以胸腺为例的胚胎组织分离及鹌鹑-鸡嵌合器官的构建

本实验的总体目标是提供一种优化的实验方法，用于从鹌鹑和鸡的胚胎中分离胚胎组织。通过该技术，可获得纯净的胚胎组织，用于基因表达研究和功能分析。鹌鹑和鸡胚胎的组织通过显微手术分离，并在保持其生物学特性的前提下进行体外酶消化处理。

分离后，三维保存的组织可用于高分辨率的地形基因表达模式分析。该方法特别适用于详细描绘传统方法难以触及的胚胎区域中的原位基因表达。此外，转录组分析方法也可应用于分离的组织，无需依赖遗传标记，同时可提供组织特异性的高通量组学分析。

或者，可将两种物种的分离组织在体外类器官培养体系中共同培养48小时。该方法可用于研究组织间的相互作用，因为可以通过不同的核特征和分子标记物区分鹌鹑和鸡的细胞。此外，还可通过鸡胚内实验进一步检测培养组织形成器官的能力。

因此，该方法是研究发育过程中具有高度动态空间变化的复杂组织相互作用的有用工具，也可用于揭示特定胚胎区域在器官形成中的潜能。例如，本文描述了从分离的胚胎组织中构建鹌鹑-鸡嵌合体胸腺的过程。首先，从发育三天的鹌鹑胚胎咽部区域分离出第三和第四咽囊的内胚层，即胸腺原基前体。

然后，该组织与能够支持其发育的间充质——体壁中胚层——相结合。最后，将这种异源组织联合体在体外和卵内进行培养，以形成嵌合胸腺。所有鸡蛋操作步骤均须在无菌条件下进行，使用水平层流洁净台以及灭菌的器械和材料。

将受精的鹌鹑蛋在气室朝上的条件下进行孵化。首先，从孵育箱中取出鹌鹑蛋。准备一个大的硼硅酸盐玻璃碗，盛满冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。

使用弯头剪刀，在孵化三天的鹌鹑蛋钝端的蛋壳上轻敲并剪出一个圆形小孔。将蛋黄转移至盛有冷PBS的培养皿中。在卵黄膜外侧、卵外血管之外剪开卵黄膜，将胚胎从蛋黄上分离取出。

用细镊子将胚胎转移至盛有冷 PBS 的小烧杯中，然后用捞网将胚胎移至带有黑色底面的培养皿中。按照此前 JoVE SPA 结扎实验所述方法，切除包含第三和第四咽囊的咽部区域。随后，将第三和第四咽弓区域转移至盛有冷胰蛋白酶溶液的玻璃器皿中，置于冰上孵育一小时，以进行酶消化。

请注意，酶消化的孵育时间取决于发育阶段。将玻璃培养皿置于体视显微镜下，使用安装在持针器上的两把显微手术刀，从第三和第四咽弓区域分离内胚层。首先将咽部区域背侧朝上放置，使其内表面显示内胚层，外表面显示外胚层。

观察外胚层、内胚层、间充质、心管以及神经管的腹侧部分。去除附着在咽部内胚层背侧表面的神经管和中胚层。观察咽部的内胚层、第四和第三咽囊以及心管。

将胚胎背侧朝上，小心剥离并去除咽弓之间的间充质，暴露咽囊。在咽区的另一侧重复此操作。去除附着于内胚层最尾端部分的间充质，观察第四咽囊。

将组织背面朝上，观察左侧和右侧的第四咽囊。继续操作，去除附着在内胚层最尾端部分以及第二咽囊上的间充质。移除心脏管及围绕在内部咽囊周围的间充质。

将标本腹侧朝上，观察咽部内胚层及第二咽弓的右侧。在此阶段，应可见甲状腺原基的内胚层。分离第二和第三咽弓的外胚层，并小心去除咽弓中的间充质。

观察右侧第二咽弓的间充质去除情况。注意第四和第三咽囊以及甲状腺原基的位置。清除附着在咽囊上的间充质细胞残留物。

观察右侧的第三和第四个咽囊以及左侧的第四个咽囊。重复进行左侧间充质的分离操作。现在观察左侧的第三个咽囊。

观察左侧第二鳃弓的间充质脱离情况。注意，所有器械表面和溶液在此操作过程中均应保持低温。若解剖组织耗时较长，应更换新的冷胰蛋白酶溶液和培养皿。

最后，在第二和第三咽囊之间进行横向切割，以去除第二咽囊及甲状腺原基。此时，分离的内胚层由第三和第四咽囊以及咽部后端组成。借助两把显微手术刀清除残留的游离间充质。

将分离的内胚层转移至一个盛有冷胎牛血清的玻璃培养皿中，并在体外实验准备期间置于冰上。将鸡蛋置于水平位置，并用木炭标记其上方一侧。首先，从孵育箱中取出鸡蛋。

使用弯剪在蛋壳上开一个小孔，插入针头，用10毫升注射器吸取2毫升蛋清。在蛋壳标记区域切开一个圆形孔，用精细镊子夹住胚胎，同时在胚外血管外侧剪开卵黄膜。在体视显微镜下，将胚胎置于含有冷PBS、底部为黑色的培养皿中。

使用四枚昆虫针将胚胎固定在培养皿底部。将针插入胚外区域，形成一个正方形。在体节19至24之间，垂直于胚胎轴线进行两次横切，穿过胚胎。

通过切开胚胎边缘释放该部分组织。观察侧板、神经管和体节。吸出并转移组织至盛有冷胰蛋白酶的玻璃培养皿中。

将样品置于冰上孵育30分钟，以进行酶消化。在体视显微镜下，使用安装在持针器上的两把显微手术刀，从周围组织中分离中胚层。观察体壁中胚层、脏壁中胚层、神经管和外胚层。

首先，去除表面的外胚层。观察与外胚层分离的体壁中胚层。然后，小心地将位于腹侧的脏壁中胚层从体壁中胚层上分离下来。

观察体壁外胚层的右侧侧中胚层。沿与神经管平行的方向进行切割，使其释放。注意在此操作过程中，所有表面和溶液均应保持低温。

若解剖组织耗时较长，应更换为新的冷胰蛋白酶溶液和培养皿。观察体壁中胚层的左侧侧部、体节、神经管和外胚层。重复该侧中胚层的释放操作。

使用显微手术刀进行缓慢操作。暴露的细胞外基质蛋白会贯穿组织和器械，阻碍液体流动。沿与神经管平行的方向小心切开体壁中胚层。

将分离的中胚层组织转移至一个盛有冷胎牛血清的玻璃培养皿中，并在体外实验准备期间置于冰上。在培养皿中放置一张细孔金属网，并加入培养基。去除多余的液体，使培养基液面与金属网表面齐平。

借助细镊子将膜滤器浸入培养基中，小心地将其放置在网格顶部，使膜表面与之接触。在体视显微镜下，用刮勺和细镊子轻轻滑动，将分离的内胚层从玻璃培养皿转移至膜滤器上。对分离的中胚层重复此操作。

借助显微手术刀充分混合组织以最大化其结合。将结合后的组织小心置于含5% CO2、37摄氏度的湿润化培养箱中培养48小时。培养结束后，将培养组织移植至coriolan型膜上，并在卵形环境中继续培养10天，以完成如前所述的器官形成。

以下是网状法，可用于分离禽类胚胎组织，以应用于不同的实验方法。例如，通过整体原位杂交技术，检测了鸡胚发育第3.5天时包含第二、第三和第四咽囊的游离内胚层中已知参与咽囊形成的基因表达情况。结果显示，Sonic Hedgehog基因的表达位于咽部中央区域的内胚层中，而在咽囊中不表达；而BMP7则在第二和第三咽囊的内胚层中表达，但在咽部中央区域及第四咽囊中不表达。

分离的组织也可在体外特异性结合培养48小时，然后移植到基底膜上，并继续培养10天。外植体可通过常规组织学和免疫组织化学方法进行分析。以下是一些代表性结果：将鹌鹑第三和第四咽囊内胚层与鸡体壁中胚层结合后，移植物中形成了完整的嵌合胸腺，其中含有来源于鹌鹑的胸腺上皮细胞（QCPN阳性）以及来源于鸡的淋巴细胞。

此外，细胞角蛋白阳性的胸腺上皮组织显示出正常的形态学特征，呈现典型的网状结构。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离可用于基因表达研究的鹌鹑和鸡胚胎组织，并通过构建嵌合器官，进一步解析器官遗传学的复杂性。