Name: 心脏细胞治疗中干细胞 dna 完整性的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 了解评估干细胞DNA完整性的实验方案，用于心脏再生治疗前的细胞质量检测。本方法通过彗星实验和免疫标记技术确保移植细胞的安全性，提高再生医学治疗效果。

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本工作部分由美国国家心肺血液研究所基金 RO1-HL-99507、HL-114120、HL-131017、HL138023 和 UO1-HL-134764（资助 J. Zhang）以及美国心脏协会科学开发基金 17SDG33670677（资助 R. Kannappan）支持。

1. 彗星实验
<ol>
	<li>试剂准备
	<ol>
		<li>将500 mg低熔点琼脂糖加入100 mL无DNA/RNA水中。将瓶子放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。随后将瓶子置于37 °C水浴中，待用。 
		注意： 欲了解更多信息，请参阅 Azqueta 等人的研究，该研究探讨了琼脂糖浓度对DNA解旋时间及多种电泳因素的影响23.</li>
		<li>将SYBR Green DNA染料用Tris-EDTA（TE）缓冲液按1:10,000比例稀释，得到1x工作浓度的染料溶液。该染料对光敏感，需避光保存。</li>
		<li>对于细胞裂解缓冲液，将100 mL裂解缓冲液（2.5 M NaCl，0.1 M EDTA，10 mM Tris，1% Triton X-100）溶于去离子水（DI H₂O）中2然后，加入 10 M NaOH 将 pH 调至 10.0。将缓冲液冷却至 4 °C。</li>
		<li>对于碱性DNA解旋/电泳运行缓冲液，将1 L碱性溶液（0.3 M NaOH，1 mM EDTA）溶解于去离子水中2O. 将缓冲液冷却至 4 °C。确保 pH &#62;13.</li>
		<li>对于预包被的彗星电泳载玻片，在玻璃载玻片上滴加数滴0.5%琼脂糖。立即使用另一张载玻片的平整表面将琼脂糖均匀铺开，形成一层薄薄的琼脂糖包被层。 
		注意： 使用前将载玻片干燥。</li>
		<li>对于iPS细胞培养，将iPS细胞短暂培养于基底膜基质包被的培养皿中（参见 材料表在 mTESR1 培养基中培养至细胞融合。 
		注意： 本方案中使用了人源心肌成纤维细胞诱导生成的iPS细胞。iPS细胞的重编程、诱导及培养条件详见本研究团队近期发表的文章。12,13,21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>弃去培养基，洗涤细胞。使用解离液解离细胞（参见 材料表). 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀，并将细胞重悬于 PBS 中，浓度为 1 × 105 cells/mL</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品载玻片制备 
	注意： 在低光照条件下执行以下步骤，以避免紫外线引起的细胞损伤。
	<ol>
		<li>将10 μL细胞悬液与90 μL琼脂糖溶液（1:10比例）在离心管中混合。将离心管置于37 °C水浴中，以防止琼脂糖凝固。</li>
		<li>将溶液混合均匀，避免产生气泡，然后用移液器将70 μL/点滴加到预包被的彗星电泳载玻片上。用移液器枪头将细胞与琼脂糖混合物铺展成一层薄层。将载玻片置于4 °C环境中15分钟。</li>
		<li>将载玻片完全浸入装有冷裂解缓冲液的容器中。将容器置于4 °C避光孵育1小时。</li>
		<li>用冰冷的碱性溶液替换裂解缓冲液，确保载玻片完全浸没。将容器置于4 °C避光环境中孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电泳
	<ol>
		<li>将载玻片放入水平电泳槽中，加入冷的碱性电泳缓冲液至完全浸没载玻片。以1 V/cm的电压电泳15至30分钟。 
		注意： 总电压 = 电极间距 × 1 V</li>
		<li>在容器中，将载玻片完全浸入冷的去离子水中2O. 2分钟后，移除去离子水2O 并加入新鲜的去离子水2O. 重复此步骤。</li>
		<li>更换去离子水2用预冷的70%乙醇浸泡。静置5分钟。轻轻取出玻片，不要倾斜，使其自然晾干。</li>
		<li>干燥后，向每个点加入100 μL稀释的DNA染料，室温避光孵育15分钟。使用落射荧光显微镜配备FITC滤光片，每份样品共采集50至100个彗星图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析与结果计算
	<ol>
		<li>为分析彗星图像，使用美国国立卫生研究院（NIH）的 ImageJ 软件并加载彗星检测插件（ImageJ 下载地址：https://imagej.nih.gov/ij/download.html；插件下载地址：https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/）。 
		注意： 该插件附带一份PDF说明书，其中包含执行分析所需的全部细节。此外，还展示了彗星分析的截图 图2A-C对照组和阿霉素（Doxo）处理的iPS细胞的代表性彗星图像及彗星定量分析结果如图所示 图3A-C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. DNA损伤应答
<ol>
	<li>样品与试剂准备
	<ol>
		<li>对于iPS-CM细胞培养，将iPS-CM细胞接种于基底膜基质包被的（参见材料表）培养板中，使用添加了B-27的RPMI培养基（CMM）进行培养，直至细胞达到汇合状态。 
		注意：本方案中使用了人iPS细胞来源的心肌细胞。iPS细胞向心肌细胞分化的具体方案可参考本研究团队近期发表的文章12,13,21。</li>
		<li>将iPS-CM细胞接种至腔室载玻片中。
		<ol>
			<li>弃去iPS-CM孔中的培养基，用PBS洗涤细胞三次。</li>
			<li>每孔加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。在显微镜下观察细胞是否脱落，随后加入1 mL CMM以终止胰酶消化。</li>
			<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，于4 °C、200 × g离心5分钟。弃去上清液，加入1 mL CMM重悬细胞。计数细胞，并调整细胞浓度，使1.6 mL CMM中含有20 × 105个细胞。</li>
			<li>每孔8孔腔室载玻片中加入200 µL细胞悬液（参见材料表）。轻轻敲击载玻片使细胞均匀分布，随后于37 °C孵育。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行iPS-CM阿霉素处理时，弃去iPS-CM孔中的培养基，用PBS洗涤细胞。加入含1 μM阿霉素的CMM处理4小时。吸除培养基，并用PBS洗涤细胞。</li>
		<li>配制封闭缓冲液：配制10 mL含3%牛血清白蛋白（BSA）和0.05% Triton X-100的BSA溶液。取9 mL上述BSA溶液，加入1 mL正常驴血清，混匀即得10 mL封闭缓冲液。</li>
		<li>配制一抗溶液：将1 μL抗兔磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）抗体加入200 μL封闭缓冲液中。</li>
		<li>配制二抗混合液：将各1 μL荧光标记的抗兔二抗、DAPI和荧光标记的鬼笔环肽加入200 μL封闭缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫标记
	<ol>
		<li>用PBS洗涤细胞三次，每孔加入200 μL新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA），于室温避光固定20分钟。固定后用PBS洗涤细胞。</li>
		<li>弃去PBS，每孔加入200 μL封闭缓冲液，在室温湿润环境中封闭30分钟。弃去封闭液，每孔加入200 μL一抗溶液，在室温避光湿润环境中孵育45分钟。随后用PBS洗涤三次。</li>
		<li>弃去PBS，每孔加入200 μL二抗混合液，在室温避光湿润环境中孵育45分钟。孵育结束后用PBS洗涤三次，再用去离子H2O洗涤，然后使用抗荧光淬灭封片剂封片。加盖盖玻片，将载玻片置于4 °C避光保存。</li>
		<li>使用落射荧光显微镜，对每个样本随机选取3至5个视野进行成像（如图4A所示），随后进行图像分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DDR焦点计数
	<ol>
		<li>下载并安装CellProfiler24（http://cellprofiler.org）。</li>
		<li>注意：本研究中图像处理使用的是CellProfiler 2.1.1版本。所使用的CellProfiler教程可参见其他资源（https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk&amp;#38;list=PL7CC87670239B4D10）。若使用更新版本的CellProfiler，分析流程可能需要进行轻微调整。</li>
		<li>下载分析流程文件punctae_gH2AX.cpipe。在软件中选择文件 &#62; 导入 &#62; 流程，然后选择punctae_gH2AX.cpipe。</li>
		<li>将包含γH2A.X焦点图像的文件夹拖拽至输入模块/图像部分的文件列表窗口中以进行分析（参见图5A）。随后按照图5A-L所示步骤操作。</li>
		<li>为图像设置以下参数：
		<ol>
			<li>将待分析的图像拖至文件列表中。在输入模块中选择图像（模块设置参见图5A）。在输入模块中选择元数据（模块设置参见图5B）。在输入模块中选择名称与类型（模块设置参见图5C）。</li>
			<li>在分组中选择无。在分析模块中选择ColorToGray（模块设置参见图5D）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在分析模块中选择Smooth（模块设置参见图5E）。 
		注意：该参数值可能需要根据图像分辨率进行优化。</li>
		<li>在分析模块中选择IdentifyPrimaryObjects（模块设置参见图5F）。 
		注意：需优化参数以确保整个细胞核被正确识别。此步骤后计算机可能出现短暂卡顿。</li>
		<li>在分析模块中选择Smooth（模块设置参见图5G）。 
		注意：该参数值可能需要根据图像分辨率进行优化。</li>
		<li>在分析模块中选择EnhanceOrSuppressFeatures（模块设置参见图5H）。</li>
		<li>在分析模块中选择IdentifyPrimaryObjects（模块设置参见图5I）。 
		注意：需优化参数以确保焦点被正确识别。此步骤后计算机可能再次出现卡顿。
		<ol>
			<li>在分析模块中选择RelateObjects（模块设置参见图5J）。在分析模块中选择ClassifyObjects（模块设置参见图5K）。在分析模块中选择ExportToSpreadsheet（模块设置参见图5L）。</li>
			<li>点击左下方面板的分析图像以执行图像分析。分析成功完成后，将生成若干图像（参见图6A-F）。 
			注意：建议用户保存这些图像以供后续参考。</li>
			<li>注意生成的.csv文件，其中包含定量数据，已保存至计算机的指定位置。在名为MyExpt_Image的电子表格中，B列和D列分别表示含有不超过五个焦点和超过五个焦点的细胞核数量。将B列与D列相加，可得细胞核总数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对所有图像重复步骤2.3.3至2.3.8（每次分析前需更改MyExpt_文件名）。可据此绘制DNA完整性的评估图表，如图4C所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li>
<li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li>
<li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li>
<li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li>
<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
<li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
<li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li>
<li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li>
<li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals%2C+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li>
<li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%3A+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li>
<li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li>
<li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li>
<li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+reliable+comet+assay%3A+optimising+agarose+concentration%2C+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleation+of+cardiomyocytes%3A+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

DNA完整性反映了细胞的完整性。DNA受损的细胞常处于应激状态，最终会丧失其完整性。对于用于移植目的而扩增的干细胞及其分化细胞而言，细胞的完整性是其发挥预期功能的关键。移植DNA受损的细胞将导致细胞植入率低下及功能不良8,20。因此，在细胞移植前检测DNA完整性是一项必要的质量控制步骤。本文介绍了两种经济有效的方法——彗星实验（comet assay）和γH2A.X免疫荧光标记，用于评估干细胞及其分化细胞的DNA损伤程度与质量。
细胞衰老的主要原因被认为是细胞内DNA损伤的累积。Al-Baker等人利用彗星实验分析了年轻和衰老的人类皮肤成纤维细胞中的DNA损伤22。此前，我们已证明，将从p53转基因小鼠中分离得到的无DNA损伤的心脏祖细胞移植后，可提高细胞在宿主器官中的植入率8。最近，我们揭示了p53转录激活域在人类诱导多能干细胞（iPS细胞）DNA损伤修复机制中的作用<...

实验和临床证据表明，细胞移植可适度改善衰竭心脏的左心室收缩功能1,2,3,4,5,6,7,8,9。近年来的进展为心血管再生开辟了更多有吸引力的前景，包括在体细胞中强制表达重编程因子以诱导多能性，并将这些诱导多能干细胞（iPSC）分化为不同的心脏谱系，尤其是心肌细胞（CM）10,11,12,13。每个细胞中的遗传物质，包括人工生成的iPSC和iPSC来源的心肌细胞（iPS-CM），均为DNA。储存在DNA中的遗传指令决定了细胞、组织、器官和生物体的生长、发育和功能。DNA并非惰性物质；细胞代谢产物（如活性氧、羰基和氮类物质）以及烷化剂可在体外和体内引起DNA损伤14,15,16,17。重要的是，DNA损伤直观地发生在每个细胞中，且频率显著。如果这些损伤未被修复，将导致DNA突变、细胞衰老、DNA和细胞完整性的丧失，并可能引发包括危及生命的癌症在内的多种疾病。因此，维持DNA完整性对任何细胞都至关重要，尤其是对在临床中具有巨大潜力的iPSC而言更为关键。
为了评估分离基因组DNA的数量和完整性，市场上已有昂贵的仪器设备可供使用。然而，目前尚无简单且经济有效的方法可在不分离细胞的情况下评估细胞内的DNA完整性。此外，在DNA提取过程中由操作者引起的DNA降解是这些方法的主要缺陷之一。单细胞凝胶电泳（即彗星试验）18,19 和 γH2A.X 免疫标记8 技术是研究实验室中评估DNA损伤的基本方法。这两种方法在分析DNA完整性时均无需使用昂贵设备或分离的基因组DNA8,20,21。由于这些技术可在完整细胞上进行，因此样品制备过程中由操作者引起的DNA/RNA/蛋白质降解不会影响这些实验方案的结果。本文中，为评估干细胞及干细胞衍生细胞中的DNA损伤及其损伤应答，我们提供了彗星试验和γH2A.X免疫标记的分步实验方案。此外，通过结合这两种方法，我们提出了一种初步评估策略，可用于评价细胞是否适合移植应用。
彗星试验（comet assay），即单细胞凝胶电泳，用于检测细胞中的DNA断裂。将细胞包埋在低熔点琼脂糖中，经裂解后形成含有超螺旋DNA的核样结构（nucleoids）。在电泳过程中，断裂的DNA小片段和断裂的DNA链可穿过琼脂糖孔隙发生迁移，而完整的DNA由于分子量巨大且与基质蛋白结合，迁移受到限制。在荧光显微镜下观察到的染色DNA迁移模式形似彗星。彗星头部包含完整的DNA，尾部则由DNA片段和断裂的DNA链组成。DNA损伤比例可通过受损DNA（彗星尾部）的荧光强度与完整DNA（彗星头部）荧光强度的相对值来测定。尾矩（tail moment）参数的计算方法如图1所示。
DNA损伤会诱导ATM、ATR和DNA-PK激酶介导的组蛋白H2A.X在Ser139位点的磷酸化（γH2A.X）。H2A.X在DNA链断裂处的磷酸化及其募集过程被称为DNA损伤应答（DDR），该过程在DNA受损后迅速发生。随后，将启动检查点介导的细胞周期阻滞和DNA修复过程。在DNA修复成功完成后，磷酸酶会将γH2A.X去磷酸化并使其失活。持续存在或大量的DNA链断裂会导致DNA中γH2A.X焦点的累积，表明细胞无法修复DNA损伤且DNA完整性丧失。这些DNA中的γH2A.X焦点可通过第二节中的方案进行识别，并用于计数DDR焦点的数量。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Corning</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>8孔腔室载玻片</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure&lt;br/&gt; 驴抗兔IgG</td><td>Jackson Immuno&lt;br/&gt; Research Laboratories</td><td>711-545-152&lt;br/&gt; (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 驴抗兔IgG</td><td>Jackson Immuno&lt;br/&gt; Research Laboratories</td><td>711-165-152&lt;br/&gt; (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 添加剂，无血清</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 生长因子减少型</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>PhalloidinA488</td><td>Life Technology</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化组蛋白 H2A.X (Ser139) 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&amp;nbsp;Green I 核酸凝胶染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 低熔点琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>抗荧光淬灭剂</td></tr></tbody></table>

评估用于心脏细胞治疗的干细胞dna完整性

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

干细胞及干细胞来源的细胞在治疗多种退行性疾病方面具有巨大的再生医学潜力。DNA 是所有细胞（包括干细胞）中遗传信息的储存库，其完整性是干细胞再生能力的基础。在实验室中，干细胞需快速增殖以获得移植所需的细胞数量。然而，加速的细胞生长会导致活性氧、羰基化合物和烷基化试剂等代谢产物的累积，从而造成 DNA 完整性丧失。移植此类细胞将导致移植效率低下以及受损器官的再生不良。此外，移植 DNA 受损的细胞可能引发突变、基因组不稳定、细胞衰老，甚至可能导致癌症等危及生命的疾病。因此，亟需一种质量控制方法来评估细胞是否适合移植。本文提供了在细胞移植前评估干细胞 DNA 完整性的分步操作方案。

培养人诱导性多能干细胞，并通过彗星试验分析用于评估DNA完整性的DNA损伤和尾矩。将iPS细胞包埋于低熔点琼脂糖中并置于载玻片上。随后，细胞经裂解缓冲液处理，再用碱性溶液处理，以获得超螺旋DNA。将核伸展物进行电泳，再通过DNA染料显影形成彗星图像（图1A-D）。随后使用ImageJ软件及彗星试验插件对彗星图像进行分析（图2A-C）。
人iPS细胞经Doxo处理以诱导DNA损伤，并作为阳性对照。图中显示了经Doxo处理与未处理iPS细胞的代表性彗星电泳显微图像。 图 3A在iPS细胞中检测到基础水平的DNA损伤，以DNA损伤比例和尾矩表示。然而，正如预期，Doxo处理增加了iPS细胞中的DNA损伤<stron...

本文详细描述了一种实验方案，用于在干细胞移植前对其DNA完整性进行评估的分析。

评估用于心脏细胞治疗的干细胞DNA完整性

干细胞及干细胞来源的细胞在治疗多种退行性疾病方面具有巨大的再生医学潜力。DNA 是遗传信息的储存库……

对于心肌病等新生儿疾病，利用诱导多能干细胞衍生细胞进行再生治疗具有巨大潜力。然而，体外加速细胞生长会导致活性氧等代谢产物积累，从而引起DNA损伤。移植这些DNA受损的细胞将导致器官移植效果不佳及再生能力下降。移植前应评估细胞的质量。本文提供了两个分步方案，用于评估干细胞中的DNA损伤。示范操作流程的人员包括研究人员杰西卡·米勒（Jessica Miller）、研究人员尼基尔·马德赫卡尔（Nikhil Mardhekar）以及实验室技术员瓦桑蒂·拉贾塞卡尔（Vasanthi Rajasekaran）。首先，将500毫克低熔点琼脂糖加入100毫升DNA-RNA-free水中。将瓶子放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。然后，将瓶子置于37°C水浴中，待用。为制备预包被的彗星电泳载玻片，先在玻璃载玻片上滴加数滴0.5%琼脂糖。立即用盖玻片将琼脂糖均匀铺展，形成一层薄薄的琼脂糖包被层。在避光条件下操作，以避免紫外线引起的细胞损伤，将10微升细胞悬液与90微升琼脂糖溶液在离心管中混合。将试管置于37°C水浴中，以防止琼脂糖凝固。混合溶液时避免引入气泡，并用移液器将每点70 µL的溶液滴加到预先包被的彗星电泳载玻片上。使用移液器吸头将细胞与琼脂糖混合物涂布成一层薄层。将载玻片置于 4°C 环境中 15 分钟。在容器中，用预冷的裂解缓冲液完全浸没载玻片。将容器置于 4°C 黑暗环境中孵育 1 小时。用冷的碱性溶液替换裂解缓冲液，确保载玻片完全浸没。将容器置于4°C黑暗环境中静置30分钟后，将载玻片放入水平电泳槽中。将电泳槽中加入冷的碱性电泳缓冲液，直至载玻片完全浸没。以每厘米1伏的电压电泳15至30分钟。在容器中，将载玻片完全浸入冷的去离子水中。两分钟后，移除去离子水并加入新鲜的去离子水，然后重复此步骤一次。接着，将去离子水替换为冷的70%乙醇。五分钟后，轻轻取出载玻片，避免倾斜，并使其自然晾干。干燥后，向每个点加入100 µL稀释的DNA染料，在室温下静置15分钟。使用落射荧光显微镜的FITC滤光片，每份样品共采集50至100个彗星图像。按照文本方案中所述培养iPS来源的心肌细胞。为了观察培养皿载玻片中的诱导多能干细胞来源的心肌细胞，首先弃去孔中的培养基，并用 PBS 洗涤细胞三次。每孔加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶，于 37 摄氏度孵育 5 分钟。在显微镜下观察细胞是否已脱落。然后加入1 mL CMM以终止胰蛋白酶的作用。将细胞悬液放入15 mL离心管中，在4 °C、200 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液，加入1 mL CMM，重悬细胞。计数细胞，并调整细胞数量，使1.6毫升CMM中含有两百万个细胞。然后将200微升细胞悬液接种到八孔板的每一孔中。轻轻敲击玻片，使细胞在孔内均匀分布。将细胞在37摄氏度下孵育。对于诱导多能干细胞来源的心肌细胞的阿霉素处理，弃去诱导多能干细胞来源心肌细胞孔中的培养基，并用PBS洗涤细胞。在37摄氏度下，用1 µM阿霉素处理细胞4小时。吸弃培养基，用 PBS 洗涤细胞。进行免疫标记时，用 PBS 洗涤细胞三次，每孔加入 200 微升新鲜配制的 4% 多聚甲醛。室温避光固定细胞 20 分钟。用 PBS 洗涤细胞后，每孔加入 200 µL 封闭缓冲液，在室温湿润环境中封闭 30 分钟。移除封闭缓冲液，每孔加入 200 µL 一抗溶液。在室温避光湿润环境中孵育 45 分钟后，用 PBS 洗涤 3 次。 吸去 PBS，每孔加入 200 微升二抗混合液。室温下避光湿盒中孵育 45 分钟。随后用 PBS 洗涤 3 次。使用抗荧光淬灭剂封片前，用去离子水洗涤。加盖盖玻片，并将载玻片置于黑暗环境中，4°C保存。使用共聚焦显微镜，对每个样本随机选取3至5个视野进行成像，随后进行图像分析。为了计数DNA损伤应答焦点，请下载并安装CellProfiler。从文件中选择导入流程，并选择名为puncti gamma-H2AX的流程文件。将包含已获取的gamma-H2AX焦点图像的文件夹拖放到输入模块图像部分的文件列表窗口中以进行分析。然后按照文本方案中所示的说明进行操作。要设置图像的参数，请将需要分析的图像拖动到文件列表中。在输入模块下，选择图像。在输入模块中，同样选择元数据，然后选择名称和类型。对于组，请选择“否”。在分析模块中操作时，选择彩色转灰度。然后选择平滑，选择识别主要物体，再次选择平滑。接着选择增强或抑制特征，然后选择识别主要物体。仍在分析模块中操作，依次选择关联物体、分类物体，最后选择导出至电子表格。单击左下方面板中的“分析图像”以执行图像分析。分析成功完成后，将生成多幅图像。请注意生成的 CSV 文件，并将其保存在计算机的适当位置。此文件包含用于进一步分析的定量数据。在名为“my experiment image”的电子表格中，B列记录含有不超过五个点状信号的细胞核数量，D列记录含有超过五个点状信号的细胞核数量。将B列和D列相加，可获得细胞核总数。对所有图像重复这些步骤，每次分析前更改“my experiment”文件名。此处展示了经多柔比星处理与未处理的iPS细胞彗星实验的代表性显微图像。在iPS细胞中检测到基础水平的DNA损伤，以DNA损伤比例和尾矩表示。然而，正如预期的那样，阿霉素处理增加了iPS细胞中的DNA损伤，表明彗星实验可用于评估多能干细胞中的DNA完整性。此处展示了γ-H2AX免疫标记的代表性显微图像，包括低倍和高倍放大图像。在对照组iPS来源的心肌细胞中，超过90%的细胞每个细胞核的DNA损伤应答（DDR）焦点少于五个。在培养六个月的iPS来源心肌细胞中，少于90%的细胞每个细胞核内含有不超过五个DNA损伤应答（DDR）焦点，且超过13%的细胞每个细胞核内含有超过六个DDR焦点。而在培养六个月的原代心肌细胞中，少于10%的细胞每个细胞核内含有超过六个DDR焦点。相比之下，在阿霉素（doxo）处理的iPS来源心肌细胞中，少于80%的细胞每个细胞核内含有不超过五个DDR焦点。约有24%的细胞每个细胞核中出现超过六个DNA损伤应答（DDR）焦点。该数据表明，长期培养iPS来源的心肌细胞并进行多柔比星（doxo）处理会引发显著的DNA损伤，导致这些细胞不适合用于细胞移植。在混悬细胞时，避免引入变量至关重要，因为这可能会影响电泳结果。通过此操作步骤，您可以对多种类型的细胞进行彗星实验和免疫标记操作。这些技术将有助于在细胞移植研究中使用前，评估各类细胞的DNA损伤情况。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

心脏细胞治疗中干细胞 dna 完整性的评估

通过密度沉降法分离心脏细胞核，并使用抗中心粒周围物质1（PCM-1）抗体对细胞核进行免疫标记，以通过流式细胞术识别和分选心肌细胞核。...

从死后组织中分离心肌细胞核

本文介绍了一种利用 LacI 转基因小鼠模型，针对少量纯化的造血细胞进行 体内 诱变分析的实验方法。 可通过分离 LacI...

在纯化的造血干细胞/祖细胞中鉴定DNA突变

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

心肌细胞更新率的定量具有挑战性。本文所述方案通过实现对新生心肌细胞核生成及细胞核倍性的准确且灵敏的定量，为解决这一难题做出了重要贡献。...

同时评估心肌细胞DNA合成与倍性：一种辅助量化心肌细胞再生与更新的方法

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。...

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。...

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本文的总体目标是规范从小鼠成年心脏中分离、鉴定和分化心脏干细胞（CSCs）的实验方案。本文介绍了一种利用密度梯度离心法分离小鼠心脏干细胞的方法，并详细阐述了心脏干细胞的培养、增殖以及向心肌细胞分化的具体方法。...

从小鼠成年心脏中分离、鉴定及分化心脏干细胞

在本方案中，我们演示并详细阐述了如何利用人诱导性多能干细胞进行心肌细胞分化与纯化，以及如何通过Rho相关蛋白激酶抑制剂预处理，在小鼠心肌梗死模型中进一步提高其移植效率。...

通过瞬时抑制Rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活

在此，我们展示了一种利用二维人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）单层在柔性基底上培养，并结合基于视频的显微镜技术，用于无创评估心脏医疗设备收缩力的方法。该工具将有助于 体外...

在二维人源干细胞衍生心肌细胞中评估心脏收缩力调节治疗

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。...

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

了解评估干细胞DNA完整性的实验方案，用于心脏再生治疗前的细胞质量检测。本方法通过彗星实验和免疫标记技术确保移植细胞的安全性，提高再生医学治疗效果。

评估用于心脏细胞治疗的干细胞DNA完整性

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