基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

通过遵循本方案，使用者能够制备出高纯度、高产量的腺相关病毒（AAV）载体，适用于体外或体内应用。该方案可用于生产并纯化多种具有不同构型的AAV血清型。结合这两个要素，有助于实现特定细胞类型和组织的特异性表达。

某些血清型的生产产量可能较低。当存在相近血清型时，生产过程会受到影响，需根据具体情况逐一评估。本实验操作将由本实验室技术员 Shelly Fripont 演示。

HEK细胞培养完成后，取360微克辅助质粒、180微克编码载体衣壳的质粒和180微克含有目的基因的质粒，加入18毫升150毫摩尔/升氯化钠溶液中混匀，制备DNA混合液。将该混合液均分至三个50毫升锥形管中。另取一个新的锥形管，加入840微克PEI和6毫升150毫摩尔/升氯化钠溶液混匀，制备用于六个细胞培养皿的PEI混合液。

然后，将六毫升 PEI 混合液逐滴加入含有 DNA 混合液的其中一个锥形管中。室温孵育 20 分钟。接着，从培养箱中取出六块细胞培养皿。

在超净工作台中，彻底吸除每块培养皿中的培养基。用五毫升预热的 DPBS 冲洗培养皿，以去除残留的培养基。轻轻倾斜每块培养皿，确保 DPBS 均匀覆盖整个表面。

然后，轻轻吸除 DPBS。用移液管沿培养皿边缘缓慢向每个培养皿中加入 12 毫升 DMEM 1。通过上下吹打 3 至 5 次，混合 PEI 与 DNA 混合物。

以逐滴方式将该混合物各 2 毫升加入六个细胞培养皿中，确保均匀覆盖整个培养皿表面。每次使用六个细胞培养皿，重复此操作，直至完成 18 个细胞培养皿。轻轻振荡细胞培养皿，使 PEI-DNA 混合物均匀分布。

将转染后的细胞在37摄氏度、95%湿度和5%二氧化碳条件下孵育5小时。之后，向18个培养皿中的每一个加入额外的12毫升DMEM 10，无需移除原有的培养基。继续在相同条件下孵育转染后的细胞。

转染后72小时，使用细胞刮轻轻将细胞从每块培养皿上分离。将两块培养皿的培养基和细胞收集至一个15毫升的锥形管中，并置于冰上。将锥形管在4°C条件下以420 × g离心10分钟，离心机的加速度和减速度均设为最大。

轻轻将每根离心管中的上清液倒入废液容器中弃去。然后将含有细胞沉淀的离心管置于冰上。每份沉淀加入 2 mL 裂解缓冲液，通过上下吹打 5 至 10 次进行重悬。

将三根试管中的AAV一起取出。首先，将重悬的细胞置于装有干冰和乙醇混合物的容器中冷冻。然后立即将细胞转移到设定为37摄氏度的水浴中进行解冻。

重复此冻融循环三次，以裂解细胞并释放腺相关病毒（AAV）颗粒。第三次融化后，在4°C条件下以1167 ×g离心15分钟。小心将上清液转移至洁净的50毫升锥形管中。

向每根试管中加入核酸酶，使终浓度为每毫升上清液50单位。在37摄氏度孵育30分钟，每隔10分钟轻轻摇动试管，以确保核酸酶与上清液充分混匀。在4摄氏度下以13490 ×g离心20分钟，以澄清上清液。

此后，取下10毫升注射器的活塞，将一个0.45微米滤器连接到注射器上，并将其置于洁净的50毫升锥形管上方。小心地用澄清的上清液填充注射器。使用活塞将裂解物压过滤器。

接下来，按照文本方案中表一的说明，在四个独立的 50 毫升锥形管中分别准备碘克沙醇梯度溶液。用移液器将 8 毫升 15% 碘克沙醇加入三个超速离心管中。将 5.5 毫升 25% 碘克沙醇加入一个洁净的 50 毫升锥形管中。

使用未标刻度的巴斯德移液管，将 5.5 毫升 25% 碘克沙醇溶液小心地加在 15% 碘克沙醇溶液下方。按照文本方案中的描述加入 40% 和 60% 的溶液。各浓度碘克沙醇溶液在分层时不应相互混合。

使用巴斯德移液管将粗裂解液逐滴加在15%碘克沙醇梯度的上方，避免扰动粗裂解液与碘克沙醇溶液之间的界面。用裂解缓冲液填充每个超速离心管，直至弯月面达到管颈底部，以确保管体在超速离心过程中因承受极高的离心力而不会塌陷。使用合适的盖子封闭离心管。

使用电子天平确保三支超速离心管重量相同。如有必要，可通过在粗裂解液上方添加更多裂解缓冲液来调整重量。使用固定角钛转子，在12°C条件下以最大加速度和减速度于301580 ×g离心1小时40分钟。

接下来，将一根针头连接到5 mL注射器上。从转子中的试管上取下间隔垫，并在离心后回收试管。仅吸取含有载体颗粒的40%碘克沙醇组分。

可立即处理样品，或将其保存在4°C条件下。本文展示了一种可用于制备具有多种衣壳、基因组构型、启动子类型及外源基因载荷的AAV载体的实验方案。在本示例中，我们制备并纯化了两种不同的AAV载体，二者均通过自互补基因组表达绿色荧光蛋白。

两种载体通过不同的衣壳进行区分：PHPB 和 AAV9。它们通过尾静脉注射递送至成年 C57 black six 小鼠体内。为评估注射后三周的外源基因表达水平，对组织切片使用抗 GFP 一抗孵育，并用荧光染料标记的二抗进行检测染色。

荧光强度测量结果显示，使用 PHPB 载体时，GFP 表达量相较于 AAV9 显著增加。在大脑、小脑和脑干中均观察到 GFP 的增加。准确收集含有载体的组分对于本方案至关重要。

如果操作不当，将会影响载体的产量和纯度。小型实验室能够制备AAV载体后，便可利用多种实验手段将基因递送至中枢神经系统。本方案需要使用超速离心机，在操作前必须接受适当的培训，以避免发生意外。

此外，AAV 载体通常被归类为生物危害物，因此在操作和管理之前应咨询当地的法规。