Name: 人类多能干细胞有效分化为肝细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 了解人类多能干细胞分化为肝细胞的高效方法，通过无血清培养条件在18天内获得高纯度肝样细胞。该技术可推进再生医学和肝脏疾病研究的发展。

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我们感谢 Bing Lim&#160;用于讨论以及斯坦福干细胞生物学研究所 &amp;#38; 再生医学的基础设施支持。本研究工作得到了加州再生医学研究所（DISC2-10679）、斯坦福大学-加州大学伯克利分校Siebel干细胞研究所（资助对象：L.T.A. 和 K.M.L.）、斯坦福贝克曼分子与遗传医学中心，以及Anonymous、Baxter和DiGenova家族（资助对象：K.M.L.）的支持。

1. 分化培养基的制备
注意：有关所用材料和试剂的制造商信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>基础化学成分明确培养基（CDM）的制备 
	注意：CDM2、CDM3、CDM4 和 CDM5 是化学成分明确的培养基，用作将人多能干细胞（hPSCs）在不同阶段分化为肝细胞的基础培养基。这些培养基的组成见表1。
	<ol>
		<li>配制 CDM2 或 CDM3 时，需先配制含聚乙烯醇（PVA）的储存液。将 0.5 g PVA 粉末溶解于 50 mL 改良伊格尔-达贝科培养基（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, IMDM）中，制成浓度为 10 mg/mL 的 PVA 储存液。 
		注意：由于 PVA 不易溶解，建议将 PVA 与 IMDM 的混合物置于锥形瓶中，在加热板上约 50 °C 条件下持续搅拌；可使用磁力搅拌器实现有效搅拌。</li>
		<li>待&#160;PVA 在 IMDM 中均匀溶解后，将 PVA 溶液从加热板上取下，并静置冷却至室温。</li>
		<li>使用无菌的 0.2 µm 滤器对 PVA 溶液进行过滤。</li>
		<li>根据表1和材料表中列出的成分，将步骤 1.1.1 中过滤后的 PVA 溶液与其他市售组分混合，配制 CDM2 和 CDM3。所有培养基均需使用无菌的 0.2 µm 滤器单元进行过滤。 
		注意：基础培养基可在 4 °C 保存，但不得超过 2 个月。</li>
		<li>按照表1配制其余的基础培养基 CDM4 和 CDM5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分化培养基的制备
	<ol>
		<li>为小分子化合物和生长因子配制储存液时，应按照生产商推荐的方法进行重悬。为便于储存，建议分装至无菌管中以减少冻融循环次数，并于 -20 °C 或按推荐条件保存。 
		注意：各分化阶段所用分化培养基的组成详见表2及以下步骤。</li>
		<li>配制分化培养基时，首先将冷冻保存的小分子化合物和/或生长因子在室温下解冻；然后取所需体积的基础培养基进行分装；最后，按照指定浓度将相应的小分子化合物和生长因子加入基础培养基中，配制成终末分化培养基（表2）。 
		注意：建议当日配制的分化培养基当日使用；若未使用，可于 4 °C 保存并在三天内使用完毕。</li>
		<li>使用移液器枪头反复吹打数次，确保添加至细胞前分化培养基中的添加剂均匀分布（例如，向 12 孔板的每个孔中加入 1 mL 分化培养基）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 以特定密度将hPSCs接种至培养板以进行分化
<ol>
	<li>对将用于接种人多能干细胞（hPSCs）的细胞培养塑料器皿进行包被。
	<ol>
		<li>使用前一天，在4 °C条件下过夜解冻基质（如Geltrex）。</li>
		<li>第二天，将基质以1:100的比例稀释，即将500 μL基质加入50 mL冷的DMEM/F12培养基中。由于该基质是一种在室温下暴露后会不可逆聚合的水凝胶，因此操作基质时，务必始终将基质管和培养基置于冰上。</li>
		<li>注意： 基质以1:100比例溶于DMEM/F12后可保存于4 °C，但应在2个月内使用。</li>
		<li>为用基质包被培养板，使用移液器将稀释后的基质加入所需数量的孔中，加入的基质溶液体积以恰好覆盖孔表面为宜（例如，向12孔板的1个孔中加入0.5 mL基质，或向6孔板的1个孔中加入1 mL基质）。如有需要，可轻轻摇动培养板，确保基质溶液完全覆盖孔底。</li>
		<li>将包被基质的培养板置于37 °C培养箱中孵育至少60分钟。在此温度下，基质会聚合形成位于孔底部的薄膜。</li>
		<li>注意： 基质包被的培养板可置于37 °C培养箱中保存，并在基质未干燥的前提下于3日内使用。</li>
		<li>在将hPSCs接种至包被好的孔板前，立即吸除残留的基质溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用hPSCs对包被的培养板进行传代和接种 
注意：解离试剂含有可解离细胞的酶，因此必须尽可能缩短hPSCs在解离试剂中的停留时间。
	<ol>
		<li>在进行分化前，将未分化的hPSCs培养至适当状态，以接种于基质包被的培养板中 &#62;70% 汇合度，使用商业化的 mTeSR1 培养基（材料表) 按照制造商提供的方案进行操作。在hPSCs达到完全汇合之前进行传代至关重要，因为hPSCs在高汇合度下可能发生自发分化。 
		注意：&#160;人多能干细胞（hPSCs）在用于实验前必须进行核型分析，以确保不存在染色体异常。本分化方案所用的hPSCs在mTeSR1培养基中维持培养，并以EDTA处理形成细胞团块的方式进行传代，以尽量减少核型异常的发生。核型异常的hPSCs不应用于分化实验，因其可能异常快速增殖；因此，本文推荐的细胞接种密度不适用于核型异常的细胞。</li>
		<li>为了将hPSCs接种以进行分化，吸除接近完全汇合的hPSC培养物中的mTeSR1，并加入市售的解离试剂（材料表) 消化hPSCs时，使用刚好能覆盖细胞生长孔或培养皿表面的消化试剂体积（例如，每孔12孔板加入0.5 mL消化试剂，每孔6孔板加入1 mL，每个10 cm培养皿加入3 mL）。</li>
		<li>将hPSCs在解离试剂中于37 °C孵育5分钟，或直至部分集落开始脱落。轻轻敲击孔板/培养板底部数次；经过数分钟解离后，大多数hPSC集落应自行悬浮于溶液中。</li>
		<li>为使解离的hPSCs从培养板上脱落，若使用6孔板，则每孔加入2 mL DMEM/F12（若使用12孔板，则每孔加入1 mL）以稀释解离试剂。用5 mL血清移液管轻柔吹打数次，将细胞从孔壁表面完全冲洗下来；收集重悬的单细胞至50 mL锥形管中。用相同体积的DMEM/F12再次洗涤培养板一次，以确保回收全部hPSCs。</li>
		<li>向含有细胞的50 mL离心管中加入DMEM/F12，将消化剂的原始体积稀释至1:5–1:10（例如，若消化剂的原始体积为1 mL，则用DMEM/F12将细胞悬液总体积调至10 mL，使消化剂稀释比例达到1:10）</li>
		<li>将收集的hPSCs在50 mL锥形管中以350 x g离心 g 4 °C下离心3分钟以收集细胞。</li>
		<li>在等待细胞离心成团的同时，吸除将要接种hPSC的培养板中的基质。随后，加入足量的mTesR1培养基，并补充1 μM商品化的噻唑紫定（一种药理学ROCK抑制剂）。&#160; 向受体孔中加入培养基以覆盖细胞（例如，每孔12孔板加入0.5 mL mTeSR1，或每孔6孔板加入1 mL mTeSR1）。 
		注意： 在此步骤中加入低浓度的 Thiazovivin，以提高单细胞存活率，从而增加 hPSCs 的后续接种密度。&#160;</li>
		<li>离心hPSCs后，小心吸除上清液，保留锥形管底部的hPSCs沉淀。上清液中含有解离试剂，会抑制hPSCs后续的贴壁，因此在进行下一步操作前，必须尽可能吸除绝大部分上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于添加了1 μM噻唑紫檀素的mTeSR1培养基中。使用1000 μL移液枪轻柔吹打2-3次，使细胞沉淀均匀重悬为单细胞悬液。切勿过度吹打细胞沉淀，以免机械力过大损伤人多能干细胞（hPSCs），导致细胞存活率降低。</li>
		<li>重悬hPSCs后，立即用移液器吸取10 μL细胞悬液加入血细胞计数板，计数细胞数量。进行细胞计数时应尽快移取细胞悬液，因为重力作用会导致hPSCs自然沉降到50 mL离心管底部，从而影响细胞计数的准确性。</li>
		<li>用添加了thiazovivin的mTeSR1培养基调整重悬的hPSC体积，以达到铺板所需的细胞浓度。例如，在调整重悬hPSC体积后，每孔加入0.5 mL细胞悬液，使每个12孔板孔中接种160,000–250,000个细胞，从而使每孔总体积达到1 mL（其中0.5 mL培养基已在步骤2.2.7中加入孔内）。若使用更大或更小的孔板，应相应地按比例增加或减少细胞数量和培养基体积。 
		注意： 以指定的细胞密度接种hPSCs至关重要。hPSCs密度过高会导致分化效率降低，而密度过低则会在分化过程中导致细胞存活率不佳。&#160;</li>
		<li>以交叉方式振荡培养板（先向左，再向右；然后向前，再向后）数次，确保细胞在培养板/孔内均匀分布。切勿以环形方式旋转培养板，否则细胞会聚集于培养板/孔的中央。通常情况下，hPSCs 将在接种后约 3–30 分钟内开始黏附于孔表面。&#160;最少培养24小时后，再开始诱导细胞分化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将人多能干细胞分化为内胚层细胞和肝祖细胞
<ol>
	<li>在人多能干细胞（hPSC）接种后至少培养24小时（如步骤2.2.12所述），在进行分化前，需在相差显微镜下检查细胞形态，重点关注接种的hPSC克隆的直径和密度。 
	注意： 理想情况下，在进入步骤3.2之前，克隆应分布均匀，大小和密度适宜。过大（约 &#62;400 μm）或过小（约 &#60;200 μm）的hPSC克隆均不适用于分化（图4）。过大的hPSC克隆中，分化信号无法均匀作用，导致分化效率低下；而过小的克隆在此分化方案的前3天内存活率较差。若接种的hPSC密度合适，则克隆之间常会形成细胞“桥接”，在加入第1天分化培养基前，整体汇合度约为30–50%（图4）。</li>
	<li>若在步骤3.1中克隆大小理想，则进入分化的第1天，即将hPSC分化为前部原始条带（anterior primitive streak, APS）。</li>
	<li>通过将 表2 中列出的所有试剂加入CDM2基础培养基（表1 和第1.2节）来配制第1天APS分化培养基。用移液器反复吹打数次，以确保各组分在培养基中均匀分布。</li>
	<li>吸除接种hPSC孔板中的含thiazovivin的mTeSR1培养基，并用IMDM培养基短暂清洗hPSC。切勿使用磷酸盐缓冲液（PBS）替代IMDM进行清洗，因为PBS缺乏钙离子（Ca2+），对hPSC具有毒性，会导致细胞形态破坏。</li>
	<li>短暂使用IMDM清洗后，向hPSC中加入第1天分化培养基。记录时间，并将细胞放回37 °C培养箱中。</li>
	<li>继续后续分化步骤：按照 表2 配制相应的分化培养基，并在每天大致相同的时间点（每隔24小时）更换培养基（图1）。即使连续几天使用的分化培养基相同，也需每日更换新鲜培养基。每次换液之间，用IMDM培养基清洗细胞一次，以去除死亡细胞及前一培养基成分的残留。</li>
	<li>随着分化进程超过肝芽阶段，细胞数量增加，因此需向每孔中添加更多培养基，以确保分化因子和营养物质不成为限制因素。例如，在分化第1至6天，初始向12孔板每孔加入1 mL分化培养基；而在后续分化阶段（分化第7至18天），每孔应加入1.5–2 mL分化培养基。</li>
</ol>
4. 通过免疫染色对内胚层细胞和肝祖细胞进行表征
<ol>
	<li>配制封闭缓冲液：将10%驴血清和0.1% Triton X100溶于去离子磷酸盐缓冲液（DPBS）中。</li>
	<li>配制染色缓冲液：将1%驴血清和0.1% Triton X100溶于DPBS中。</li>
	<li>从12孔板中的细胞中吸除培养基。</li>
	<li>加入4%多聚甲醛（溶于DPBS）于室温孵育15分钟以固定细胞，随后用DPBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>加入封闭缓冲液于室温孵育1小时，以封闭并通透固定后的细胞。</li>
	<li>吸除封闭液，加入用染色缓冲液稀释的一抗。（抗体稀释比例见材料表。）</li>
	<li>于4 °C孵育过夜进行细胞染色。</li>
	<li>用含0.1% Triton X100的DPBS洗涤细胞三次。</li>
	<li>加入用染色缓冲液稀释的二抗，于室温孵育1小时。（二抗稀释比例见材料表。）</li>
	<li>去除二抗溶液，加入DAPI于室温孵育5分钟，进行细胞核复染。</li>
	<li>用含0.1% Triton X100的DPBS洗涤两次，以去除多余的抗体和DAPI。</li>
	<li>使用Zeiss Observer D1进行荧光显微镜观察。或者将培养板置于4 °C保存直至成像。预期结果见图3。</li>
</ol>
5. 通过荧光激活细胞分选（FACS）分析对肝前体细胞进行表征
注意：使用流式细胞术（FACS）精确定量在分化第6天出现的AFP+分化型LB细胞的百分比。按照相同步骤，定量在分化第18天出现的ALB+分化型肝细胞的百分比。
<ol>
	<li>结合抗AFP&#160;抗体</li>
	<li>向抗AFP中加入R-藻红蛋白&#160;抗体，浓度为 0.55 µg/µL，使用 R-藻红蛋白偶联试剂盒（见 材料表). 
	注意： 确保所用抗体经过纯化，且重悬于不含胺类的缓冲液中。标记反应中所用抗体的量必须少于PE的量（例如，60 µg 抗体与 100 µg PE）。抗体偶联效果不佳可能导致结果不可靠。</li>
	<li>向每10 µL待标记抗体中加入1 µL修饰试剂，轻轻混匀。</li>
	<li>移除R-PE混合液（100 µL），并将上述混合液直接用移液器加入到冻干的R-PE材料中。</li>
	<li>盖上瓶盖，室温避光静置 3 h。</li>
	<li>孵育3小时或更长时间后，每使用10 µL抗体加入1 µL淬灭试剂。标记产物在30分钟后即可使用。</li>
	<li>将偶联抗体于 4 °C 保存。</li>
	<li>用 DMEM/F12 洗涤6孔板中的已分化或未分化hPSCs。</li>
	<li>用解离试剂（6孔板每孔1 mL）在室温下短暂处理5分钟，直至细胞脱落。在同一实验中平行收集并相同处理未分化的hPSC和已分化的肝前体细胞，进行同步染色和分析，以确保抗体染色的特异性。</li>
	<li>轻轻敲击培养皿以使细胞脱落。使用1000 μL移液器将细胞从培养板上吹下，并收集至50 mL锥形管中。确保大部分细胞已脱落后再进行下一步操作。随后，用1×DPBS缓冲液将孔板洗涤两次，以收集残留细胞。</li>
	<li>在50 mL锥形管中，用约5倍体积的1×DPBS缓冲液稀释解离试剂。使用p1000移液器剧烈吹打3–4次，确保所有细胞解离为单细胞。 
	注意： 必须制备单细胞悬液 之前 离心后形成的细胞团块难以再次分散。然而，切勿过度吹打，以免损伤细胞完整性。计数细胞数量，并采用先前优化过的细胞与抗体比例，以确保背景信号最小化和目标信号检测最大化。</li>
	<li>离心含有细胞悬液的锥形管，300 x g g 4 °C下离心5分钟。</li>
	<li>小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀充分重悬于固定/透化缓冲液中，制成单细胞悬液，置于冰上4 °C固定20分钟。注意转移至2 mL微量离心管中。此外，此步骤使用2 mL微量离心管可使细胞沉淀聚集于管底V形角落，从而在洗涤过程中最大限度减少细胞损失。</li>
	<li>用 1.8 mL 破膜/洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，涡旋混匀 6 次（使用 p1000 移液器），然后离心，弃上清液，重复洗涤一次。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于破膜/洗涤缓冲液中，使每种染色反应体系为100 µL，随后将细胞悬液转移至2 mL微量离心管中。 
	注意： 此步骤中，必须在抗体染色前制备单细胞悬液。细胞团块无法被有效染色，从而干扰FACS分析结果。此外，使用2 mL微量离心管可使细胞沉淀聚集于管底V形区域，从而在洗涤过程中最大限度减少细胞损失。</li>
	<li>将细胞重悬于FACS缓冲液后，分装至各2 mL离心管中（包括未染色对照和抗体染色样本）。</li>
	<li>用抗AFP-PE抗体染色，每150,000个细胞加入0.33 µL，室温避光孵育30分钟。例如，进行100 µL单个染色时，操作如下：加入0.33 µL anti-AFP-PE抗体和100 µL透化/洗涤缓冲液。使用p200移液器充分重悬细胞，确保染色均匀。 
	注意： 仅使用移液器混匀，不要涡旋振荡，因为这可能会降低蛋白质稳定性。</li>
	<li>洗涤，用 1-2 mL 破膜/洗涤缓冲液（每种染色 1.9 mL）重悬细胞两次，800 × g 离心 g 4 °C下孵育5分钟。用不少于1-2 mL的破膜/洗涤缓冲液洗涤细胞，以确保充分洗涤。 
	注意： 仅使用移液器混匀，不要涡旋振荡，以免降低蛋白质稳定性。离心后，小心吸除上清液，避免细胞脱落，并尽可能彻底去除上清液，以最大限度减少抗体残留，确保洗涤更充分。</li>
	<li>将每次洗涤后的沉淀物重悬于300 μL破膜/洗涤缓冲液中，经100 μm滤膜过滤至FACS管中，以去除细胞大团块，再进行FACS分析。</li>
	<li>在FACS Aria流式细胞仪的PE通道上分析细胞。每种单独染色至少分析10,000个事件，并根据FSC-A/SSC-A分析对事件进行圈选，通过FSC-W/FSC-H设门选择单细胞，再结合SSC-H/SSC-W进一步确认单细胞。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法能够从人多能干细胞（hPSCs）诱导产生富集的肝芽祖细胞，并进一步分化为肝细胞样细胞。获得高纯度的人类肝细胞群体对于此类细胞的实际应用至关重要。以往由hPSCs诱导生成肝细胞的方法所获得的细胞群体纯度较低，其中包含肝细胞与非肝细胞，在移植至啮齿类动物体内后，除肝脏组织外，还会形成骨和软骨组织15。因此，明确抑制非肝系分化是获得可用于多种应用的富集肝细胞群体的关键。
值得注意的是，在第一步中对hPSCs进行可控接种对于高效的后续分化至关重要。进行分化时，必须以特定的细胞密度准确接种hPSCs，并在接种过程中将这些hPSCs均匀分布于孔板或培养板的各个孔中。例如，对于12孔板的每个孔，接种160,000至250,000个hPSCs；总体而言，必须对细胞接种密度进行滴定，并最终测试出适用于每种细胞系的最佳细胞密度（图4）。若每个孔接种的hPSCs过多，则会形成较大的细胞集落，这将对分化效率产生不利影响，因为大型集落中心区域的细胞相比边缘区域的细胞更难接收到分化信号；而大小不均...

本实验方案的目的是高效地将人多能干细胞（hPSCs）分化为富集的肝芽祖细胞和肝样细胞群体2。获得可随时使用的大量人肝祖细胞和肝样细胞，将加速对肝脏功能与疾病的研究，并可能为肝功能衰竭提供新的细胞移植治疗策略3,4,5。过去这一目标一直具有挑战性，因为hPSCs（包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞）具有分化为人体所有细胞类型的潜能；因此，很难将其特异性地完全分化为单一细胞类型（如肝细胞）的纯群体6。
为了精确地将人多能干细胞（hPSCs）分化为肝细胞，首先不仅需要理解肝细胞是如何被特化的，还需要了解非肝细胞类型的发育过程。了解非肝细胞的发育机制对于在分化过程中逻辑性地抑制非肝细胞谱系的形成至关重要，从而可将hPSCs exclusively诱导至肝细胞命运2。其次，必须明确hPSCs向肝细胞命运分化的多个发育阶段。已知hPSCs会依次分化为多个细胞类型，即原始条纹（APS）、定型内胚层（DE）、后前肠（PFG）和肝芽前体细胞（LB），最终形成肝样细胞（HEP）。早期研究揭示了在每个发育谱系选择过程中，决定肝细胞命运的信号通路以及抑制其他非肝细胞类型（包括胃、胰腺和肠前体细胞）形成的信号通路2,7,8。
总体而言，这些研究进展催生了一种无血清、单层培养的方法，可将人多能干细胞（hPSCs）逐步分化为原始条纹、定型内胚层、后部前肠、肝芽祖细胞，最终生成肝细胞样细胞2。该方法主要包括：以适当密度将hPSCs接种为单层细胞，配制六种含有生长因子和小分子（可调控多种发育相关信号通路）的分化培养基，并在18天内按顺序依次添加这些培养基以诱导细胞分化。在整个过程中，无需对细胞进行传代。值得注意的是，由于该方法明确引入了抑制非肝系细胞类型形成的信号，因此相较于现有的其他分化方法2,9,10,11,12，该分化策略1能更高效地生成肝祖细胞和肝细胞样细胞。此外，本文所述方案能够更快地获得终末分化的肝细胞，其肝特异性转录因子和酶的表达水平也高于其他方案所获得的肝细胞9,10,11,12。
本文所述方案相较于现有的分化方案具有若干优势。首先，该方案采用人多能干细胞（hPSCs）的单层分化，相较于依赖拟胚体等三维分化方法而言，技术操作更为简便13。其次，&#160;该方法利用了一项最新进展，即在hPSCs分化开始后的2天内即可高效、快速地生成定型内胚层细胞（肝细胞的早期前体细胞）2,7，从而能够后续产生纯度更高的肝细胞。第三，在平行对照比较中，该方法所产生的肝样细胞2比其他方法产生的肝细胞产生更多的ALBUMIN&#160;，并表达更高水平的肝特异性转录因子和酶类10,11,12。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;Geltrex</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>1:1 DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>0.2&amp;nbsp;&amp;mu;m 孔径膜滤器</td><td>Millipore</td><td>GTTP02500</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3845</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Accutase</td><td>Gibco 或 Millipore&amp;nbsp;</td><td>Gibco A11105，Millipore&amp;nbsp; SCR005</td><td></td></tr><tr><td>IMDM，GlutaMAX&amp;trade; 补充剂</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 营养混合物，GlutaMAX&amp;trade; 补充剂</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>KOSR，无血清替代物</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>化学成分明确的脂质浓缩液</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>人 Activin</td><td>R&amp;D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99201</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PI103</td><td>Tocris</td><td>2930/1</td><td></td></tr><tr><td>人 FGF2</td><td>R&amp;D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>DM3189</td><td>Tocris</td><td>6053/10</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>人 BMP4</td><td>R&amp;D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>C59</td><td>Tocris</td><td>5148</td><td></td></tr><tr><td>TTNPB</td><td>Tocris</td><td>0761/10</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099/10</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M</td><td>R&amp;D</td><td>295-OM</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Tocris</td><td>1126</td><td></td></tr><tr><td>Ro4929097</td><td>Selleck Chem</td><td>S1575</td><td></td></tr><tr><td>AA2P</td><td>Cayman chemicals</td><td>&lt;em&gt;16457&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>人重组胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>11061-68-0</td><td></td></tr></tbody></table>

高效分化人多能干细胞为肝细胞

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

肝脏具有解毒有害物质、分泌重要蛋白质以及执行关键代谢活动的功能，从而维持生命。因此，由长期饮酒、肝炎、急性中毒或其他损伤引起的肝功能衰竭是一种严重疾病，可能导致出血、黄疸、昏迷，最终死亡。然而，由于缺乏充足的人类肝细胞来源，肝功能衰竭的治疗手段以及肝脏功能与疾病的研究在一定程度上受到阻碍。为此，本实验方案详细描述了如何通过模拟肝脏发育过程的路线图，将人类多能干细胞（hPSCs）高效地分化为肝细胞样细胞，该路线图阐明了肝脏命运在连续六个分化阶段中的确立过程。通过调控发育相关的信号通路，促进肝脏分化并明确抑制非目标细胞命运的形成，该方法可在多能干细胞分化的第6天和第18天分别高效获得人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞。这一过程通过小分子化合物和生长因子在无血清培养基中对发育信号通路进行精确的时间控制来实现。该分化体系采用单层培养方式，所获得的肝细胞样细胞表达典型的肝细胞酶类，并具备植入慢性肝功能衰竭小鼠模型的能力。在体外高效生成大量人类肝细胞的能力，对肝功能衰竭的治疗、药物筛选以及肝脏疾病机制研究均具有重要意义。

APS 分化 24 小时后，细胞集落通常会呈现出与未分化集落不同的形态，同时失去通常环绕 hPSC 集落的明亮边缘。从形态学上看，原始条纹细胞的边界通常不规则，比 hPSC 更为铺展且紧密程度较低——这类似于体内多能性上胚层细胞分化并迁入原始条纹时所发生的上皮-间充质转化。若分化前 hPSC 的集落尺寸过大，则会出现明显隆起的中央区域，其中含有未分化的细胞。此类含有大块细胞团的培养物应予以弃用，因为这些未分化的集落中心会干扰后续的分化过程。若接种的细胞团尺寸和密度适当，APS 分化具有高度可重复性和均一性，可产生 99.3±0.1% MIXL1-Gfp+ 原始条纹细胞群体（MIXL1 为原始条纹标志物）7。需注意，APS 分化 24 小时后可观察到部分细胞死亡现象。
分化第2天时，原条细胞已分化为第2天的定型内胚层细胞，其中绝大多数表达SOX17（<strong class="xfig"...

本方案详细描述了一种单层、无血清的方法，可在18天内高效地将人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肝细胞样细胞。该过程包括六个阶段，hPSCs 依次分化为原始条纹、定型内胚层、后部前肠和肝芽前体细胞等中间细胞类型，最终形成肝细胞样细胞。

肝脏可解毒有害物质，分泌重要蛋白质，并执行关键的代谢活动，从而维持生命。因此，肝脏……

该方法能够高效地生成大量高纯度的人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞。生成这些肝细胞的能力可能对再生医学及其他领域具有重要意义。通过调控发育信号通路，促进肝脏分化并抑制非目标细胞类型的形成，该方法可在分化第6天和第18天分别高效获得人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞。该技术的主要优势在于所获得的人类肝细胞具有高纯度。开始此操作时，向含有搅拌子的锥形瓶中加入 50 毫升 IMDM 培养基。将培养基加热至 50 摄氏度，并在持续搅拌的同时加入 0.5 克 PVA，以配制浓度为 10 毫克/毫升的 PVA 储存液。此后，将 PVA 溶液从加热垫上取下，静置冷却至室温。待溶液冷却后，通过无菌的 0.2 微米滤膜进行过滤。根据文本方案中表一的说明，将过滤后的 PVA 与其他试剂混合，配制 CDM2 和 CDM3。使用无菌的0.2微米滤器过滤所有培养基。然后，按照文本方案中表一的说明配制剩余的基础培养基CDM4和CDM5。配制分化培养基时，首先将冻存的小分子和/或生长因子在室温下解冻。分装所需体积的基础培养基，并按指定浓度向其中加入相应的小分子化合物和生长因子。使用前一天，在4°C条件下解冻基质。次日，将500微升基质加入50毫升冷的DMEM中，按1:100的比例稀释基质。用移液器将稀释后的基质溶液加入所需数量的孔中，加入的体积以刚好覆盖孔表面为宜。将包被基质的培养板转移至37摄氏度的培养箱中孵育至少60分钟。在接种细胞前，立即吸除包被孔中残留的基质溶液。然后，吸出接近完全汇合的hPSC培养板中的培养基，加入市售的解离试剂，注意用量只需覆盖细胞生长的表面即可。将hPSC在37°C下用解离试剂孵育5分钟，或直至部分细胞集落开始脱落。接着，加入DMEM/F-12培养基以稀释解离试剂。使用5 mL血清移液管轻柔地反复吹打多次，以将所有细胞从孔表面冲洗下来。将重悬的单细胞收集至50 mL锥形管中，并根据需要使用DMEM和F-12培养基稀释。将收集的hPSCs在4°C下以350 × g离心3分钟，以沉淀细胞。在等待离心过程中，吸除将要接种hPSCs的培养板中的基质。向目的孔中加入足量的mTeSR培养基以覆盖孔底。离心完成后，小心吸除上清液，保留锥形管底部的hPSC沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于添加了1 µM商业化购得的Thiazovivin的mTeSR培养基中。使用P1000移液器轻轻吹打2至3次，使细胞沉淀均匀重悬，形成单细胞悬液。立即吸取10 µL细胞悬液至血细胞计数板中，计数细胞数量。用添加了Thiazovivin的mTeSR培养基调整重悬的hPSC体积，以达到铺板所需的细胞浓度。然后，以十字交叉方式轻轻摇动培养板数次，确保细胞均匀分布。hPSC铺板至少24小时后，使用相差显微镜检查细胞形态，重点关注铺板后hPSC集落的直径。接下来，按照文本方案中表二的说明配制第一天APS分化培养基。接种后一天，吸除添加了Thiazovivin的mTeSR培养基，并用IMDM培养基短暂洗涤已接种的hPSCs。随后，向hPSCs中加入第一天培养基。记录细胞放回37摄氏度培养箱的时间和位置。按照分化过程中的相应日期，在每天大致相同的时间，配制所需的分化培养基并添加至细胞中，继续后续的分化步骤。本研究中，由人多能干细胞（hPSCs）生成了富集的肝芽祖细胞群体，并进一步分化为肝细胞样细胞。分化第二天，原条细胞已分化为定型内胚层细胞。这些细胞绝大多数表达 SOX17 和 FOXA2。分化第三天，内胚层细胞进一步分化为前肠前体细胞，呈多边形形态。随后，在第6天，前肠前体细胞已分化为肝芽前体细胞。这些肝芽前体细胞表达AFP、TPX3和HNF4alpha。在三种hPSC细胞系中，该方法可在第6天以约89%的效率生成AFP阳性的肝前体细胞。最后，在hPSCs向肝细胞分化18天后，出现白蛋白阳性的类肝细胞。形态学上，这些细胞呈上皮样，形成类似胆小管的明亮边界。在此阶段，第18天人多能干细胞来源的肝细胞的细胞质颜色较细胞核更深。在接种人多能干细胞以进行分化时，必须以适当的密度接种，并通过轻轻摇动培养板使细胞均匀分布于孔内。在体外生成人肝细胞的能力是一项关键技术，将使科学家能够研究肝脏发育的相关机制。该方法可在体外大量生成人肝细胞，可用于研究肝脏功能与疾病，并最终为肝功能衰竭提供新的治疗手段。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人类多能干细胞有效分化为肝细胞

本文将重点介绍如何从人类胚胎干细胞群体中生成人类肝内胚层细胞。...

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

本文介绍了一种可扩展且符合优良生产规范（GMP）的人多能干细胞向肝细胞样细胞分化的体系。该体系为开展基础和应用型人类肝脏研究提供了成本效益高且标准化的人肝细胞样细胞制备方法。...

由人多能干细胞定义明确且可扩展地生成肝细胞样细胞

本文所述方案介绍了一个用于发现治疗肝病小分子的平台。逐步详细描述了如何在96孔板中将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有肝细胞特征的细胞，并利用这些细胞筛选具有潜在治疗活性的小分子。...

利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞来源的肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型的实验方案。该模型是测试高胆固醇血症新疗法的重要工具。...

利用诱导多能干细胞衍生肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型

本方案描述了一种在96孔板体系中由人多能干细胞生成肝细胞样细胞的半自动化方法。该过程快速且成本效益高，可用于生产质量可控的肝细胞样细胞批次，服务于基础和应用型人类研究。...

多能干细胞向类肝细胞的半自动化生产

本方案描述了一种利用定义明确的培养系统和细胞自组装方法，从人多能干细胞生成肝细胞球的策略。该方案在多种细胞系中具有可重复性，成本效益高，并可实现用于生物医学应用的稳定人肝细胞球的制备。...

从多能干细胞无血清生成三维人肝细胞球

本文旨在提供一种标准化的方法，以诱导人多能干细胞分化为肝祖细胞。该实验流程结合即用型培养基配方，为用户提供了便捷的系统，可用于生成人肝细胞，服务于生物医学研究及转化应用。...

利用定义明确的分化系统从多能干细胞诱导肝祖细胞分化

本文描述了一种将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细方案，该方法在hESCs向定型内胚层（DE）分化过程中持续添加Activin...

一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

本文介绍一种非遗传学方法，利用从稳态外周血中分离的单个核细胞生成人自体肝类球体。...

用于肝脏疾病研究的外周血来源人肝类球体

通过细胞分选可纯化由多能干细胞衍生的肝细胞，该方法结合使用线粒体染色和活化白细胞细胞黏附分子（ALCAM，也称为CD166）染色。...

活体线粒体染色在细胞分选中的应用以纯化人诱导性多能干细胞来源的肝细胞

现有的多能干细胞（PSC）向功能性细胞分化的体系目前受到严重的细胞系间和批次间变异性的阻碍。本文以心肌细胞分化为主要示例，介绍了一种基于图像的机器学习方法，用于智能监测和调控PSC分化过程的实验方案。...

一种基于活细胞成像的机器学习策略用于监测多能干细胞分化

了解人类多能干细胞分化为肝细胞的高效方法，通过无血清培养条件在18天内获得高纯度肝样细胞。该技术可推进再生医学和肝脏疾病研究的发展。

高效分化人多能干细胞为肝细胞

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