评估用于心脏细胞治疗的干细胞DNA完整性

对于心肌病等新生儿疾病，利用诱导多能干细胞衍生细胞进行再生治疗具有巨大潜力。然而，体外加速细胞生长会导致活性氧等代谢产物积累，从而引起DNA损伤。移植这些DNA受损的细胞将导致器官移植效果不佳及再生能力下降。

移植前应评估细胞的质量。本文提供了两个分步方案，用于评估干细胞中的DNA损伤。示范操作流程的人员包括研究人员杰西卡·米勒（Jessica Miller）、研究人员尼基尔·马德赫卡尔（Nikhil Mardhekar）以及实验室技术员瓦桑蒂·拉贾塞卡尔（Vasanthi Rajasekaran）。

首先，将500毫克低熔点琼脂糖加入100毫升DNA-RNA-free水中。将瓶子放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。然后，将瓶子置于37°C水浴中，待用。

为制备预包被的彗星电泳载玻片，先在玻璃载玻片上滴加数滴0.5%琼脂糖。立即用盖玻片将琼脂糖均匀铺展，形成一层薄薄的琼脂糖包被层。在避光条件下操作，以避免紫外线引起的细胞损伤，将10微升细胞悬液与90微升琼脂糖溶液在离心管中混合。

将试管置于37°C水浴中，以防止琼脂糖凝固。混合溶液时避免引入气泡，并用移液器将每点70 µL的溶液滴加到预先包被的彗星电泳载玻片上。使用移液器吸头将细胞与琼脂糖混合物涂布成一层薄层。

将载玻片置于 4°C 环境中 15 分钟。在容器中，用预冷的裂解缓冲液完全浸没载玻片。将容器置于 4°C 黑暗环境中孵育 1 小时。

用冷的碱性溶液替换裂解缓冲液，确保载玻片完全浸没。将容器置于4°C黑暗环境中静置30分钟后，将载玻片放入水平电泳槽中。

将电泳槽中加入冷的碱性电泳缓冲液，直至载玻片完全浸没。以每厘米1伏的电压电泳15至30分钟。在容器中，将载玻片完全浸入冷的去离子水中。

两分钟后，移除去离子水并加入新鲜的去离子水，然后重复此步骤一次。接着，将去离子水替换为冷的70%乙醇。五分钟后，轻轻取出载玻片，避免倾斜，并使其自然晾干。

干燥后，向每个点加入100 µL稀释的DNA染料，在室温下静置15分钟。使用落射荧光显微镜的FITC滤光片，每份样品共采集50至100个彗星图像。按照文本方案中所述培养iPS来源的心肌细胞。

为了观察培养皿载玻片中的诱导多能干细胞来源的心肌细胞，首先弃去孔中的培养基，并用 PBS 洗涤细胞三次。每孔加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶，于 37 摄氏度孵育 5 分钟。在显微镜下观察细胞是否已脱落。

然后加入1 mL CMM以终止胰蛋白酶的作用。将细胞悬液放入15 mL离心管中，在4 °C、200 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液，加入1 mL CMM，重悬细胞。

计数细胞，并调整细胞数量，使1.6毫升CMM中含有两百万个细胞。然后将200微升细胞悬液接种到八孔板的每一孔中。轻轻敲击玻片，使细胞在孔内均匀分布。

将细胞在37摄氏度下孵育。对于诱导多能干细胞来源的心肌细胞的阿霉素处理，弃去诱导多能干细胞来源心肌细胞孔中的培养基，并用PBS洗涤细胞。在37摄氏度下，用1 µM阿霉素处理细胞4小时。

吸弃培养基，用 PBS 洗涤细胞。进行免疫标记时，用 PBS 洗涤细胞三次，每孔加入 200 微升新鲜配制的 4% 多聚甲醛。室温避光固定细胞 20 分钟。

用 PBS 洗涤细胞后，每孔加入 200 µL 封闭缓冲液，在室温湿润环境中封闭 30 分钟。移除封闭缓冲液，每孔加入 200 µL 一抗溶液。在室温避光湿润环境中孵育 45 分钟后，用 PBS 洗涤 3 次。

吸去 PBS，每孔加入 200 微升二抗混合液。室温下避光湿盒中孵育 45 分钟。随后用 PBS 洗涤 3 次。

使用抗荧光淬灭剂封片前，用去离子水洗涤。加盖盖玻片，并将载玻片置于黑暗环境中，4°C保存。使用共聚焦显微镜，对每个样本随机选取3至5个视野进行成像，随后进行图像分析。

为了计数DNA损伤应答焦点，请下载并安装CellProfiler。从文件中选择导入流程，并选择名为puncti gamma-H2AX的流程文件。将包含已获取的gamma-H2AX焦点图像的文件夹拖放到输入模块图像部分的文件列表窗口中以进行分析。

然后按照文本方案中所示的说明进行操作。要设置图像的参数，请将需要分析的图像拖动到文件列表中。在输入模块下，选择图像。

在输入模块中，同样选择元数据，然后选择名称和类型。对于组，请选择“否”。在分析模块中操作时，选择彩色转灰度。

然后选择平滑，选择识别主要物体，再次选择平滑。接着选择增强或抑制特征，然后选择识别主要物体。仍在分析模块中操作，依次选择关联物体、分类物体，最后选择导出至电子表格。

单击左下方面板中的“分析图像”以执行图像分析。分析成功完成后，将生成多幅图像。请注意生成的 CSV 文件，并将其保存在计算机的适当位置。

此文件包含用于进一步分析的定量数据。在名为“my experiment image”的电子表格中，B列记录含有不超过五个点状信号的细胞核数量，D列记录含有超过五个点状信号的细胞核数量。将B列和D列相加，可获得细胞核总数。

对所有图像重复这些步骤，每次分析前更改“my experiment”文件名。此处展示了经多柔比星处理与未处理的iPS细胞彗星实验的代表性显微图像。在iPS细胞中检测到基础水平的DNA损伤，以DNA损伤比例和尾矩表示。

然而，正如预期的那样，阿霉素处理增加了iPS细胞中的DNA损伤，表明彗星实验可用于评估多能干细胞中的DNA完整性。此处展示了γ-H2AX免疫标记的代表性显微图像，包括低倍和高倍放大图像。在对照组iPS来源的心肌细胞中，超过90%的细胞每个细胞核的DNA损伤应答（DDR）焦点少于五个。

在培养六个月的iPS来源心肌细胞中，少于90%的细胞每个细胞核内含有不超过五个DNA损伤应答（DDR）焦点，且超过13%的细胞每个细胞核内含有超过六个DDR焦点。而在培养六个月的原代心肌细胞中，少于10%的细胞每个细胞核内含有超过六个DDR焦点。相比之下，在阿霉素（doxo）处理的iPS来源心肌细胞中，少于80%的细胞每个细胞核内含有不超过五个DDR焦点。

约有24%的细胞每个细胞核中出现超过六个DNA损伤应答（DDR）焦点。该数据表明，长期培养iPS来源的心肌细胞并进行多柔比星（doxo）处理会引发显著的DNA损伤，导致这些细胞不适合用于细胞移植。在混悬细胞时，避免引入变量至关重要，因为这可能会影响电泳结果。

通过此操作步骤，您可以对多种类型的细胞进行彗星实验和免疫标记操作。这些技术将有助于在细胞移植研究中使用前，评估各类细胞的DNA损伤情况。