用无菌 PBS 稀释至 0.01%（v/v）</td></tr><tr><td>Fisherbrand 带螺旋盖的无菌微量离心管（2 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-374</td><td>使用带裙边的管子以便于操作</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AAV 滴定&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶：StuI（10 U/&amp;micro;L）</td><td>Promega</td><td>R6421</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶 I（1 U/&amp;micro;L）</td><td>Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115852001</td><td>用超纯水重悬，使用终浓度为 10 mg/mL。溶液可于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>EasyStrip Plus 管条（带附连盖）</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB2000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微量管 3810x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I 主混合液</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 多孔板，96 孔</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>白色聚丙烯板（带唯一识别条形码）</td></tr><tr><td>Microseal 'A' PCR 板及 PCR 板封膜</td><td>Bio-Rad</td><td>msa5001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AAV 纯度检测&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>用超纯水配制成 10%（v/v）溶液。注意：在层流罩中操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>注意：在层流罩中操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>Tris Base ULTROL 级</td><td>Merck</td><td>648311</td><td>注意：在层流罩中操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Thermo Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&amp;reg; Gel 30（37.5:1）</td><td>Carl Roth</td><td>3029.3</td><td>30% 丙烯酰胺与双丙烯酰胺的水溶液，比例为 37.5:1。注意：在层流罩中操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>Serva Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6104-58-1</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus 预染蛋白 Marker</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374edu</td><td></td></tr><tr><td>正丁醇（1-Butanol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td>注意：在层流罩中操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫组织化学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗 GFP 抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>132002</td><td>1:300 稀释</td></tr><tr><td>抗兔 Alexa Fluor 488 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;病毒载体生产实验室&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotina 380 台式离心机 *</td><td>Hettich</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN 80 超速离心机 *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Type 50.2 Ti 固定角钛转子 *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>Entris 电子天平 *</td><td>Sartorius</td><td>2202-1S</td><td></td></tr><tr><td>恒温水浴锅 *</td><td></td><td></td><td>设定为 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>冰桶 *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td>确保病毒载体生产实验室所用材料与常规实验区域所用材料分开</td></tr><tr><td>Pipetboy pro *</td><td>Integra</td><td>156,400</td><td></td></tr><tr><td>刻度移液管：Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>容量为 5 mL</td></tr><tr><td>刻度移液管：Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>容量为 10 mL</td></tr><tr><td>刻度移液管：Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>容量为 25 mL</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱 CB150 *</td><td>Binder</td><td>9040-0038</td><td>设定为 37 &amp;deg;C、5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 95% 湿度</td></tr><tr><td>Nuaire 安全柜 NU 437-400E *</td><td>Labexchange</td><td>31324</td><td>使用前后均需用 70% 乙醇和 Virkon 清洁所有表面</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;常规实验室&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 热循环仪 *</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 仪器 II *</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer *</td><td>Eppendorf</td><td>C 5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop *</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra 电泳槽*</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td>适用于手工制胶或预制胶</td></tr><tr><td>ProteoSilver 银染试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PROTSIL1</td><td>高灵敏度蛋白检测，背景低</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R *</td><td>Eppendorf</td><td>B1_022628045</td><td>适用于中等容量需求（最高 250 mL）的高速离心机</td></tr><tr><td>刻度移液管 Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>刻度移液管 Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>刻度移液管 Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>滤芯吸头 *</td><td>Greiner bio-one</td><td>750257</td><td>1250 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>滤芯吸头 *</td><td>Greiner bio-one</td><td>738257</td><td>300 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>滤芯吸头 *</td><td>Greiner bio-one</td><td>771257</td><td>10 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>带盖冰桶 *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td></td></tr><tr><td>Mini 隔膜真空泵，VP 86 *</td><td>VWR</td><td>181-0065</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P100</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>* 标有星号的材料为昂贵设备，通常为多个实验室共享的中心基础设施。如有替代品，可使用等效设备。注意：若使用不同的超速离心机，必须仔细选择匹配的转子和离心管。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

基于腺相关病毒（AAVs）的基因递送工具是将转基因递送至中枢神经系统（CNS）的常用选择，包括基因治疗应用。AAV 载体不具备复制能力，可感染分裂和非分裂细胞&#160;，并能实现长期的转基因表达。重要的是，某些血清型（例如新近报道的 PHP.B）在动物模型中经系统性给药后能够穿越血脑屏障（BBB）。AAV 载体可在实验室中高效制备。然而，为了获得足够纯度且滴度足以用于体内（in vivo）应用的 AAV 载体，需要稳健且可重复的实验方案。本方案描述了一种基于碘克沙醇梯度纯化策略的高效且可重复的 AAV 载体制备方法。与其他纯化方法相比，碘克沙醇纯化法适用于获得高滴度、高纯度的 AAV 载体批次。此外，该方法通常比目前报道的其他方法更快。同时，本文还介绍了一种基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的策略，用于快速、准确地测定载体滴度，以及一种银染方法用于评估载体批次的纯度。最后，展示了系统给予 AAV-PHP.B 后向中枢神经系统递送基因的代表性结果。所有采用本文所述方案的实验室均应能获得此类结果。

AAV9 曾被认为是在外周给药后穿越血脑屏障并转导中枢神经系统细胞最有效的 AAV 载体血清型，直到最近。当 Deverman 实现了衣壳设计的重大进展时 等人报道了一种名为基于Cre重组的腺相关病毒靶向进化（CREATE）的衣壳筛选方法17采用该方法，他们鉴定出一种新的衣壳，命名为 PHP.B，据报告在全身注射后能够转导多个中枢神经系统区域中的大部分星形胶质细胞和神经元17需要指出的是，尽管PHP.B在C57/Bl6小鼠中可获得阳性结果（该品系为最初分离实验所用），但初步报道表明其效率可能因小鼠品系不同而存在差异。后续实验无疑将对此问题提供更深入的认识。31.
然而，尽管存在这些问题，PHP.B 为小鼠中枢神经系统（CNS）的非侵入性基因操作提供了令人期待的可能性，包括在疾病模型中开展概念验证性的基因治疗实验。因此，我们选择评估 PHP.B 介导外源基因表达的效率 与 AAV9 自2009年以来一直是外周给药后实现中枢神经系统转导的“金标准”载体2为了在转基因表达的最佳条件下对两种血清型进行直接比较，我们采用了sc基因组构型32两种载体均携带在普遍性鸡β-actin（CBA）启动子调控下的绿色荧光蛋白（GFP）转基因。出生后第42天（体重约20 g）的雌性C57/Bl6小鼠接受1 × 10¹¹ vg/kg剂量的载体静脉注射，每周监测体重与临床症状。12 每只小鼠注射 vg 的 scAAV2/PHP.B-CBA-GFP 或 scAAV2/9-CBA-GFP。载体给药操作如下进行 通过 尾静脉注射。实验已获得鲁汶大学伦理委员会的批准。
注射后三周，小鼠经心脏灌注冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注4%（w/v）冰冷的多聚甲醛（PFA）。取出脑组织，并在相同固定液中4℃过夜后固定，然后转移至含0.01%（w/v）叠氮化钠的PBS溶液中保存，待进一步分析。随后，使用振动切片机对脑组织进行切片，并进行免疫组织化学染色 50 µm 厚切片
为评估转基因表达水平，使用针对GFP的一抗（兔抗GFP）对组织切片进行染色，并用荧光染料标记的二抗（山羊抗兔Alexa Fluor 488）进行检测（图4A、B）。荧光强度测量值（以任意单位[au]表示）证实，与AAV9相比，使用sc基因组和PHP.B衣壳时GFP表达显著升高。在大脑（2105 ± 161 vs. 1441 ± 99 au；p = 0.0032）、小脑（2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au；p = 0.0032）以及脑干（3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au；p = 0.0038）中均观察到GFP表达的升高（图4C）。
<img alt="脑切片中scAAV2/9与scAAV2/PHP.B的荧光检测；荧光强度比较图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：全身递送scAAV2/PHP.B-CBA-GFP在中枢神经系统中导致高水平的GFP表达。 scAAV2/PHP.B-CBA-GFP 或 scAAV2/9-CBA-GFP（1 × 1012 将vg/mouse剂量通过尾静脉注射给予6周龄的C57/Bl6小鼠。注射后3周，对冠状脑切片进行免疫组织化学检测以观察GFP表达。A) 大脑和 (B) 小脑和脑干如图所示。比例尺 = 1 mm。C通过定量分析相对荧光强度来确定每种载体所达到的GFP信号水平（每只小鼠10个切片；每种载体组3只小鼠）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行双尾Student's t检验。 t-检验；数据以均值 ± 标准差表示；**p &lt; 0.01；au，任意单位。pCapsid，用于AAV载体生产，包含该基因 rep 来自2型血清型和该基因 帽 根据血清型 PHP.B 或 AAV9 进行相应调整。此图已根据 Rincon 修改 等32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物&#160;（≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内 使用。

基于腺相关病毒（AAVs）的基因递送工具是将外源基因递送至中枢神经系统（CNS）的常用选择，……

通过遵循本方案，使用者能够制备出高纯度、高产量的腺相关病毒（AAV）载体，适用于体外或体内应用。该方案可用于生产并纯化多种具有不同构型的AAV血清型。结合这两个要素，有助于实现特定细胞类型和组织的特异性表达。某些血清型的生产产量可能较低。当存在相近血清型时，生产过程会受到影响，需根据具体情况逐一评估。本实验操作将由本实验室技术员 Shelly Fripont 演示。HEK细胞培养完成后，取360微克辅助质粒、180微克编码载体衣壳的质粒和180微克含有目的基因的质粒，加入18毫升150毫摩尔/升氯化钠溶液中混匀，制备DNA混合液。将该混合液均分至三个50毫升锥形管中。另取一个新的锥形管，加入840微克PEI和6毫升150毫摩尔/升氯化钠溶液混匀，制备用于六个细胞培养皿的PEI混合液。然后，将六毫升 PEI 混合液逐滴加入含有 DNA 混合液的其中一个锥形管中。室温孵育 20 分钟。接着，从培养箱中取出六块细胞培养皿。在超净工作台中，彻底吸除每块培养皿中的培养基。用五毫升预热的 DPBS 冲洗培养皿，以去除残留的培养基。轻轻倾斜每块培养皿，确保 DPBS 均匀覆盖整个表面。然后，轻轻吸除 DPBS。用移液管沿培养皿边缘缓慢向每个培养皿中加入 12 毫升 DMEM 1。通过上下吹打 3 至 5 次，混合 PEI 与 DNA 混合物。以逐滴方式将该混合物各 2 毫升加入六个细胞培养皿中，确保均匀覆盖整个培养皿表面。每次使用六个细胞培养皿，重复此操作，直至完成 18 个细胞培养皿。轻轻振荡细胞培养皿，使 PEI-DNA 混合物均匀分布。将转染后的细胞在37摄氏度、95%湿度和5%二氧化碳条件下孵育5小时。之后，向18个培养皿中的每一个加入额外的12毫升DMEM 10，无需移除原有的培养基。继续在相同条件下孵育转染后的细胞。转染后72小时，使用细胞刮轻轻将细胞从每块培养皿上分离。将两块培养皿的培养基和细胞收集至一个15毫升的锥形管中，并置于冰上。将锥形管在4°C条件下以420 × g离心10分钟，离心机的加速度和减速度均设为最大。轻轻将每根离心管中的上清液倒入废液容器中弃去。然后将含有细胞沉淀的离心管置于冰上。每份沉淀加入 2 mL 裂解缓冲液，通过上下吹打 5 至 10 次进行重悬。将三根试管中的AAV一起取出。首先，将重悬的细胞置于装有干冰和乙醇混合物的容器中冷冻。然后立即将细胞转移到设定为37摄氏度的水浴中进行解冻。重复此冻融循环三次，以裂解细胞并释放腺相关病毒（AAV）颗粒。第三次融化后，在4°C条件下以1167 ×g离心15分钟。小心将上清液转移至洁净的50毫升锥形管中。向每根试管中加入核酸酶，使终浓度为每毫升上清液50单位。在37摄氏度孵育30分钟，每隔10分钟轻轻摇动试管，以确保核酸酶与上清液充分混匀。在4摄氏度下以13490 ×g离心20分钟，以澄清上清液。此后，取下10毫升注射器的活塞，将一个0.45微米滤器连接到注射器上，并将其置于洁净的50毫升锥形管上方。小心地用澄清的上清液填充注射器。使用活塞将裂解物压过滤器。接下来，按照文本方案中表一的说明，在四个独立的 50 毫升锥形管中分别准备碘克沙醇梯度溶液。用移液器将 8 毫升 15% 碘克沙醇加入三个超速离心管中。将 5.5 毫升 25% 碘克沙醇加入一个洁净的 50 毫升锥形管中。使用未标刻度的巴斯德移液管，将 5.5 毫升 25% 碘克沙醇溶液小心地加在 15% 碘克沙醇溶液下方。按照文本方案中的描述加入 40% 和 60% 的溶液。各浓度碘克沙醇溶液在分层时不应相互混合。使用巴斯德移液管将粗裂解液逐滴加在15%碘克沙醇梯度的上方，避免扰动粗裂解液与碘克沙醇溶液之间的界面。用裂解缓冲液填充每个超速离心管，直至弯月面达到管颈底部，以确保管体在超速离心过程中因承受极高的离心力而不会塌陷。使用合适的盖子封闭离心管。使用电子天平确保三支超速离心管重量相同。如有必要，可通过在粗裂解液上方添加更多裂解缓冲液来调整重量。使用固定角钛转子，在12°C条件下以最大加速度和减速度于301580 ×g离心1小时40分钟。接下来，将一根针头连接到5 mL注射器上。从转子中的试管上取下间隔垫，并在离心后回收试管。仅吸取含有载体颗粒的40%碘克沙醇组分。可立即处理样品，或将其保存在4°C条件下。本文展示了一种可用于制备具有多种衣壳、基因组构型、启动子类型及外源基因载荷的AAV载体的实验方案。在本示例中，我们制备并纯化了两种不同的AAV载体，二者均通过自互补基因组表达绿色荧光蛋白。两种载体通过不同的衣壳进行区分：PHPB 和 AAV9。它们通过尾静脉注射递送至成年 C57 black six 小鼠体内。为评估注射后三周的外源基因表达水平，对组织切片使用抗 GFP 一抗孵育，并用荧光染料标记的二抗进行检测染色。荧光强度测量结果显示，使用 PHPB 载体时，GFP 表达量相较于 AAV9 显著增加。在大脑、小脑和脑干中均观察到 GFP 的增加。准确收集含有载体的组分对于本方案至关重要。如果操作不当，将会影响载体的产量和纯度。小型实验室能够制备AAV载体后，便可利用多种实验手段将基因递送至中枢神经系统。本方案需要使用超速离心机，在操作前必须接受适当的培训，以避免发生意外。此外，AAV 载体通常被归类为生物危害物，因此在操作和管理之前应咨询当地的法规。

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科研

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神经科学

与腺相关病毒的向量的生产、纯化和质量控制

重组腺相关病毒（rAAVs）载体在动物体内研究中正变得越来越重要。in vivo...

重组腺相关病毒载体的制备与滴定

介绍了一种生成高容量腺病毒载体的方案，该载体缺失所有病毒编码序列。载体基因组中转基因的克隆基于归巢核酸内切酶技术。病毒在贴壁生长或悬浮培养的生产细胞中的扩增依赖于提供病毒基因反式表达的辅助病毒。...

基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产

本文提供了一种利用细胞工厂中培养的贴壁型HEK 293细胞及亲和层析纯化方法大规模制备研究级腺相关病毒（AAV）载体的详细操作流程。该方案可稳定获得 &gt;1 × 1013 拷贝/mL...

用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

利用杆状病毒-昆虫细胞培养系统进行腺相关病毒（AAV）2载体的生产与纯化工艺开发

腺相关病毒在悬浮细胞培养中生产，并通过两次碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本方法包含多个步骤，可提高病毒总产量，降低病毒沉淀风险，并进一步浓缩最终病毒产物。预期最终滴度可达 1012 病毒颗粒/mL，适用于临床前的 体内...

用于体内应用的腺相关病毒悬浮培养生产及碘克沙醇密度梯度离心纯化

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。...

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内...

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

腺相关病毒（AAV）载体基因组拷贝数的精确定量至关重要，但目前尚未建立标准化的实验方案。本方案描述了一种经过验证的方法，用于制备纯化的AAV样品，并通过数字滴定聚合酶链式反应（dd_PCR）可靠地定量病毒基因组滴度。...

通过数字滴定聚合酶链式反应定量纯化载体样品中的腺相关病毒基因组

本文介绍了在视觉皮层中通过颅内注射腺相关病毒（AAV）载体对神经元和胶质细胞进行荧光标记的方法。...

颅内注射腺相关病毒载体

在此方案中，我们描述了慢病毒载体的制备、纯化及滴定方法。我们以原代培养的神经元和星形胶质细胞中慢病毒载体介导的基因递送为例进行了说明。本方法也可适用于其他细胞类型 体外 和 体内.

用于转导中枢神经系统细胞的慢病毒载体的制备

学习腺相关病毒载体的生产、纯化和质量控制方法，使用HEK细胞转染和碘克沙醇密度梯度超速离心技术。该方案可获得高滴度、高纯度AAV载体，适用于体外和体内基因治疗研究。

基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

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