人类多能干细胞有效分化为肝细胞

这种方法能够产生大量的人类肝芽祖细胞和高纯度的肝细胞样细胞。产生这些肝细胞的能力对于再生医学和其他领域可能很重要。通过控制发育信号通路，促进肝脏分化，抑制不需要的细胞类型的形成，这种方法使人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞分别有效生成6天和18天的分化。

这项技术的主要优点是产生的人类肝细胞纯度高。要执行此过程，请将 50 毫升 IMDM 添加到包含搅拌棒的圆锥烧瓶中。加热到50摄氏度的介质，加入0.5克PVA，同时连续搅拌，以每毫升10毫克的浓度准备PVA库存。

在此之后，从加热垫上取出 PVA 溶液，让其冷却至室温。冷却溶液后，通过无菌的 0.2 微米过滤器进行过滤。通过将过滤的PVA与其他试剂结合，准备CDM2和CDM3，如文本协议表之一所述。

使用无菌 0.2 微米过滤器过滤所有介质。然后，编写其余基本介质，如案文议定书表一所述，清洁发展机制4和清洁发展机制5。要准备分化介质，首先在室温下解冻冷冻小分子和/或生长因子。

将所需量的基介质分出，并在适当的浓度下将指定的小分子和生长因子添加到基介质中。使用前一天，在摄氏四度时解冻矩阵。第二天，将500微升基质加入50毫升冷DMEM，以1比100的比例稀释基质。

使用足够体积的溶液将稀释的基体移入所需数量的油井中，以覆盖油井表面。将基质涂层板转移到 37 摄氏度的培养箱中至少 60 分钟。在播种之前，立即从涂层孔中吸出剩余的基质溶液。

然后，从大部分汇合的 hPSC 培养板中吸出介质，并添加商业购买的分离剂，确保仅使用足够的介质来覆盖细胞生长的表面。在37摄氏度下孵育分离剂中的hPSCs5分钟，或直到一些菌落开始分离。接下来，添加DMEM和F-12以稀释分离剂。

使用五毫升血清移液器多次轻轻上下移液器，以洗掉井表面的所有细胞。在50毫升锥形管中收集重新暂停的单细胞，并根据需要用DMEM和F-12稀释。将收集的hPSCs管在350倍g和4摄氏度下离心3分钟，以对细胞进行分粒。

在等待离心时，从将播种 hPSC 的板中吸出矩阵。向接收井添加足够数量的 mTeSR 介质以覆盖它们。离心完成后，小心吸进上清液，将颗粒的 hPSC 留在锥形管的底部。

在 mTeSR 中重新补充细胞颗粒，并辅以商业获得的蒂亚佐维文的微摩尔。使用P1000移液器，轻轻三重搅拌两到三次，均匀地将细胞颗粒重新悬浮到单个细胞悬浮液中。立即移液10微升细胞悬浮成血细胞计并计算细胞数量。

使用硫酮补充的 mTeSR 调节重新消耗的 hPSCs 的体积，以实现电镀所需的细胞浓度。然后，以交叉图案摇动板几次，以确保细胞均匀分布。在hPSC镀上至少24小时后，使用相位对比显微镜检查细胞的形态，并特别强调镀hPSC菌落的直径。

接下来，准备第一天 APS 差异化介质，如文本协议表二所示。播种后一天，从镀制的 hPSC 中吸出蒂亚佐维文补充的 mTeSR，然后用 IMDM 介质短暂清洗。在此之后，向 hPSC 添加第一天介质。

记录时间，将细胞放回37摄氏度的培养箱。继续后续的分化步骤，准备所需的分化介质，并在一天中同一时间将该介质添加到各自的分化日。在这项研究中，丰富的肝芽祖细胞和随后的肝细胞样细胞由hPSC产生。

到分化的第二天，原始条纹细胞已经分化成第二天明确的内皮细胞。这些细胞中绝大多数表示SOX17和FOXA2。到分化的第三天，内端细胞已经分化成前体祖细胞，在形状上出现多边形。

后来，到了第六天，前祖人分化成肝芽祖体。这些肝芽祖体表达 AFP、TPX3 和 HNF4alpha。在三条hPSC生产线上，这种方法产生第六天 AFP 阳性肝祖细胞，效率约为 89% 最后，在与 hPSC 的 18 天肝脏分化后，会出现白蛋白阳性的肝细胞样细胞。

从形态学上来说，这些细胞出现上皮，形成明亮的边界，让人联想到胆汁。在这个阶段，18 hPSC衍生的肝细胞的细胞质看起来比核暗。当播种人类多能干细胞进行分化时，必须以正确的密度播种它们，并且通过摇动板将它们分布在井中。

在体外产生人类肝细胞的能力是一种使能技术，使科学家能够研究肝脏发育的基础机制。这种方法在体外产生大量的人类肝细胞，可用于研究肝功能和疾病，并最终为肝衰竭提供新的疗法。