Name: 利用开源软件管道测量琼脂中固定活性污泥颗粒的形状和大小 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习利用开源软件管道测量琼脂中固定活性污泥颗粒的形状和大小。该方法可重复且半自动化，能够减少主观和系统偏差，适用于多种颗粒形态，提高污水处理效率研究的准确性。

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本工作得到了美国国家科学基金会 CBET&#160;1336544 项目的资助。
FIJI、R 和 Python 的标识根据以下商标政策使用： 
Python：<a href="https://www.python.org/psf/trademarks/">https://www.python.org/psf/trademarks/</a> 
R：<a href="https://www.r-project.org/logo/">https://www.r-project.org/Logo/</a>，依据其在以下地址列出的 CC-BY-SA 4.0 许可协议：<a href="https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/">https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/</a> 
Fiji：<a href="https://imagej.net/Licensing">https://imagej.net/Licensing</a>

1. 收集样品用于颗粒分析
<ol>
	<li>确定特定反应器的取样体积，以产生足够用于统计分析10（&#62;500个）且避免颗粒重叠的颗粒数量。
	<ol>
		<li>假设对于混合液悬浮固体（MLSS）浓度在250至5,000 mg/L之间的活性污泥样品，每份样品取0.5至2 mL的混合液已足够。</li>
		<li>否则，使用0.5 mL、2 mL和5 mL样品分别制备三个测试琼脂平板（执行步骤1.2至2.7）。</li>
		<li>通过肉眼观察，评估哪一个（如有）样品体积最符合步骤1.1中列出的标准。</li>
		<li>如果0.5 mL样品仍存在颗粒重叠现象，则按照步骤1.1.2和1.1.3重复操作，取三份0.5 mL样品，分别加入0.5 mL、1 mL和2 mL磷酸盐缓冲液进行稀释，以确定在执行步骤2.1之前0.5 mL样品所需的稀释程度。 
		注：步骤1.1至1.1.4仅需在每次实验开始时执行一次，或在反应器内容物发生变化导致后续测量不再满足步骤1.1所列标准时重新执行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从反应器充分混合的部分取代表性样品：用烧杯或50 mL离心管取约40 mL样品，轻轻混匀后，立即将已确定体积的均匀混合样品倒入15 mL离心管中。根据步骤1.1.4的结果，必要时对样品进行稀释。 
	注：本方案可在此处暂停，样品可在冷藏条件下（4 °C）保存最多48小时。切勿冷冻样品。 
	注意：常用的保存介质（如甲醛/甲酰胺）不适用。由于载片表面积较大，结合开放容器、光源产生的热量以及可能通风不良的显微镜系统，会带来不必要的安全隐患，而图像质量的提升却十分有限。</li>
</ol>
2. 准备染色且固定的琼脂平板颗粒
<ol>
	<li>向每个样品中加入 5 µL 的 1% (w/v) 亚甲蓝溶液，盖上盖子后轻轻倒置至少 3 次以混匀。室温下避光染色至少 5 分钟，但不得超过 30 分钟。</li>
	<li>每份样品准备约 10 mL 的 7.5% (w/v) 琼脂水溶液（使用去离子水配制）。 
	注意：琼脂可预先制备，若经过灭菌可长期保存。可用琼脂糖替代，但对成像质量无明显改善。</li>
	<li>使用微波炉或水浴加热使琼脂融化，使用前稍作冷却。确保琼脂完全融化且易于倾倒；未完全融化的琼脂团块会导致染色不均，影响成像质量。</li>
	<li>将足量融化的 7.5% (w/v) 琼脂转移至离心管中，使管内总体积达到 6.5 至 9 mL。</li>
	<li>重新盖紧离心管盖子，轻轻倒置至少 3 次以充分混匀。</li>
	<li>操作时将管盖朝向无人方向或在通风橱内打开管盖。将管内混合物倒入 100 mm 塑料培养皿中，同时轻轻晃动培养皿，使液体均匀铺展，形成完整、平滑的涂层，并确保颗粒分布均匀。 
	警告：琼脂余热可能导致管内产生轻微正压，常伴有可听见的嘶嘶声，并可能喷出少量高温琼脂液滴。</li>
	<li>将培养皿在室温下静置冷却至少 5 分钟，直至琼脂完全凝固。 
	注意：本步骤可作为暂停点。将培养皿倒置并密封（例如使用密封塑料袋或封口膜），于 4 °C 冷藏保存，最长可存放 48 小时。</li>
</ol>
3. 使用体视显微镜和数码相机获取颗粒图像
<ol>
	<li>将未加盖的培养皿正面朝上放置在体视显微镜的载物台上，显微镜放大倍数应可调节至10倍至20倍。使用LED照明支架或光源板等设备，从下方以均匀的漫射光照射样品。</li>
	<li>打开图像采集软件，确保显微镜光路已设置为 照片，然后从相机列表中单击选择相应的相机。</li>
	<li>调整显微镜，使多个颗粒在软件的焦平面上呈现清晰、轮廓分明的大边缘。使用10-20倍的放大倍数测量颗粒，同时保持相对较深的焦平面。
	<ol>
		<li>暂时取下琼脂平板，将显微测微尺置于载物台上。调节细准焦螺旋，直至在图像采集软件中清晰聚焦显微测微尺的刻度。</li>
		<li>若尚未进行校准，请记录当前放大倍数下的像素与微米比例。
		<ol>
			<li>将缩放比例设置为100%，方法是单击 缩放 &#62; 实际大小 并选择 选项 &#62; 校准 然后在主视图中将红色校准条沿微米尺的长轴对齐，使垂直条纹居中对准0和200 µm刻度。在 校准 在对话框中输入当前放大倍数和200 µm的实际长度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>如果已校准，请选择 放大倍数 从菜单栏中选择当前放大倍数，并确认校准。
		<ol>
			<li>选择 测量 &#62; 线 &#62; 任意 线. 单击显微测微尺0刻度与长轴的交点，再次单击200刻度与长轴的交点。正确的校准应显示约为200 µm。通过单击该线段，按删除键并按下确认以删除该线段 是 在确认框中。 
			注意：选择相机和校准的说明是针对本硬件所使用的软件而设定的。其他成像软件中也应具备类似功能。其目的是确定图像的像素与微米比例，以实现对颗粒尺寸的准确测量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更换琼脂平板，并调节细准焦螺旋，以在成像软件中获得最清晰的细节。</li>
	<li>调整成像软件，以获得最佳图像质量。
	<ol>
		<li>将位深度增加至允许的最大值，方法是选中对应的单选按钮 位深度 面板的 相机 侧边栏。通过选择相应的单选按钮，将软件设置为采集灰度图像 颜色/灰度 面板的 相机 侧边栏</li>
		<li>收起曝光度与直方图之间的任何已展开的侧边栏面板。将增益降至1.0，然后增加曝光时间，直至视口中出现清晰的图像，且直方图呈现为未在直方图框两端被截断的分布形态。</li>
		<li>调整直方图以避免曝光过度或不足。在相机侧边栏的直方图面板中，将直方图的左边界滑动至最低值稍外侧，右边界滑动至最高值稍外侧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将图像另存为 未压缩的TIFF，包括在图像元数据中注明放大倍数信息，使用 文件 &#62; 保存为 对话框中选择 TIFF 格式，并确保 保存并附带校准信息 选中该框。 
	注意：保存图像元数据（包括空间校准）可能因采集程序的不同而有所差异。FIJI15，管道所使用的底层软件能够识别大多数常见变体。需要记录的重要信息包括像素高度、宽度及相关单位。</li>
	<li>使用移动载物台或手动移动培养板本身，选择下一个不与先前图像重叠的区域，沿培养板下行时交替采用从左到右和从右到左的路径，即所谓的“割草机式搜索模式”。重复步骤 3.6，直至获得足够图像，以涵盖至少 500 个肉眼估测的颗粒，数量更多则更佳。 
	注意：其他模式（例如., 圆形、随机等）均可接受，但需予以说明。通过数字拼接将多张重叠图像组合成全景图像虽可实现，但所得文件体积显著增加，会严重阻碍后续处理，且可能引入拼接伪影，因此目前不推荐使用。</li>
	<li>成像分析完成后，保留培养板以备可能的后续成像。最终成像结束后，应按照生物废弃物处理规定妥善丢弃。</li>
</ol>
4. 测量并分析颗粒轮廓
<ol>
	<li>安装所需的图像分析软件包
	<ol>
		<li>按照以下网址的说明安装FIJI（美国国立卫生研究院ImageJ v1.52e的增强版本）：https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
		<li>如果尚未安装，请按照以下网址的说明安装git：https://git-scm.com/downloads</li>
		<li>通过克隆git代码仓库获取粒子分析代码16。
		<ol>
			<li>在命令行中输入以下命令以获取代码的最新版本： 
			git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
			<ol>
				<li>根据克隆仓库顶层目录中的README.md文本文件中的说明安装分析代码。 
				注意：推荐使用git，因为它会自动获取代码的最新版本。如果无法使用git，也可以在发布页面以zip文件形式下载代码：https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>编辑一个文本文件，列出要处理的目录以及可选参数。参见examples/analysis子目录以获取参数列表和示例。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在命令行中运行分析，输入以下命令： 
	&#60;FIJI-PATH&#62;\ImageJ-win64.exe --console -macro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis &#60;paramsfile&#62; 
	其中 &#60;FIJI-path&#62; 是ImageJ-win64.exe所在目录，&#60;paramsfile&#62; 是描述分析设置的文本文件的位置 
	注意：可执行文件的名称可能因FIJI安装的操作系统而异。根据图像的数量和大小，分析可能需要几分钟到几小时，并将自动运行。</li>
	<li>执行质量控制检查
	<ol>
		<li>检查指定输出目录中overlay子目录下的质量控制文件。注意存在虚假、遗漏或成像不佳的颗粒的图像，这些颗粒表现为与背景不匹配的阴影轮廓。参见图3中的示例。此时，颗粒数据已准备好用于实验特异性分析图表的生成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在分析代码中指定需忽略的文件和/或颗粒ID，来剔除整块平板或单个颗粒。参见代码仓库中的examples/censoring目录，获取相关的R和Python代码示例。</li>
	<li>使用图像分析结果生成实验特异性图表，每个图像的分析结果均以TIDY12格式存储在指定输出目录的results子目录中的逗号分隔文本文件中。参见examples/figures/R和examples/figures/Python子目录，了解如何读取结果文件的示例。</li>
</ol>

<ol><li>Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+granulation%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Aerobic granulation: Advances and challenges.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).</li>
<li>Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+granular+sludge%3A+Recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Aerobic granular sludge: Recent advances.</a> Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).</li>
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<li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supervised+Learning+of+Image+Restoration+with+Convolutional+Networks%5BTitle%5D)+AND+%222007+IEEE+11th+International+Conference+on+Computer+Vision%22%5BJournal%5D)">Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks.</a> 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管图像分析系统具有较强的稳健性，并已采取质量控制步骤以剔除质量较差的图像，但若在取样、培养板制备和图像采集过程中对特定问题给予充分关注，可进一步提高数据的准确性以及通过质量控制的图像比例。
采样浓度 
假设已采集具有代表性的样品，则最重要的步骤是确保样品中含有足够数量的颗粒，以实现具有代表性9且高效的分析，同时避免浓度过高导致颗粒重叠。
在总悬浮固体浓度较宽的范围内，这相当于约 0.5 至 2 mL 的混合液，但可能需要根据具体实验进行确定。过度浓缩、过度稀释以及合适颗粒浓度的示例见图5，可供参考。颗粒浓度也会影响染色效果。过度稀释可能导致染色过深、颗粒模糊，而稀释不足则可能导致颗粒对比度不够，难以实现最佳阈值分割。
<img alt="样品制备对比，显微镜图...

本方法旨在提供一种定义明确、可重复且部分自动化的技术，用于测定生物反应器中颗粒物的尺寸和形状分布，特别是含有活性污泥絮体和好氧颗粒的样品1,2。该方法的设计初衷是提升我们现有内部实验方案的经济性、简便性、通量和可重复性3,4，简化他人的颗粒测量工作，并促进数据的共享与比较。
颗粒测量分析主要分为两大类：直接成像法和基于光散射等特性的间接推断法5。尽管间接推断法可实现自动化且通量较大，但其设备成本较高。此外，虽然间接推断法能够准确测定颗粒的等效尺寸6，却无法提供详细的形态信息7。
由于需要形态数据，我们的方法基于直接成像。尽管已有一些高通量成像方法，但传统上它们要么需要昂贵的商用硬件，要么依赖定制化解决方案8,9。我们的方法旨在使用常见且价格合理的硬件和软件，虽然通量有所降低，但所获得的颗粒图像数量仍远超过许多分析所需的最低数量10。
现有的实验方案可能未明确说明重要的取样和图像采集步骤。其他方案可能规定了会引入主观偏差的手动操作（例如临时设定阈值11）。一种明确定义的、涵盖取样、固定和图像采集步骤，并结合免费分析软件的方法，将有助于提升实验室内部的图像分析质量以及不同实验室之间的结果可比性。本实验方案的主要目标是提供一套工作流程和工具，以实现不同实验室对同一样本获得可重复的结果。
除了标准化图像分析流程外，该流程生成的数据还记录在格式规范、定义明确的文件中12，适用于主流数据分析软件包13,14，便于开展针对实验的特定分析（如自定义图表生成），并促进实验室之间的数据共享。
本方案特别适用于需要颗粒形状数据、无法使用推断方法、不希望自行开发图像分析流程，并希望方便地与他人共享数据的研究人员

<table><tbody><tr><td>10% 次氯酸钠溶液</td><td>Chlorox</td><td>31009</td><td>用于工作区消毒。</td></tr><tr><td>带盖 15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>每个样品使用一个。</td></tr><tr><td>50 mL 锥形瓶</td><td>Corning</td><td>4980-50</td><td>其他容器也可使用，只要其容量可容纳 &gt; 40 mL 样品并允许混合即可。</td></tr><tr><td>500 mL Kimax 瓶</td><td>Kimble-Chase</td><td>14395-50</td><td>或其他足以用于琼脂操作的容器</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td>固体，用于配制 7.5% 凝胶。每个样品使用 7 mL。</td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>建议使用 R 或 Python</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>足量用于配制染色液和琼脂。若无法获得，自来水亦可。</td></tr><tr><td>台式计算机</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>图像分析对 CPU 要求不高，2017 年左右的普通台式机即可满足需求。</td></tr><tr><td>外置硬盘</td><td>Seagate</td><td>STEB5000100</td><td>非完全必需，但由于图像数量多且体积大，极为实用。建议存储容量为 2 TB 或以上。</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>NIH</td><td>version 1.51d</td><td>版本基于 ImageJ 核心。插件在撰写时已更新。可从以下网址获取：https://imagej.net/Fiji/Downloads</td></tr><tr><td>GIT</td><td>开源软件</td><td>version 2.19.1 或更高版本</td><td>可从以下网址获取：https://git-scm.com/</td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>ToupView</td><td>version 3.7.5177</td><td>任何与相机兼容的软件均可，可能随相机附带。应支持保存带有空间校准数据的 TIFF 图像。</td></tr><tr><td>机械式（X/Y）载物台</td><td>OMAX</td><td>A512</td><td>非完全必需，但可极大提高图像采集效率。</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Fisher</td><td>M291-100</td><td>固体，用于配制 1% w/v 溶液。每个样品使用 5 µL 溶液。</td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>OMAX</td><td>A35140U</td><td>任何与显微镜兼容的数码相机。建议在 10 倍放大倍数下，分辨率至少达到每像素 5 µm，且每个颜色通道每像素动态范围至少为 8 位。</td></tr><tr><td>光学载物台测微尺</td><td>OMAX</td><td>A36CALM1</td><td>或其他足以进行空间校准的设备。</td></tr><tr><td>培养皿，100 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>每个样品使用一个。</td></tr><tr><td>个人防护装备（PPE）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>标准实验服、手套和护目镜。</td></tr><tr><td>Sparmoria macro</td><td>NCSU</td><td>version 0.2.1</td><td>可在 GitHub 仓库获取：https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</td></tr><tr><td>体视/解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2T</td><td>应提供 10 至 20 倍放大倍数，并支持通过内置相机拍摄数字照片，或提供 CCD 相机安装接口。</td></tr></tbody></table>

利用开源软件流程测量琼脂固定化活性污泥颗粒的形态与大小

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

实验用生物反应器（例如用于处理废水的反应器）中含有颗粒物，其大小和形状是重要的参数。例如，活性污泥絮体的大小和形状可以反映微观尺度下的运行状况，同时也直接影响污泥在沉淀池中的沉降性能。
颗粒的尺寸和形状看似是“简单”的测量参数，实则容易产生误导。在采样、成像和分析颗粒的过程中，常会遇到许多细微问题，而这些细节在非正式的实验方案中往往被忽视。采样方法可能存在偏差，或缺乏足够的统计效力；样品本身可能保存不佳，或在固定过程中发生改变；图像质量可能不足，颗粒重叠、景深、放大倍数以及各种噪声均可能导致结果不准确；若分析方法描述不清，则可能引入偏差，例如手动设定图像阈值和分割过程所导致的误差。
在保证可重复性的同时，经济性和通量也是理想的要求。一种经济、高通量的方法能够实现更频繁的颗粒测量，生成包含数千个颗粒的大量图像。该方法使用低成本试剂、常见的体视显微镜以及免费开源的分析软件，可获得可重复、易获取、可复现且部分自动化的实验结果。此外，该方法所产生的数据输出格式规范、定义清晰，易于被数据分析软件识别，从而简化实验室内部的分析工作，并促进不同实验室之间的数据共享。
本文介绍了一种详细的实验方案，涵盖了制备此类产品所需的各个步骤，包括：取样、样品制备及在琼脂中的固定、数字图像采集、数字图像分析，以及基于分析结果生成特定实验图表的示例。我们还提供了一个开源的数据分析流程，以支持本实验方案的实施。

生成的文件 
如图1所示，每分析一幅图像将生成两个文件。第一个文件为逗号分隔值（CSV）文本文件，其中每一行对应一个独立的颗粒，各列则描述颗粒的不同参数，如面积、圆度和实心度，这些参数在ImageJ手册中有明确定义17。示例CSV文件作为补充信息提供，并包含在examples/data目录中。
<img alt="微生物分析工作流程：样品采集、制备、显微镜观察和数据分析示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58963/58963fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 描述本实验方案四个主要步骤的图示化工作流程。<a href="h...

活性污泥中颗粒的大小和形状是重要的参数，通常采用不同的方法进行测量。由于采样不具代表性、图像质量不佳以及分析参数的主观性，可能导致测量结果不准确。为了最大限度地减少这些误差并简化测量过程，我们提供了一项详细规定每个步骤的实验方案，包括一个开源软件分析流程。

实验用生物反应器（如用于处理废水的反应器）中含有颗粒物，其粒径和形状是重要的参数。例如，颗粒的大小和……

活性污泥颗粒的大小和形状对污水处理效率至关重要。然而，目前对其测量往往缺乏统一标准。本方案提供了一种可重复、定义明确且可半自动化的测量方法。本方案的主要优势在于，能够在广泛的形态范围内测量大量颗粒群体，同时减少主观性和系统性偏差。尽管该技术主要针对活性污泥，但从技术上讲，任何具有类似颗粒形态的物质（如微塑料）均可采用此方法进行测量。首次尝试该技术时，建议一次只制备一个样品板，并练习制备单个样品板时的具体操作动作。此外，进行显微镜观察时请耐心操作。本文的视频版本非常重要，因为样品采集和培养板制备涉及许多细微的技术步骤，而这些步骤通过视觉方式传达效果最佳。同时，展示并观察高质量的培养板图像对于确保实验可重复性也至关重要。今天由我实验室的博士研究生 Joseph Weaver 演示该实验方案。首先，从反应器中充分混合的部分获取具有代表性的样品。轻轻混匀样品，然后立即将其确定的体积倒入一个 15 毫升离心管中。随后，向每个样品中加入 5 µL 的 1% 亚甲蓝溶液。盖上管盖，通过轻轻倒置试管至少三次来混匀样品。在室温下避光染色，染色时间至少 5 分钟，但不超过 30 分钟。染色后，向离心管中加入足量融化的7.5%琼脂与去离子水，使管内总体积达到6.5至9毫升。然后盖上离心管盖，轻轻倒置至少三次，使样品与琼脂充分混匀。操作时管盖应朝向远离自身方向，再打开管盖。将每支试管中的内容物倒入各自独立的100毫升塑料培养皿中，轻轻摇动培养皿，使液体均匀铺展，形成完整、平滑的覆盖层，并确保颗粒分布视觉上均匀。将培养皿在室温下静置至少5分钟，直至琼脂凝固。将未加盖的培养皿正面朝上放置于体视显微镜的载物台上，显微镜放大倍数应能达到10至20倍。使用LED照明支架或光源板等设备，从下方以均匀的漫射光照射样品。打开图像采集软件，并确保显微镜光路设置为拍照模式。然后，从相机列表中选择合适的相机。调整显微镜，使多个颗粒出现在焦平面上，且具有大而清晰的边缘。使用10至20倍的放大倍数来测量颗粒，同时保持相对较深的焦平面。暂时移除琼脂平板，将测微尺放置在载物台上。调节细准焦螺旋，直至在图像采集软件中微米尺的刻度清晰对焦，并校准像素与微米的比例。接下来，通过点击“查看”并选择“实际大小”，将缩放比例设置为100%。然后选择相应选项并进入校准。在此界面中，将主视图窗口中的红色校准条沿微米尺的长轴对齐，使垂直线分别对准零刻度和200微米刻度。在校准对话框中，输入当前的放大倍数和 200 微米的实际长度。如果已完成校准，请从菜单栏中选择放大倍数，然后选择当前放大倍数以确认校准状态。在测量菜单中，进入直线选项并选择任意直线。单击测微尺零刻度线与长轴的交点，然后再次单击200微米刻度线与长轴的交点。正确的校准结果应显示为约200微米。单击选择对象按钮，然后单击该线条，按删除键，并在确认对话框中点击“是”以删除该线条。接下来，更换琼脂平板，并调节细调焦旋钮，以在成像软件中获得最清晰的细节。为此，首先在相机侧边栏的位深面板中，选择对应最大允许值的单选按钮，以增加位深。同时，在相机侧边栏的颜色分级面板中，选择相应的单选按钮，将软件设置为采集灰度图像。接下来，收起曝光与直方图之间的任何已展开的侧边栏面板。将增益降至1，并增加曝光时间，直到视口中出现清晰的图像，且直方图呈现为未触及直方图框两端的分布形态。调整直方图以避免曝光过度或不足。在相机侧边栏的直方图面板中，将直方图的左边界滑动至最低值之外，右边界滑动至最高值之外。将图像保存为未压缩的 TIF 文件。保存图像时，勾选“保存校准信息”框，将放大倍数信息包含在图像元数据中。通过沿培养板自上而下交替采用从左到右和从右到左的路径，选择一个不与先前图像重叠的新区域。每幅图像应包含至少500个肉眼估计的颗粒用于分析。通过克隆 GIT 仓库获取粒子分析代码。在命令行中，输入此处所示命令以获取代码的最新版本。按照克隆仓库顶层目录中的 readme 文本文件中的说明安装分析代码。接下来，编辑一个文本文件，列出要处理的目录以及可选参数。有关参数列表和示例，请参考示例和分析子目录。现在，通过在此处显示的命令行中输入命令来运行分析。Fiji 路径是指 imageJ-win64.exe 所在的目录，paramsfile 则是描述分析设置的文本文件的位置。可执行文件的名称可能因 Fiji 所安装的操作系统不同而有所差异。分析将自动运行，所需时间从几分钟到几小时不等，具体取决于图像的数量和大小。接下来，检查位于指定输出目录中 overlay 子目录下的质量控制文件。注意那些带有虚假雾状物或捕获不佳的颗粒的图像，这些颗粒均表现为与背景不匹配的阴影轮廓。至此，数据已准备好进行特定实验的分析和图表生成。尽管目前尚无完美的颗粒阈值分割方法，但以下是一个可接受结果的示例。在评估质控图像时，通常会发现三种常见错误：未能准确贴合颗粒边界、未能识别颗粒，以及包含伪影。此处展示了两个实验反应器随时间变化的颗粒分布情况，并结合了研究人员记录的定性元数据。该图表显示，在本案例中，两个反应器的颗粒尺寸分布总体相似，随着时间推移，平均粒径逐渐增大，分布范围也变得更宽。在执行该操作时，关键是要在平板上均匀涂布一层含有均匀分布颗粒的琼脂薄层。务必多加练习并耐心操作。除了本实验步骤外，还可从琼脂中切取有趣的颗粒进行研究。就数据而言，本方案产生的文件定义清晰，分析潜力无限。该技术为深入了解好氧颗粒污泥开辟了新途径。其形态学特征极为重要，使我们能够以标准化的方式对其进行测量。废水具有生物活性。建议采用生物安全一级操作规范。同时注意，琼脂在微波加热时可能沸腾溢出，打开离心管时可能喷溅出高温液滴。

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环境

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