Name: 一种基于板的大鼠胎盘自然杀伤细胞细胞细胞溶解功能评价的细胞毒性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 了解基于比色法板的大鼠胎盘自然杀伤细胞细胞毒性测定技术，该方法无需专用设备即可评估免疫细胞功能，适用于发育生物学和免疫学研究。

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本研究工作由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所资助项目R00HL130456、美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所资助项目P20GM104357，以及由美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所通过机构发展奖（IDeA）资助的密西西比州INBRE项目（资助号P20GM103476）支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有实验方案均经密西西比大学医学中心机构动物照护与使用委员会批准。动物的饲养与处理均遵循美国国立卫生研究院关于伦理动物治疗的指南。
1. 从胎盘中分离淋巴细胞
<ol>
	<li>取出一只大鼠子宫中的胎盘（妊娠第19天），置于10 mL冰冻的PBS8中。</li>
	<li>将一个胎盘放置在100 µm滤膜上，并放入含有13.5 mL RPMI和1.5 mL FBS（总体积为15 mL）的培养皿中。使用注射器活塞的平端将胎盘压过滤膜，使其进入培养皿中。</li>
	<li>为每份组织准备三个15 mL锥形管。向每根管中加入3 mL密度梯度介质（见材料表），然后小心地将5 mL匀浆后的胎盘组织覆盖在每根管的介质上方。</li>
	<li>在室温（RT）下以300 x g离心25分钟，禁止使用刹车。使用移液管收集薄层白色絮状层。 
	注意：离心后可见三层：顶部为红色的RPMI层，中间为白色的絮状层，底部为透明的密度梯度介质层。使用移液管吸取管中的白色絮状层。将同一胎盘所有管中的絮状层合并至一根管中。</li>
	<li>向合并的絮状层中加入10 mL RPMI。在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。</li>
</ol>
2. 自然杀伤细胞的分离
<ol>
	<li>重悬细胞沉淀于 50 μL 冰冷的PBS</li>
	<li>根据制造商说明书，将生物素标记的 CD3 抗体加入细胞沉淀中，并用移液器充分混匀。将离心管置于旋转仪上，20 分钟 4 °C.</li>
	<li>加入 1 mL RPMI，400 x g 离心 10 分钟 g 和 4 °C，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于1 mL RPMI中，并与 150 μL 1.5 mL 微量离心管中的磁珠。将微量离心管置于管式旋转仪中，于30分钟孵育期间持续旋转 4 °C. 
	注意： 此时取出释放缓冲液，并在生物安全柜中放置至室温。</li>
	<li>将试管置于磁铁上1分钟。收集上清液，并将CD3-细胞群体保存在冰上的15 mL离心管中。 
	注意： 这是CD3- 细胞群体</li>
	<li>将离心管从磁铁上取下，加入1 mL RPMI培养基。用移液器将细胞和磁珠吹打混匀5次。</li>
	<li>重复步骤 2.5。</li>
	<li>离心 CD3- 细胞群在400 × g条件下离心10分钟 g 和 4 °C 弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 50 μL 冰冷的PBS</li>
	<li>加入生物素标记的CD161a抗体至CD3- 按照制造商说明书处理细胞并充分混匀。将离心管置于旋转混合仪上，于20分钟内孵育 4 °C.</li>
	<li>加入1 mL RPMI，400 x g离心10分钟 g 和 4 °C，弃去上清液。将沉淀重悬于1 mL RPMI中，并与 150 μL 1.5 mL 微量离心管中的磁珠</li>
	<li>将微量离心管放入管式旋转仪中，于30分钟内持续旋转孵育 4 °C.</li>
	<li>将试管置于磁架上1分钟。收集上清液，并弃去CD3-/CD161a- 细胞</li>
	<li>从磁铁上取下离心管，加入1 mL RPMI。用移液器将细胞和磁珠吹打混匀5次。</li>
	<li>重复步骤 2.12。</li>
	<li>从磁力架上取下微量离心管，加入1 mL室温释放缓冲液。将离心管置于旋转仪上，室温孵育15分钟，同时旋转。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上1分钟。将上清液收集到新的15 mL圆底离心管中，置于冰上。 
	注意： 这是NK细胞群体。</li>
	<li>从磁铁上取下离心管，加入1 mL室温RPMI。用移液器将细胞和磁珠吹打混匀5次。</li>
	<li>重复步骤 2.16，将上清液置于同一管中。充分混匀并取样 20 μL 用于细胞计数的样品 
	注意： 将离心管置于冰上。</li>
	<li>离心 CD3-/CD161a+ 细胞，10 分钟，400 x g 在 4 °C，然后移除上清液。将细胞重悬于RPMI（10% FBS，1% 青霉素/链霉素，2 ng/mL IL-2）中，并以3 × 10⁶细胞/mL的浓度接种5 6孔板中每孔加入2.5 mL NK细胞活化培养基，接种细胞至每孔细胞数为指定数量。于37°C、5% CO₂培养箱中孵育48小时。 37 °C，5% CO₂2 在湿润的培养箱中。</li>
</ol>
3. 细胞毒性实验：从培养物中回收自然杀伤细胞或YAC1细胞，或传代细胞
注意：所有步骤必须在通风橱内进行。所有细胞管必须始终置于冰上。
<ol>
	<li>使用玻璃刻度吸管从培养瓶中收集YAC1细胞及培养基，置于冰上的50 mL离心管中，充分混匀。取 20 µL 计数细胞。</li>
	<li>将 YAC1 细胞以 300 x 旋转 10 分钟 g 和 4 °C细胞离心时进行计数。</li>
	<li>向NK细胞6孔板的每个孔中加入胰蛋白酶/EDTA。轻敲孔板，放入培养箱中。</li>
	<li>细胞在含胰蛋白酶/EDTA的溶液中于约5分钟孵育后 37 °C用无菌培养皿刮刀刮取培养板/培养瓶，每孔加入1 mL NK细胞培养基。</li>
	<li>用移液管收集细胞和培养基，并转移至15 mL离心管中。取 20 µL 计数细胞。</li>
	<li>将NK细胞以400 x g离心10分钟， g 在 4 °C在离心过程中，对步骤3.5中的细胞样品进行计数。 
	注意： 在丢弃培养板之前，先在显微镜下观察，确保孔底无残留贴壁细胞。由于本实验使用NK细胞和YAC1细胞，务必分别对两者进行计数 分别地.</li>
	<li>计数细胞，并根据优化试验确定的浓度重新悬浮，以测试合适的效应细胞与靶细胞比例。通过将细胞沉淀重悬于相应的培养基中，制备以下细胞浓度：YAC1 细胞浓度为 4 × 105 细胞/mL，且NK细胞为2 × 107 cells/mL</li>
</ol>
4. 细胞毒性检测：检测方案
<ol>
	<li>使用圆底、经培养处理的 96 孔板，按照表 1建议设置实验板。该表显示了实验对照组和 3 组 NK 实验列。此设置可扩展至 96 孔板中的总共 10 组 NK 实验列。</li>
	<li>将检测板在 250 ×g 条件下离心 4 分钟，以确保效应细胞与靶细胞充分接触。将 96 孔板置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育 5 小时，以实现靶细胞与效应细胞的充分接触及效应细胞对靶细胞的裂解。 
	注意：本方案可在此处暂停。</li>
	<li>在收集上清液前 45 分钟，向靶细胞最大 LDH 释放孔（1E、1F、1G 和 1H 孔）各加入 10 µL 10× 裂解液，并将板放回加湿培养箱中。</li>
	<li>孵育结束后，将板在 250 ×g 条件下离心 4 分钟。使用多通道移液器，从所有孔中转移 50 µL 等分试样至新的 96 孔平底检测板。 
	注意：移液时勿触碰孔底，以免将细胞转移至新的检测板。新的检测板不得使用经培养处理的板。</li>
	<li>配制检测试剂。
	<ol>
		<li>待检测缓冲液升至室温后，将 12 mL 检测缓冲液加入一瓶底物混合物中，轻轻翻转并摇动至完全溶解。每瓶可满足两块 96 孔板的用量。 
		注意：检测缓冲液在解冻过程中应避光保存。使用前立即混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向步骤 4.6 所得检测板的所有孔中各加入 50 µL 检测试剂。用铝箔覆盖板以避光，并在室温下孵育 30 分钟。 
	注意：新配制的检测试剂应储存于冷冻室。试剂可稳定保存约 8 周。</li>
	<li>向每孔加入 50 µL 终止液。加入终止液后 1 小时内读取吸光度值，并记录 490 nm 处的吸光度。代表性数据见表 2。</li>
</ol>
5. 结果计算
<ol>
	<li>计算培养基背景孔的平均吸光度值，并从实验孔、靶细胞自发乳酸脱氢酶（LDH）释放孔和效应细胞自发LDH释放孔的所有吸光度值中减去该值。</li>
	<li>计算体积校正对照孔的平均吸光度值，并从靶细胞最大LDH释放对照孔测得的吸光度值中减去该值。</li>
	<li>使用步骤5.1和5.2中校正后的数值，代入以下公式计算每个效应细胞:靶细胞孔的细胞毒作用百分率。 
	<img alt="用于计算实验检测中细胞活力的细胞毒作用公式方程。" src="/files/ftp_upload/58961/58961eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式1"></li>
</ol>

<ol><li>Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Mediators%3A+A+causal+link+to+hypertension+during+pregnancy-+Studies+in+Preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia.</a> British Journal of Pharmacology. , (2018).</li>
<li>Elfarra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+mediate+pathophysiology+in+response+to+reduced+uterine+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure.</a> Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).</li>
<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), 0141074(2015).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), 89357(2014).</li>
<li>Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+gastroschisis+experimental+model+and+the+influence+of+the+mother%27s+diet+enriched+with+glutamine+in+the+fetal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cir%C3%BArgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology.</a> Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).</li>
<li>Lv, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+distinction+of+rat+liver+natural+killer+cells+from+spleen+natural+killer+cells+under+normal+and+acidic+conditions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+and+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro.</a> Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).</li>
<li>Flieger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+cellular+cytotoxicity+test+based+on+the+differential+assessment+of+living+and+killed+target+and+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何利益冲突，无论是财务方面还是其他方面。

为获得最佳结果，需考虑若干关键要点。所用细胞的无菌性至关重要。在获取胎盘后，必须在生物安全柜内的无菌条件下进行自然杀伤细胞（NK细胞）的制备与分离。此外，由于所有细胞在受到损伤时均会释放乳酸脱氢酶（LDH），因此在分离后及共培养过程中应特别注意保持NK细胞的高存活率。NK细胞自发性释放过多LDH常会导致结果呈阴性，数据无法使用
本方案中某些方面将取决于使用者及其具体需求。例如，除本文所述方法外，还有多种从胎盘分离单个核细胞的方法，如机械法和酶消化法解离。此外，使用者需自行确定适合其实验的靶细胞最佳数量以及效应细胞与靶细胞的比例。在我们的实验中，10,000个靶细胞及50:1的效应细胞与靶细胞比例被确定为最优条件。这些数值可能因所选靶细胞类型及自然杀伤（NK）细胞来源组织的不同而有所变化。其他研究者已采用该方法评估从肝脏和脾脏分离的细胞的NK细胞功能9。因此，该方法可应用于多个研究领域，而不仅限于我们所选择的子痫前期研究。
细胞毒性评估的金标准是铬释放试验<sup class="x...

子痫前期是一种妊娠期高血压疾病，其特征为胎儿生长受限、终末器官损伤以及慢性免疫系统激活。患有子痫前期的女性体内存在持续的免疫激活状态，导致循环系统和胎盘中炎症性细胞因子水平升高，CD4+ T细胞亚群失衡，以及活化的自然杀伤（NK）细胞数量增加1。本实验室近期发表的研究表明，在子痫前期的子宫灌注压降低（RUPP）大鼠模型中，NK细胞参与了部分病理生理过程。通过流式细胞术检测NK细胞表面活化标志物的表达水平，发现与正常妊娠（NP）大鼠相比，RUPP大鼠的循环系统和胎盘中活化的NK细胞比例显著升高2。
为了验证流式细胞术的观察结果，对从正常妊娠（NP）和复发性不明原因流产模型（RUPP）大鼠胎盘中分离出的自然杀伤（NK）细胞进行了功能研究，以评估其细胞毒活性。目前有多种方法可用于评估细胞毒性CD8+ T细胞和NK细胞的细胞毒功能。功能性的细胞毒分析金标准是铬释放实验3。其他已开发并应用的方法包括流式细胞术4、成像细胞术5、钙黄绿素释放法6，以及最近发展的生物发光法7。本视频将详细介绍如何使用成熟的乳酸脱氢酶（LDH）释放实验，结合市售的LDH细胞毒性检测试剂盒，来测定NK细胞的细胞毒功能。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;L 滤膜</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td>尼龙网膜</td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>Fisher</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>Fisher</td><td>14823436</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管</td><td>Fisher</td><td>7203510</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>96 孔组织培养板</td><td>CELLTREAT</td><td>229190</td><td>无菌，圆底</td></tr><tr><td>AOPI</td><td>Nexcelom</td><td>CS201065ML</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Fisher</td><td>8100241</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer 一次性计数板</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision 图像细胞计数仪</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Flowcomp Flexi 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>11061D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术管</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Fisher</td><td>NC0460539</td><td>密度梯度介质；4 × 250 mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH3025801</td><td>10 × 500 mL</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher</td><td>9720500</td><td>无垫片</td></tr><tr><td>纯化小鼠抗大鼠 CD161a 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555006</td><td></td></tr><tr><td>纯化小鼠抗大鼠 CD3 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>554829</td><td></td></tr><tr><td>重组大鼠 IL-2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>502-RL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td>1640 培养基</td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>YAC-1 细胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr></tbody></table>

基于培养板的细胞毒性检测法用于评估大鼠胎盘自然杀伤细胞的杀伤功能

A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function

众所周知，蜕膜自然杀伤（NK）细胞在正常妊娠的建立与维持过程中发挥着关键作用。近期研究表明，在患有复发性流产和子痫前期等不良妊娠并发症的女性中，其循环系统及蜕膜中的NK细胞群体存在异常。本课题组的研究显示，妊娠期高血压与胎盘中活化NK细胞数量增加相关，该结论基于细胞表面活化标志物的表达情况。本文提供了一套详细的实验方案，用于评估在手术诱导胎盘缺血的子痫前期样动物模型中，从胎盘分离的NK细胞的细胞毒功能。文中详细描述了以下步骤：单细胞悬液的制备、NK细胞的分离、离体刺激、效应细胞与靶细胞的共培养，以及细胞毒性检测。

将从正常妊娠（NP）和RUPP大鼠获得的胎盘NK细胞与其各自培养基中的靶细胞以50:1（NK:靶细胞）的比例共同孵育5小时。在490 nm处记录吸光度，原始数据见表2。计算培养基背景孔和体积校正对照孔的平均吸光度。根据制造商提供的操作说明，从相应孔位的吸光度值中减去上述平均值，结果如表3所示。随后，利用校正后的数值并根据制造商提供的方案计算细胞毒性的百分比（%）（表4）。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS</td>
			<td>VCC</td>
			<td>ECSR-1</td>
			<td>ECSR-2</td>
			<td>ECSR-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS</td>
			<td>VCC</td>
			<t...

本文提供了一种通过比色板法分离并评估胎盘来源的自然杀伤细胞毒功能的详细方法。选用子宫灌注压降低的大鼠胎盘缺血模型，以展示通过抗体介导的方法分离并评估自然杀伤细胞毒功能的过程。

众所周知，蜕膜自然杀伤（NK）细胞在正常妊娠的建立与维持过程中发挥着关键作用。近期研究表明……

该方法利用一种简单且成本低廉的技术来比较不同细胞类型的细胞毒性活性，且无需使用专业设备。该技术的主要优势在于无需使用有害物质、成本低廉，并且不需要专业设备。该方法还可用于测量其他细胞类型的细胞毒性活性，例如CD8阳性杀伤性细胞，甚至可用于评估在无孵育条件下、无杀伤性效应细胞存在时的细胞自发死亡情况。初次接触该技术的研究人员在优化效应细胞与靶细胞比例时可能会遇到困难。我的建议是，全面查阅文献，以确定在优化方案时需要测试的比例。尽管该方法除准确移液外无需特殊技能，但单个核细胞的分离以及检测板的设置等步骤，若能通过直观观察来学习和模仿，将更容易掌握。本实验操作将由我实验室的技术员 Chelsea Jekelley 演示。开始该操作时，向含有100微米滤膜的培养皿中加入13.5毫升RPMI和1.5毫升FBS。将一个胎盘置于滤膜上，使用注射器活塞的平坦端将其推过滤膜，进入培养皿中。接下来，为每种组织准备三个15毫升的锥形管。向每根管中加入3毫升密度梯度介质，并缓慢地将5毫升匀浆后的胎盘组织覆盖到每根管中。在室温下以300 × g离心25分钟，离心过程中不刹车。然后，使用移液管收集薄薄的白色中间层。向合并的中间层中加入 10 毫升 RPMI 培养基。在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。首先，将细胞沉淀重悬于 50 µL 冰冷的 PBS 中。根据生产商说明书加入生物素标记的 CD3 抗体，并用移液器充分混匀。将离心管放入旋转混匀仪中，在 4 °C 下孵育 20 分钟。接下来，加入一毫升 RPMI。在 400 × g 离心力下，4 °C 离心 10 分钟。弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮于一毫升 RPMI 中。将细胞悬液与150 µL磁珠在1.5 mL微量离心管中混合。将该管置于管式旋转仪上，于4°C孵育30分钟，同时持续旋转。孵育期间，在生物安全柜中取出释放缓冲液，使其恢复至室温。孵育完成后，将离心管置于磁力架上静置一分钟。收集上清液，并将CD3阴性细胞群体保存在冰上的15毫升离心管中。从磁力架上取下离心管，加入1毫升RPMI培养基，用移液器轻轻吹打细胞和磁珠五次，混匀。然后，将离心管重新放入磁铁中静置一分钟。收集上清液，并将CD3阴性细胞群保存至预冷的15毫升离心管中。在4°C条件下，以400 × g离心CD3阴性细胞群10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于50微升预冷的PBS中。随后，根据生产商说明书，向CD3阴性细胞中加入生物素标记的CD161A抗体，并充分混匀。将试管置于旋转混匀仪中，在4摄氏度条件下孵育20分钟。接着，加入1 mL RPMI，于4 °C、400 ×g 离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL RPMI中，并将其与磁珠加入一个1.5 mL微量离心管中。将该管置于管式旋转仪上，于4 °C孵育并同时旋转30分钟。然后，

a-plate-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-rat-placental-natural

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一种基于板的大鼠胎盘自然杀伤细胞细胞细胞溶解功能评价的细胞毒性测定

由于靶细胞纯度的限制，目前用于测量自然杀伤细胞对 HIV 感染细胞裂解反应的细胞毒试验存在局限性。本文通过利用 HIV-1 能够下调 CD4 表达的特性，展示了分离出高纯度的 HIV-1 感染初级 T...

HIV-1 感染的原代 CD4+ T 细胞的制备及其作为自然杀伤细胞毒性实验中靶细胞的应用

钙黄绿素乙酰甲酯染色法评估自然杀伤细胞对癌细胞的细胞毒作用

一种体外检测细胞因子诱导杀伤细胞细胞毒性的实验方法

本视频展示了自然杀伤细胞对荧光标记靶细胞的裂解活性。该方法通过染色死亡细胞，并利用流式细胞仪定量活细胞和死细胞，从而实现自然杀伤细胞介导的细胞毒性的检测。...

自然杀伤细胞介导的细胞毒作用检测样本制备用于流式细胞术分析

本视频展示了如何进行乳酸脱氢酶释放实验，以测定自然杀伤（NK）细胞对靶向癌细胞的细胞毒性。该实验通过测量所形成的红色产物的吸光度，来定量癌细胞释放的胞质乳酸脱氢酶酶活性。...

一种用于评估自然杀伤细胞对癌细胞细胞毒性的体外检测方法

边缘化肝白细胞与其他白细胞群体相比具有独特的特征和不同的免疫学功能。本文介绍了一种通过强制灌注大鼠或小鼠肝脏来选择性分离这一特定肝细胞群体的方法。边缘化肝白细胞在决定对肝脏相关疾病及转移性病变的易感性方面似乎起着关键作用。...

选择性收获边缘池肝内白细胞

本文展示了一种基于流式细胞术的定量测定人类自然杀伤细胞细胞毒活性的方法。...

基于流式细胞术的细胞毒性检测法用于评估人自然杀伤细胞活性

癌细胞逃避免疫系统中自然杀伤（NK）细胞介导的清除作用，对癌症的发生和进展至关重要。本文介绍了两种基于非放射性的实验方案，用于评估NK细胞对肝肿瘤细胞的细胞毒性作用。此外，还提供了一种第三种方案，用于分析NK细胞的迁移能力。...

肝癌细胞背景下自然杀伤细胞介导的细胞毒性和迁移能力的测定

本文描述了一种研究治疗性抗体在人自然杀伤细胞中通过FcγRIIIa介导的生物学事件的实验方案。该人工刺激平台可用于检测抗体FcγRIIIa受体及其Fc段结合所介导的下游效应功能，例如脱颗粒、趋化因子/细胞因子产生以及相关信号通路的激活。...

通过治疗性抗体存在下FcγRIIIa结合驱动的人自然杀伤细胞事件评估

本方案描述了一种快速、高通量、可靠、经济且无偏倚的检测方法，可高效测定细胞活力。当细胞线粒体受损而干扰其他检测方法时，该方法尤为适用。该检测利用两种细胞核染料——Hoechst 33342...

一种用于准确测定线粒体毒剂细胞毒性的自动化差异核染色检测法

本方案提供了一种标准化的 体外...

利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

了解基于比色法板的大鼠胎盘自然杀伤细胞细胞毒性测定技术，该方法无需专用设备即可评估免疫细胞功能，适用于发育生物学和免疫学研究。

基于培养板的细胞毒性检测法用于评估大鼠胎盘自然杀伤细胞的杀伤功能

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