一种碘化物-黄色荧光蛋白-间隙连接细胞间通讯检测方法

已有研究提出，间隙连接可作为药物靶点。碘化物-YFP-GJIC 检测法适用于高通量筛选，可用于发现间隙连接调节剂。该方法已在相对较短的时间内用于测试大量化合物对间隙连接活性的影响。

碘化物-YFP-GJIC 检测方法简单、稳健、可重复且成本低廉。该检测仅需受体细胞和供体细胞以及两种平衡盐溶液，无需 Lucifer yellow 和 Calcein AM 等额外试剂。

此外，该方法可测量单个孔中细胞的总间隙连接活性，从而降低孔间变异性。开始此操作前，按照文本方案所述，在添加补充物的DMEM培养基中培养LN215细胞至80%融合度。转导前一天，用10毫升PBS洗涤细胞两次。

向细胞中加入2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，于37°C孵育3分钟。使用10毫升血清移液管将细胞重悬于5毫升培养基中，并调整细胞密度至每毫升50,000个细胞。向24孔培养板的每个孔中加入含20,000个细胞的400微升培养基。

在37摄氏度下孵育24小时。次日，通过将培养基更换为400微升的慢病毒与新鲜培养基按1:1比例混合的溶液（其中添加聚凝胺，终浓度为每毫升4微克），转导两个孔。对于无病毒对照组，将培养基更换为含有聚凝胺（终浓度为每毫升4微克）的新鲜培养基。

在37摄氏度下孵育15小时。然后吸除含有慢病毒的培养基，并更换为新鲜培养基。将细胞在37摄氏度下继续孵育额外72小时。

此后，用 0.5 毫升 PBS 将每孔细胞洗涤两次。向细胞中加入 300 微升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，于 37 摄氏度孵育 3 分钟。用 2 毫升培养基重悬细胞，然后将细胞接种至六孔培养板中，加入 2 微克/毫升嘌呤霉素。

培养细胞直至对照孔中的所有细胞均死亡，通常需要约一周时间。首先，将LN215-YFP和LN215-碘化物细胞分别在含有培养基的100毫米培养皿中培养，以达到检测所需的细胞数量。检测前一天，用10毫升PBS洗涤每个培养皿。

每孔加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，于 37 摄氏度孵育 5 分钟。用 4 毫升培养基重悬细胞，转移至 15 毫升锥形管中。以 1,000 ×g 离心 3 分钟，收集细胞沉淀。

弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于 5 mL 培养基中。用移液器上下吹打约 20 次，以分散任何细胞团块。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

然后用培养基将细胞稀释，制备成如上所示密度的细胞悬液。接着，将每种细胞悬液各取7毫升，在储液槽中混合均匀。使用多通道移液器将100微升该混合液加入96孔培养板的每个孔中。

在含5%二氧化碳的环境中37摄氏度孵育24小时。首先，使用20倍放大倍数并配备GFP滤光片的荧光显微镜检查96孔板，确保无细胞团块，且细胞培养层完全融合且分布均匀。在开始检测前至少30分钟，打开微孔板读板仪并将其温度设置为37摄氏度。

用 3 毫升 70% 乙醇、3 毫升蒸馏水和 3 毫升 I 溶液冲洗自动注射器的管路。接着，将 C 溶液和 I 溶液在水浴中加热至 37 摄氏度。然后吸出培养基，或将培养板倒置以排空内容物。

轻敲以去除残留的培养基。然后使用多通道移液器将C溶液加入储液槽中，向每孔加入200微升C溶液。用抽吸法或倒置培养板以排空溶液，并轻敲以去除残留液体。

向每个孔中加入 50 微升 C 溶液。然后向每个孔中加入 1 微升 2.5 毫摩尔的化学储备液或作为溶剂的 DMSO，再向每个孔中加入另外 50 微升 C 溶液。将细胞在 37 摄氏度的空气中孵育约 10 分钟。

孵育期间，单击“管理方案”按钮，开始设置酶标仪程序中的参数。单击“新建”按钮。在测量方法部分选择荧光强度，在读数模式部分选择孔模式。

接下来，点击“确定”按钮。此时将出现一个新标签页。在“基本参数”菜单中，将激发波长设置为 485 纳米，发射波长设置为 520 纳米。

选择底部光学模式以从底部读取荧光信号。然后将测量起始时间设置为0秒，间隔次数设置为25次，每孔每个间隔的闪光次数设置为20次，间隔时间为0.4秒。在布局菜单中绘制待读取的孔板区域。

在“浓度/体积/震荡”菜单中，设置酶标仪以每秒135微升的注射速度向每个孔中注入100微升I溶液。在“注射时间”菜单中，将注射开始时间设置为1秒。然后点击“开始测量”按钮。

孵育完成后，将96孔板转移至微孔板读数仪，并再次点击“开始测量”按钮以启动测量。本研究采用碘-黄色荧光蛋白-间隙连接-细胞间通讯检测方法，利用LN215-YFP和LN215-碘细胞对2,320种化学品进行筛选，以鉴定新型的间隙连接细胞间通讯调节剂。结果显示，胡莫柳酯可抑制50%的间隙连接细胞间通讯。

而特比萘芬则能完全抑制该过程，这证实了特比萘芬是一种间隙连接抑制剂。该检测方法用于测量相邻的供体细胞与受体细胞之间的间隙连接通讯，因此在接种前，供体细胞和受体细胞必须完全分离。

混合培养物的融合度应达到100%，以最大化细胞间缝隙连接的形成。通过碘化物-YFP-GJIC检测法可获得时间进程数据、剂量-反应关系，并评估缝隙连接调节剂的可逆性。此外，可通过在缺乏功能性缝隙连接的细胞中诱导表达特定连接蛋白（connexin），建立碘化物-YFP特异性的连接蛋白GJIC检测方法。

这使得确定特定类型连接蛋白（connexin）的化学物质的IC50值成为可能。碘化物-YFP-GJIC检测可用于高通量筛选，因其具有稳健性、可重复性且成本低廉。该检测有助于发现用于药物研发和毒理学评估的间隙连接调节化合物。