利用开源软件流程测量琼脂固定化活性污泥颗粒的形态与大小

活性污泥颗粒的大小和形状对污水处理效率至关重要。然而，目前对其测量往往缺乏统一标准。本方案提供了一种可重复、定义明确且可半自动化的测量方法。

本方案的主要优势在于，能够在广泛的形态范围内测量大量颗粒群体，同时减少主观性和系统性偏差。尽管该技术主要针对活性污泥，但从技术上讲，任何具有类似颗粒形态的物质（如微塑料）均可采用此方法进行测量。首次尝试该技术时，建议一次只制备一个样品板，并练习制备单个样品板时的具体操作动作。

此外，进行显微镜观察时请耐心操作。本文的视频版本非常重要，因为样品采集和培养板制备涉及许多细微的技术步骤，而这些步骤通过视觉方式传达效果最佳。同时，展示并观察高质量的培养板图像对于确保实验可重复性也至关重要。

今天由我实验室的博士研究生 Joseph Weaver 演示该实验方案。首先，从反应器中充分混合的部分获取具有代表性的样品。轻轻混匀样品，然后立即将其确定的体积倒入一个 15 毫升离心管中。

随后，向每个样品中加入 5 µL 的 1% 亚甲蓝溶液。盖上管盖，通过轻轻倒置试管至少三次来混匀样品。在室温下避光染色，染色时间至少 5 分钟，但不超过 30 分钟。

染色后，向离心管中加入足量融化的7.5%琼脂与去离子水，使管内总体积达到6.5至9毫升。然后盖上离心管盖，轻轻倒置至少三次，使样品与琼脂充分混匀。操作时管盖应朝向远离自身方向，再打开管盖。

将每支试管中的内容物倒入各自独立的100毫升塑料培养皿中，轻轻摇动培养皿，使液体均匀铺展，形成完整、平滑的覆盖层，并确保颗粒分布视觉上均匀。将培养皿在室温下静置至少5分钟，直至琼脂凝固。将未加盖的培养皿正面朝上放置于体视显微镜的载物台上，显微镜放大倍数应能达到10至20倍。

使用LED照明支架或光源板等设备，从下方以均匀的漫射光照射样品。打开图像采集软件，并确保显微镜光路设置为拍照模式。然后，从相机列表中选择合适的相机。

调整显微镜，使多个颗粒出现在焦平面上，且具有大而清晰的边缘。使用10至20倍的放大倍数来测量颗粒，同时保持相对较深的焦平面。暂时移除琼脂平板，将测微尺放置在载物台上。

调节细准焦螺旋，直至在图像采集软件中微米尺的刻度清晰对焦，并校准像素与微米的比例。接下来，通过点击“查看”并选择“实际大小”，将缩放比例设置为100%。

然后选择相应选项并进入校准。在此界面中，将主视图窗口中的红色校准条沿微米尺的长轴对齐，使垂直线分别对准零刻度和200微米刻度。

在校准对话框中，输入当前的放大倍数和 200 微米的实际长度。如果已完成校准，请从菜单栏中选择放大倍数，然后选择当前放大倍数以确认校准状态。在测量菜单中，进入直线选项并选择任意直线。

单击测微尺零刻度线与长轴的交点，然后再次单击200微米刻度线与长轴的交点。正确的校准结果应显示为约200微米。

单击选择对象按钮，然后单击该线条，按删除键，并在确认对话框中点击“是”以删除该线条。接下来，更换琼脂平板，并调节细调焦旋钮，以在成像软件中获得最清晰的细节。为此，首先在相机侧边栏的位深面板中，选择对应最大允许值的单选按钮，以增加位深。

同时，在相机侧边栏的颜色分级面板中，选择相应的单选按钮，将软件设置为采集灰度图像。接下来，收起曝光与直方图之间的任何已展开的侧边栏面板。将增益降至1，并增加曝光时间，直到视口中出现清晰的图像，且直方图呈现为未触及直方图框两端的分布形态。

调整直方图以避免曝光过度或不足。在相机侧边栏的直方图面板中，将直方图的左边界滑动至最低值之外，右边界滑动至最高值之外。将图像保存为未压缩的 TIF 文件。

保存图像时，勾选“保存校准信息”框，将放大倍数信息包含在图像元数据中。通过沿培养板自上而下交替采用从左到右和从右到左的路径，选择一个不与先前图像重叠的新区域。每幅图像应包含至少500个肉眼估计的颗粒用于分析。

通过克隆 GIT 仓库获取粒子分析代码。在命令行中，输入此处所示命令以获取代码的最新版本。按照克隆仓库顶层目录中的 readme 文本文件中的说明安装分析代码。

接下来，编辑一个文本文件，列出要处理的目录以及可选参数。有关参数列表和示例，请参考示例和分析子目录。现在，通过在此处显示的命令行中输入命令来运行分析。

Fiji 路径是指 imageJ-win64.exe 所在的目录，paramsfile 则是描述分析设置的文本文件的位置。

可执行文件的名称可能因 Fiji 所安装的操作系统不同而有所差异。分析将自动运行，所需时间从几分钟到几小时不等，具体取决于图像的数量和大小。接下来，检查位于指定输出目录中 overlay 子目录下的质量控制文件。

注意那些带有虚假雾状物或捕获不佳的颗粒的图像，这些颗粒均表现为与背景不匹配的阴影轮廓。至此，数据已准备好进行特定实验的分析和图表生成。

尽管目前尚无完美的颗粒阈值分割方法，但以下是一个可接受结果的示例。在评估质控图像时，通常会发现三种常见错误：未能准确贴合颗粒边界、未能识别颗粒，以及包含伪影。

此处展示了两个实验反应器随时间变化的颗粒分布情况，并结合了研究人员记录的定性元数据。该图表显示，在本案例中，两个反应器的颗粒尺寸分布总体相似，随着时间推移，平均粒径逐渐增大，分布范围也变得更宽。在执行该操作时，关键是要在平板上均匀涂布一层含有均匀分布颗粒的琼脂薄层。

务必多加练习并耐心操作。除了本实验步骤外，还可从琼脂中切取有趣的颗粒进行研究。就数据而言，本方案产生的文件定义清晰，分析潜力无限。

该技术为深入了解好氧颗粒污泥开辟了新途径。其形态学特征极为重要，使我们能够以标准化的方式对其进行测量。废水具有生物活性。

建议采用生物安全一级操作规范。同时注意，琼脂在微波加热时可能沸腾溢出，打开离心管时可能喷溅出高温液滴。