Name: 一种碘-黄色荧光荧光蛋白-缝隙--细胞间通信方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 了解碘-YFP-GJIC检测法用于高通量筛选缝隙连接调节剂，该方法使用LN215细胞系，具有简单、稳定、可重复且成本低的特点，适用于药物发现和毒理学评估。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部门资助的基础科学研究中心项目支持（项目编号：2011-0023701、2016R1D1A1A02937397 和 2018R1A6A1A03023718）。

1. 表达YFPQL和SLC26A4的慢病毒的制备
<ol>
	<li>在100 mm培养皿中将HEK293T人胚肾细胞培养至80%融合度。本方案中用于维持HEK293T及其他下述细胞的培养基为添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
	<li>向6孔板的每孔中加入2 mL无菌的0.005%聚-L-赖氨酸（PLL）溶液，孵育10分钟以包被培养板。吸除PLL溶液，并用2 mL无菌水冲洗表面两次。</li>
	<li>用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤HEK293T细胞，并在每个100 mm培养皿中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C处理3分钟。加入5 mL培养基并重悬细胞。</li>
	<li>用血细胞计数板计数细胞，将细胞悬液密度调整为250,000个细胞/mL，并在2 mL培养基中加入500,000个细胞至6孔板的每一孔（已包被赖氨酸）。将细胞在37 °C、含5% CO2/95%空气的湿润环境中孵育24小时，随后更换为不含青霉素和链霉素的DMEM培养基。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中，将20 µL转染试剂用500 µL不含血清和抗生素的DMEM稀释。轻轻吹打混匀，室温静置5分钟。</li>
	<li>同时，在两个1.5 mL离心管中各加入250 µL DMEM，然后分别加入1500 ng pLVX-EIP-YFPQL 或 pLenti6P-SLC26A4、1225 ng psPAX2 和 375 ng pMD2.G。这两种慢病毒质粒此前已有描述21。向每个质粒管中加入250 µL稀释后的转染试剂，轻轻混匀，并在室温孵育20分钟。</li>
	<li>20分钟后，将1.5 mL离心管中的转染试剂与质粒复合物500 µL逐滴加入步骤1.4中的每个培养板孔中，并通过前后轻轻摇动培养板混匀。将细胞在37 °C的CO2培养箱中孵育12小时。</li>
	<li>更换为2.5 mL新鲜培养基，继续孵育48小时。然后将培养板置于冰上5分钟，使含有慢病毒的条件培养基保持低温，以维持其感染活性。</li>
	<li>收集含有慢病毒的培养上清液，转移至15 mL锥形离心管中。在4 °C以3,000 x g 离心3分钟，随后通过0.4 µm滤膜过滤去除上清液中的漂浮HEK293T细胞。</li>
	<li>含慢病毒的培养基可于4 °C保存并在2天内使用。如需长期保存，可将200 µL分装液于−80 °C冻存。</li>
</ol>
2. 通过慢病毒转导生成 LN215-YFPQL 和 LN215-I− 细胞
<ol>
	<li>按照上述方法，在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基中，将LN215细胞接种于100 mm培养皿中，培养至80%融合度。 
	注意：若使用其他细胞系进行I-YFP-GJIC实验，请使用相应的培养基。LN215-YFPQL和LN215-I-细胞可由延世大学产业-大学基金会提供。请联系通讯作者获取。</li>
	<li>转导前一天，用10 mL PBS洗涤细胞两次，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C处理3 min。用10 mL移液管将细胞重悬于5 mL培养基中，并调整细胞密度至50,000个细胞/mL。向24孔板每孔加入含20,000个细胞的400 µL培养基，分别用于无病毒对照组、YFPQL组和SLC26A4组的处理。</li>
	<li>在37 °C孵育24 h后，将两孔中的培养基更换为400 µL pLVX-EIP-YFPQL或pLenti6P-SLC26A4慢病毒与新鲜培养基按1:1比例混合的溶液，且培养基中添加聚凝胺至终浓度为4 µg/mL。对于无病毒对照组，则仅更换为普通培养基。</li>
	<li>将细胞在37 °C继续孵育15 h，吸除含慢病毒的培养基，加入新鲜培养基，并继续孵育72 h。 
	注意：为防止慢病毒在不同孔之间污染，每次吸除含慢病毒的培养基或添加新鲜生长培养基时，均应为每个孔使用新的枪头或移液器。</li>
	<li>每孔用0.5 mL PBS洗涤两次，加入300 µL胰蛋白酶-EDTA溶液处理3 min。将细胞重悬于2 mL培养基中，接种至六孔板中，并加入2 µg/mL嘌呤霉素。</li>
	<li>在含2 µg/mL嘌呤霉素的培养基中继续培养细胞，直至对照孔中所有细胞死亡（显微镜下观察呈圆形或漂浮状态），通常需要一周时间。在筛选期间每隔一天更换一次含嘌呤霉素的培养基。若在筛选完成前LN215-YFPQL或LN215-I-细胞已达到融合状态，则将细胞转移至100 mm培养皿中，并按照步骤2.5继续筛选。</li>
</ol>
3. 准备检测所需的溶液
<ol>
	<li>配制 500 mL C 溶液（10 mM HEPES、140 mM NaCl、10 mM 葡萄糖、5 mM KCl、1 mM MgCl2 和 1 mM CaCl2）以及 500 mL I 溶液（10 mM HEPES、140 mM NaI、10 mM 葡萄糖、5 mM KCl 和 1 mM CaCl2）。</li>
	<li>用 1 N NaOH 将两种溶液的 pH 值调节至 7.4，通过 0.4 µm 滤膜过滤除菌后储存。4 °C 下可保存长达 1 个月。使用前检查 pH 值。</li>
</ol>
4. 铺板 LN215-YFPQL 和 LN215-I− 细胞
<ol>
	<li>分别在100 mm培养皿中培养LN215-YFPQL和LN215-I−细胞，使用培养基使其达到实验所需的细胞数量。进行96孔板实验时，LN215-YFPQL细胞在100 mm培养皿中汇合度达到40%，LN215-I−细胞达到80%即可。</li>
	<li>在进行I-YFP GJIC实验前一天，用10 mL PBS洗涤每个100 mm培养皿。每皿加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育5分钟。将每皿中的细胞用4 mL培养基重悬，并转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>以1,000 × g离心3分钟收集细胞。弃去上清液，将每个细胞沉淀用5 mL培养基重悬。使用10 mL血清移液管反复吹打约20次，将任何细胞团块分散为单细胞。</li>
	<li>用血细胞计数板对细胞进行计数，并用培养基将细胞悬液稀释至LN215-YFPQL细胞浓度为80,000个细胞/mL，LN215-I−细胞浓度为160,000个细胞/mL。</li>
	<li>在储液槽中混合7 mL LN215-YFPQL细胞悬液与7 mL LN215-I−细胞悬液。使用多通道移液器向96孔细胞培养板的每孔加入100 µL混合液。 
	注意：为向96孔板的每孔加入100 µL混合液，大约需要10 mL混合细胞悬液。建议制备的细胞悬液量略多于实际所需量。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、含5% CO2/95%空气的加湿培养箱中孵育24小时。进行实验时，LN215-YFPQL和LN215-I−细胞的培养状态应达到100%汇合。</li>
</ol>
5. 进行 I-YFP 实验 间隙连接介导的细胞间通讯 检测
注意：使用20倍放大倍数的荧光显微镜和GFP滤光片检查96孔板，确保LN215-YFPQL或LN215-SLC26A4细胞无团块，且在进行检测前细胞培养已完全汇合且分布均匀。
<ol>
	<li>至少在进行检测前30分钟，打开微孔板读板仪并设置至 37 °C.</li>
	<li>用自动进样器以3 mL 70%乙醇、3 mL蒸馏水和3 mL I-溶液依次冲洗管路，流速为 300 µL/s.</li>
	<li>将C溶液和I溶液加热至 37 °C 在水浴中。 
	注意：如 100 µL 每个96孔板的每孔需要各溶液100 μL，每次检测共需各溶液约10 mL。此外，每块板需额外准备10 mL I-溶液用于灌注（总计20 mL），以及额外25 mL C-溶液用于洗涤（总计35 mL）。</li>
	<li>吸除培养基或将培养板倒置以排空，轻敲去除残留液体。 
	注意：生长培养基中残留的胎牛血清会导致背景荧光增强和检测质量下降。</li>
	<li>添加 200 µL 使用多通道移液器从储液槽向每孔加入 C 溶液。吸除 C 溶液，或倒置培养板以排空并轻拍去除残留液体。</li>
	<li>添加 50 µL µL C溶液， 1 µL 2.5 mM 化学品储备液（参见 表1）或以二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂，然后 50 µL µL 使用多通道移液器向每个孔中加入C溶液。 
	注意：化学文库中的大多数试剂均溶于二甲基亚砜（DMSO），在大多数基于细胞的实验中，DMSO终浓度允许达到1%（v/v）24由于DMSO的密度高于水，溶解于DMSO中的试剂在加入培养板孔时容易沉降至底部，从而干扰检测溶液的浓度。可通过添加 50 µL C溶液、DMSO中的试剂和 50 µL C 溶液的顺序。最后 50 µL C溶液用于混合。</li>
	<li>将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 在空气中，而非5% CO₂环境中2孵育时间可以调整，但通常10分钟足以使离子通道调节剂发挥作用。</li>
	<li>孵育期间，设置酶标仪程序以进行注射 100 µL 向每个孔中以1秒间隔加入I-solution，并以0.4秒间隔测量10秒内的荧光。设置读板仪从底部读取荧光信号。推荐的注射速度为 135 µL/s将激发波长设置为485 nm，并在520 nm处读取发射光。 
	注意：酶标仪程序的详细设置如下。
	<ol>
		<li>点击 管理实验方案 按钮</li>
		<li>点击 新 按钮。选择 荧光强度 在测量方法部分，以及 井模式 在读取模式部分。接下来，单击 好的 按钮。将出现新标签页。</li>
		<li>在 基本参数 菜单中，将激发波长设为 485 nm，发射波长设为 520 nm。选择 底部光学 从底部读取荧光。将测量起始时间设为“0 s”，间隔次数设为“25”，每孔闪光次数设为“20”，间隔时间设为“0.4 s”。</li>
		<li>在 布局 菜单，绘制待读取区域的培养皿范围。</li>
		<li>在 浓度/体积/振荡 菜单中，将酶标仪设置为注射模式 100 µL 向每个孔中加入 I-solution 135 µL/s 注射速度 
		注意：避免过快的注射速度，因为这可能导致细胞脱落。</li>
		<li>在 注射时间 菜单中，将注射开始时间设置为 1 s。然后，点击 开始测量 按钮</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育结束后，将96孔板放入酶标仪中，通过点击开始测量 开始测量 再次按下按钮。</li>
</ol>
6. 缝隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）活性的计算
<ol>
	<li>计算 YFPQL 淬灭百分比和间隙连接通讯（GJIC）活性，公式如下23： 
	YFPQL 淬灭 (%) = <img alt="显微镜下YFP荧光保留率计算公式，蛋白质研究示意图，荧光定量分析。" src="/files/ftp_upload/58966/58966eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	GJIC 活性 (%) = <img alt="静态平衡方程；YFP淬灭分析，科学数据比较公式，实验结果计算。" src="/files/ftp_upload/58966/58966eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
	注：原则上，GJIC 活性应根据含受体细胞和供体细胞孔中 YFP 荧光百分比与仅含受体细胞孔的对应值之差来计算。然而，由于 LN215-YFPQL 细胞在碘离子作用 10 秒后 YFP 淬灭可忽略不计，因此在使用 LN215-YFPQL 和 LN215-I- 细胞进行高通量筛选（HTS）时，我们未将背景 YFP 淬灭计入。 </li>
</ol>

<ol><li>Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins%2C+connexons%2C+and+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li>
<li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity%3A+Structure-Function+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975(1998).</li>
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<li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li>
<li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li>
<li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging%3A+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li>
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<li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+%2F+c+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li>
<li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+Connexin+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Connexins%22%5BJournal%5D)">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li>
<li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap%5BTitle%5D)+AND+%22Junctional+Intercellular+Communication%22%5BJournal%5D)">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

I-YFP-GJIC 检测可用于高通量筛选（HTS），因其具有稳健性、快速性和低成本的特点。一种 HTS 检测若其 Z' 因子高于 0.5，则被认为具有稳健性25。有关用于评估 HTS 检测适用性的统计分析方法的描述，请参见 Zhang 等人的研究25。当使用 LN215 细胞时，无需任何检测优化，Z' 因子即可达到 &#62;0.5。如果在检测中使用其他细胞类型且其 Z' 因子 &#60;0.5，则可通过延长检测时间来提高稳健性21。LN215 和 HOS（人骨肉瘤细胞）仅需 10 秒即可获得 Z' 因子 &#62;0.521。该检测仅需受体细胞和供体细胞、I 溶液和 C 溶液，无需其他试剂（如 LY 和钙黄绿素-AM）。该 GJIC 检测的另一优势在于，它可测量单个孔中细胞的总体 GJIC 活性，从而导致孔间变异性较低。在显微注射、光漂白后间隙荧光恢复（FRAP）以及双膜片钳检测中，检测区域内的单个细胞可能显著影响测量结果。尽管划痕加样检测可在...

间隙连接（GJs）作为细胞间通道，允许相邻细胞之间扩散分子量小于&#60;1 kDa的小分子，如营养物质、代谢物和信号分子。连接结构包括每个细胞中的一个半通道（亦称连接子），每个连接子由六个连接蛋白（Cxs）组成1。间隙连接及其连接蛋白已应用于多环芳烃（PAH）等致癌物的毒理学检测，因为多环芳烃是间隙连接的抑制剂2,3,4。间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）功能障碍与非基因毒性致癌作用相关5,6。作为潜在的治疗靶点，间隙连接已被报道参与特定类型的癫痫发作7,8、心脑缺血/再灌注损伤的保护9、伴有先兆的偏头痛10、药物性肝损伤6,11以及伤口愈合12。为了药物发现、毒理学检测以及鉴定调控间隙连接活性的新型细胞因子，需要高通量筛选（HTS）检测方法。高通量筛选检测还可用于研究间隙连接调节剂的构效关系2,13,14,15。
一些间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）检测方法包括染料转移法和双膜片钳技术。在染料转移实验中，已使用 Lucifer yellow CH（LY）和钙黄绿素乙酰甲酯（calcein-AM）。细胞膜对 LY 不通透，需通过显微注射、刮擦加样或电穿孔将其导入细胞内。一旦进入细胞，LY 即可扩散至邻近细胞。 通过 通过 Lucifer Yellow（LY）迁移的程度来检测间隙连接（GJs）及间隙连接活性16钙黄绿素-AM检测通常涉及光漂白后荧光间隙恢复17,18钙黄绿素-AM（Calcein-AM）是一种可穿透细胞膜的染料，进入细胞后被细胞内固有的酯酶水解转化为不可透过膜的钙黄绿素。该实验需使用共聚焦显微镜，通过激光漂白目标细胞后，观察周围细胞中的钙黄绿素-AM向漂白细胞内的转移情况。若存在功能性的间隙连接（GJs），相邻细胞中的钙黄绿素-AM会进入被漂白的细胞，从而恢复荧光信号。间隙连接活性通过漂白细胞荧光恢复的程度进行评估。染料传递实验操作繁琐、耗时较长，或灵敏度较低。双膜片钳技术是一种电生理学方法，用于测量连接电导，其灵敏度相对较高，且电导值直接依赖于开放的间隙连接数量。19；然而，该技术操作难度高、耗时且成本昂贵20I-YFP-GJIC 分析法已开发用于高通量筛选（HTS）。
图1展示了I-YFP GJIC检测法的组成部分和实验步骤，该方法利用表达碘离子敏感型YFP突变体（H148Q和I152L，即YFPQL）的受体细胞，以及表达碘离子转运蛋白（SLC26A4）的供体细胞21。YFPQL所携带的这两个突变使得其荧光可被碘离子淬灭22。将碘离子加入共培养的受体细胞和供体细胞中；碘离子无法直接进入受体细胞，但可被供体细胞表面的SLC26A4转运蛋白摄取。供体细胞内的碘离子通过功能正常的间隙连接（GJ）扩散至相邻的受体细胞，在其中淬灭YFPQL的荧光信号。若间隙连接处于关闭状态或被抑制剂阻断，则碘离子无法进入受体细胞，因而不能引起荧光淬灭。YFPQL的荧光淬灭速率反映了间隙连接的活性。I-YFP GJIC检测法操作简便且耗时较短，适用于高通量筛选（HTS），可在相对较短时间内评估大量化合物对间隙连接活性的影响。该方法仅需受体细胞和供体细胞，以及两种平衡盐溶液。下述实验方案基于主要表达Cx43的LN215细胞系21。LN215-YFPQL受体细胞和LN215-I−供体细胞系通过慢病毒转导分别表达YFPQL或SLC26A4而构建获得21,23。

<table><tbody><tr><td>96孔板</td><td>SPL</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl2）</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>I-溶液</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C-溶液，I-溶液</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>RES6003H-B7</td><td>C-溶液，I-溶液</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl2·6H2O）</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>C-溶液</td></tr><tr><td>酶标仪&amp;nbsp;</td><td>BMG LabTech&amp;nbsp;</td><td>POLARstar Omega 415-1618</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>C-溶液，I-溶液</td></tr><tr><td>psPAX2&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&amp;nbsp;#12260</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>C-溶液，I-溶液</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>碘化钠（NaI）</td><td>Sigma</td><td>383112</td><td>I-溶液</td></tr></tbody></table>

一种碘化物-黄色荧光蛋白-间隙连接细胞间通讯检测方法

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

间隙连接（GJs）是细胞膜通道，允许相邻细胞间扩散分子量小于1 kDa的分子。由于间隙连接具有生理和病理作用，因此在药物发现和毒理学研究中需要高通量筛选（HTS）检测方法来鉴定GJ调节剂。一种新型的碘化物-黄色荧光蛋白-间隙连接-细胞间通讯（I-YFP-GJIC）检测法满足了这一需求。该方法是一种基于细胞的检测体系，包含受体细胞和供体细胞，分别被改造为稳定表达一种黄色荧光蛋白（YFP）变体或SLC26A4（一种碘离子转运体）。其中YFP的荧光可被碘离子高度敏感地淬灭。当向两种细胞的混合培养物中加入碘离子后，碘离子通过供体细胞中的SLC26A4转运体进入细胞，并经由间隙连接扩散至相邻的受体细胞，在受体细胞中淬灭YFP的荧光。YFP荧光信号可在微孔板中以动力学模式逐孔测定。YFP荧光的淬灭速率反映了间隙连接的活性。该检测方法可靠且快速，适用于高通量筛选。本文描述了在人胶质瘤细胞LN215中应用I-YFP-GJIC检测法的实验方案。

使用29块96孔培养板，通过LN215-YFP细胞的I-YFP间隙连接通讯（GJIC）检测法，对2,320种化合物进行筛选，以鉴定新型GJIC调节剂QL 和 LN215-I− 细胞。代表性孔板获得的结果如下所示 图2每个孔中YFP荧光的百分比以折线图形式显示于 图2A 每个孔中GJIC活性的百分比显示在柱状图中 图2B阴性对照、阳性对照以及筛选的80种化学物质如图所示 表1每个孔均用 25 µM 一种化合物作用10分钟。特比萘芬完全抑制了间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC），而胡莫柳酯抑制了约50%的GJIC。特比萘芬被确认为一种GJ抑制剂。其剂量-反应关系、可逆性及其他实验结果已在其他文献中发表。23....

本文介绍了一种新型的缝隙连接细胞间通讯检测方法，专为药物发现和毒理学评估中高通量筛选调节缝隙连接的化学物质而设计。

间隙连接（gap junctions, GJs）是细胞膜通道，允许相邻细胞间扩散分子量小于1 kDa的分子。由于它们具有生理和……

已有研究提出，间隙连接可作为药物靶点。碘化物-YFP-GJIC 检测法适用于高通量筛选，可用于发现间隙连接调节剂。该方法已在相对较短的时间内用于测试大量化合物对间隙连接活性的影响。碘化物-YFP-GJIC 检测方法简单、稳健、可重复且成本低廉。该检测仅需受体细胞和供体细胞以及两种平衡盐溶液，无需 Lucifer yellow 和 Calcein AM 等额外试剂。此外，该方法可测量单个孔中细胞的总间隙连接活性，从而降低孔间变异性。开始此操作前，按照文本方案所述，在添加补充物的DMEM培养基中培养LN215细胞至80%融合度。转导前一天，用10毫升PBS洗涤细胞两次。向细胞中加入2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，于37°C孵育3分钟。使用10毫升血清移液管将细胞重悬于5毫升培养基中，并调整细胞密度至每毫升50,000个细胞。向24孔培养板的每个孔中加入含20,000个细胞的400微升培养基。在37摄氏度下孵育24小时。次日，通过将培养基更换为400微升的慢病毒与新鲜培养基按1:1比例混合的溶液（其中添加聚凝胺，终浓度为每毫升4微克），转导两个孔。对于无病毒对照组，将培养基更换为含有聚凝胺（终浓度为每毫升4微克）的新鲜培养基。在37摄氏度下孵育15小时。然后吸除含有慢病毒的培养基，并更换为新鲜培养基。将细胞在37摄氏度下继续孵育额外72小时。此后，用 0.5 毫升 PBS 将每孔细胞洗涤两次。向细胞中加入 300 微升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，于 37 摄氏度孵育 3 分钟。用 2 毫升培养基重悬细胞，然后将细胞接种至六孔培养板中，加入 2 微克/毫升嘌呤霉素。培养细胞直至对照孔中的所有细胞均死亡，通常需要约一周时间。首先，将LN215-YFP和LN215-碘化物细胞分别在含有培养基的100毫米培养皿中培养，以达到检测所需的细胞数量。检测前一天，用10毫升PBS洗涤每个培养皿。每孔加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，于 37 摄氏度孵育 5 分钟。用 4 毫升培养基重悬细胞，转移至 15 毫升锥形管中。以 1,000 ×g 离心 3 分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于 5 mL 培养基中。用移液器上下吹打约 20 次，以分散任何细胞团块。使用血细胞计数板对细胞进行计数。然后用培养基将细胞稀释，制备成如上所示密度的细胞悬液。接着，将每种细胞悬液各取7毫升，在储液槽中混合均匀。使用多通道移液器将100微升该混合液加入96孔培养板的每个孔中。在含5%二氧化碳的环境中37摄氏度孵育24小时。首先，使用20倍放大倍数并配备GFP滤光片的荧光显微镜检查96孔板，确保无细胞团块，且细胞培养层完全融合且分布均匀。在开始检测前至少30分钟，打开微孔板读板仪并将其温度设置为37摄氏度。用 3 毫升 70% 乙醇、3 毫升蒸馏水和 3 毫升 I 溶液冲洗自动注射器的管路。接着，将 C 溶液和 I 溶液在水浴中加热至 37 摄氏度。然后吸出培养基，或将培养板倒置以排空内容物。轻敲以去除残留的培养基。然后使用多通道移液器将C溶液加入储液槽中，向每孔加入200微升C溶液。用抽吸法或倒置培养板以排空溶液，并轻敲以去除残留液体。向每个孔中加入 50 微升 C 溶液。然后向每个孔中加入 1 微升 2.5 毫摩尔的化学储备液或作为溶剂的 DMSO，再向每个孔中加入另外 50 微升 C 溶液。将细胞在 37 摄氏度的空气中孵育约 10 分钟。孵育期间，单击“管理方案”按钮，开始设置酶标仪程序中的参数。单击“新建”按钮。在测量方法部分选择荧光强度，在读数模式部分选择孔模式。接下来，点击“确定”按钮。此时将出现一个新标签页。在“基本参数”菜单中，将激发波长设置为 485 纳米，发射波长设置为 520 纳米。选择底部光学模式以从底部读取荧光信号。然后将测量起始时间设置为0秒，间隔次数设置为25次，每孔每个间隔的闪光次数设置为20次，间隔时间为0.4秒。在布局菜单中绘制待读取的孔板区域。在“浓度/体积/震荡”菜单中，设置酶标仪以每秒135微升的注射速度向每个孔中注入100微升I溶液。在“注射时间”菜单中，将注射开始时间设置为1秒。然后点击“开始测量”按钮。孵育完成后，将96孔板转移至微孔板读数仪，并再次点击“开始测量”按钮以启动测量。本研究采用碘-黄色荧光蛋白-间隙连接-细胞间通讯检测方法，利用LN215-YFP和LN215-碘细胞对2,320种化学品进行筛选，以鉴定新型的间隙连接细胞间通讯调节剂。结果显示，胡莫柳酯可抑制50%的间隙连接细胞间通讯。而特比萘芬则能完全抑制该过程，这证实了特比萘芬是一种间隙连接抑制剂。该检测方法用于测量相邻的供体细胞与受体细胞之间的间隙连接通讯，因此在接种前，供体细胞和受体细胞必须完全分离。混合培养物的融合度应达到100%，以最大化细胞间缝隙连接的形成。通过碘化物-YFP-GJIC检测法可获得时间进程数据、剂量-反应关系，并评估缝隙连接调节剂的可逆性。此外，可通过在缺乏功能性缝隙连接的细胞中诱导表达特定连接蛋白（connexin），建立碘化物-YFP特异性的连接蛋白GJIC检测方法。这使得确定特定类型连接蛋白（connexin）的化学物质的IC50值成为可能。碘化物-YFP-GJIC检测可用于高通量筛选，因其具有稳健性、可重复性且成本低廉。该检测有助于发现用于药物研发和毒理学评估的间隙连接调节化合物。

an-iodide-yellow-fluorescent-protein-gap-junction-intercellular

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一种碘-黄色荧光荧光蛋白-缝隙--细胞间通信方法

本文描述了一种用于实时筛选与G蛋白门控内向整流K+（GIRK）通道相互作用药物的检测方法。该检测技术利用对膜电位敏感的荧光染料来测量GIRK通道的活性。该方法可适用于多种细胞系。...

一种用于筛选GIRK通道调节剂的荧光检测方法

本文介绍了如何通过单细胞显微注射 Lucifer Yellow 来观察活细胞中经由间隙连接的细胞间通讯，并提供了一些实用技巧。我们期望本文能够帮助研究人员评估功能性间隙连接所介导的细胞耦合程度。文中所述方法原则上可适用于其他分子量低于 1,000...

单细胞显微注射用于细胞通讯分析

本演示介绍了一种利用电穿孔技术对贴壁培养细胞进行研究的方法，用于分析细胞间连接通讯，同时细胞生长在涂有导电透明氧化铟锡的载玻片上。...

一种用于间隙连接功能检测的实验方法；在氧化铟锡上对贴壁细胞进行电穿孔

本方案描述了一种使用手术刀加载荧光染料转移的技术，用于测量通过间隙连接通道的细胞间通讯。间隙连接介导的细胞间通讯是一种重要的细胞过程，对维持组织稳态至关重要，而此类细胞信号传导的中断会对健康产生不利影响。...

间隙连接细胞间通讯：一种用于评估毒物和毒素不良效应及天然产物健康益处的功能性生物标志物

我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。...

肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

本文介绍了一种在Xenopus卵母细胞中表达间隙连接蛋白，并利用专为双卵母细胞电压钳记录设计的商用放大器，以高侧电流测量模式记录两个相邻卵母细胞之间连接电流的实验方案。...

记录间隙连接电流 非洲爪蟾 卵母细胞

本方案描述了一种通过测量膜电位变化来研究生电性膜蛋白的方法。该检测方法为功能性读取上皮细胞系中内源性表达的多种离子通道提供了平台。...

一种基于荧光的膜电位检测方法，用于高通量功能研究两种上皮细胞系中的两种内源性离子通道

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荧光标记法用于可视化斑马鱼中低表达蛋白

了解碘-YFP-GJIC检测法用于高通量筛选缝隙连接调节剂，该方法使用LN215细胞系，具有简单、稳定、可重复且成本低的特点，适用于药物发现和毒理学评估。

一种碘化物-黄色荧光蛋白-间隙连接细胞间通讯检测方法

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