Name: atp 利用商业检测和染色法定量检测淋病奈瑟菌骨料的抗生素敏感性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 了解利用ATP检测和活死染色法评估淋病奈瑟菌聚集体抗生素敏感性的实验方法。该技术可定量测定头孢曲松处理后细菌存活率，为临床相关条件下的抗菌药物敏感性测试提供可靠工具。

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本工作获得了美国国立卫生研究院向 D.C.S. 和 W.S. 提供的资助（项目编号：AI123340）。L.-C.W.、J.W.、A.C. 和 E.N. 部分受资助/参与了 &#34;第一年创新 &amp;#38; 研究经历&#34; 由马里兰大学资助的项目。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥作用。我们感谢马里兰大学细胞生物学与分子遗传学系成像中心（UMD CBMG Imaging Core）完成所有显微镜实验。

1. GC 菌株的一般保藏
<ol>
	<li>从冻存菌种中将N. gonorrhoeae菌株划线接种至含1% Kellogg补充剂的GCK琼脂培养基（表1，表2）18，于37 °C、5% CO2条件下培养16–18小时。可选用表达相可变Opa蛋白的MS11菌株（MS11Opa+）、不表达Opa蛋白的菌株（MS11ΔOpa），或表达截短型脂寡糖（LOS）的菌株（MS11ΔLgtE）。</li>
	<li>在解剖显微镜下根据菌落形态19，仔细挑取菌落边缘无深色（菌毛阴性）或有深色边缘（菌毛阳性）的单个菌落，分别划线接种至新的GCK平板。</li>
	<li>使用前于37 °C、5% CO2条件下培养16–18小时。</li>
</ol>
2. GC 聚集体的活力定量
<ol>
	<li>使用无菌拭子收集GC。从平板上刮取GC，并将其重悬于预热的培养基（GCP）中， 表3) 加入 4.2% NaHCO₃3 和1%凯洛格溶液18. 在650 nm波长下使用分光光度法（OD650 约1 × 10⁹ CFU/mL）以确定悬浮细菌的浓度。</li>
	<li>调节GC浓度至约1 × 108 CFU/mL</li>
	<li>向96孔板的各孔中加入99 µL调节后的GC悬液。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育平板6小时2 以促进细菌聚集。</li>
	<li>向每个孔中加入1 µL系列稀释的头孢曲松（1000、100、50、25、12.5、6.2、3.1、1.5、0.8、0.4、0.2 µg/mL）。留出部分孔不加药物作为对照。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板24小时2.</li>
	<li>在每个孔中以144 W和20 kHz超声处理3次，每次5秒。</li>
	<li>向每个孔中加入100 µL市售ATP利用发光试剂，用移液器吹打3次，于37 °C、5% CO₂条件下孵育15分钟2.</li>
	<li>从每个孔中小心转移150 µL混合液至96孔黑色微孔板的新孔中，避免产生气泡。</li>
	<li>使用酶标仪在560 nm处测定每个孔的吸光度。</li>
	<li>通过连续头孢曲松处理后的读数与未处理孔的读数之比，计算存活率。</li>
</ol>
3. GC 聚集体活/死荧光显微镜分析
<ol>
	<li>使用无菌拭子采集淋球菌（GC）。从平板上刮取淋球菌，并将其重悬于预热的含1% Kellogg补充剂的GCP培养基中。</li>
	<li>在650 nm波长下通过分光光度法测定细菌数量，并将淋球菌浓度调整至约1 × 107 CFU/mL。</li>
	<li>将198 µL淋球菌悬液加入8孔盖玻片底共聚焦培养皿中。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下孵育6小时，以诱导菌落聚集形成。</li>
	<li>在每种聚集条件下，向每个孔中加入2 µL头孢曲松（100 µg/mL或不同稀释度），并在37 °C、5% CO2条件下孵育所需时间。</li>
	<li>向每个孔中加入0.6 µL活/死染色溶液混合物，在37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜获取Z轴层扫图像（可使用性能相当的显微镜）。</li>
	<li>使用ImageJ软件分析图像，测量淋球菌聚集物的大小以及每个聚集物中活/死染色的荧光强度比（FIR）。</li>
</ol>
4. 图像分析
<ol>
	<li>细菌聚集体大小的估算。
	<ol>
		<li>打开 ImageJ，通过将原始图像文件拖拽到 ImageJ 菜单栏来打开图像。</li>
		<li>在 ImageJ 菜单栏中点击 Freehand Lines，并用自由手绘线条圈出图像中每个聚集体的区域。</li>
		<li>在 ImageJ 菜单栏中点击 Analyze | Measure。</li>
		<li>在新窗口的 Area 列下获取数值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚集体活菌与死菌比例的定量分析
	<ol>
		<li>打开 ImageJ，通过将原始图像文件拖拽到 ImageJ 菜单栏来打开图像。</li>
		<li>在 ImageJ 菜单栏中点击 Analyze | Set Measurements。</li>
		<li>在弹出窗口中勾选“Integrated Density”，然后点击 OK。</li>
		<li>在菜单栏中点击 Image | Color | Channels Tool，并选择 Color 模式。</li>
		<li>将 Channel 1 设为标记活菌的荧光通道。</li>
		<li>在 ImageJ 菜单栏中点击 Freehand Lines，并用自由手绘线条圈出每个聚集体的区域。</li>
		<li>在 ImageJ 菜单栏中点击 Analyze | Measure。</li>
		<li>在 IntDen 列下获取数值。</li>
		<li>将 Channel 2 设为标记死菌的荧光通道，重复步骤 4.2.6–4.2.8。</li>
		<li>将步骤 4.2.8 得到的数值除以步骤 4.2.9 得到的数值，计算出活菌与死菌的比例。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计分析
	<ol>
		<li>打开 GraphPad Prism，将从 ImageJ 获得的数值输入到目标列中。</li>
		<li>点击 Analyze，在 Column analyses 下选择 t tests。</li>
		<li>选择需要比较的目标列，然后点击 OK。</li>
		<li>在 Analysis 窗口中获取 P 值。</li>
		<li>在步骤 4.3.3 中，从 XY analyses 下选择 Linear Regression。</li>
		<li>在 Analysis 窗口中获取 R-square 值和 P-Value。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm">http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm</a> (2017).</li>
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<li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+gonorrhea%3A+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li>
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<li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li>
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<li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).</li>
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<li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li>
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<li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li>
<li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-related+infections%3A+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细菌在感染人体过程中可形成生物膜。传统的最小抑菌浓度（MIC）检测可能无法反映根除生物膜中细菌所需的药物浓度。为了检测抗菌剂对生物膜的作用，基于生物膜生物量或菌落形成单位（CFU）涂布计数的方法可能因生物膜结构的影响而产生误差。例如，涂布法仅在生物膜能够被有效破坏时才适用，因此所获得的CFU可能低于实际存活细菌的数量。目前已建立通过可视化生物膜内死菌与活菌的方法来评估细菌在生物膜中的存活情况，然而，该方法受生物膜结构和密度的影响，染色剂可能无法充分渗透进入生物膜内部，导致存活率的检测结果不准确且被低估。
本方法结合定量检测与可视化分析，用于测定细菌聚集体经处理后的存活情况。该方法的优势在于，能够在更接近真实感染环境的条件下测量细菌存活率。通过比较非聚集态与聚集态细菌的存活率差异，可判断体外最小抑菌浓度（MIC）是否与体内最小抑菌浓度相关。
ATP利用测定法通过检测ATP的生成量，可定量测量聚集体的存活情况。与其他类似测定方法相比，该方法更为灵敏，能够区分抗生素浓度微小差异下的存活率变化。然而，由于该测定法灵敏度较高，确保细菌细...

淋病是一种常见的性传播感染（STI）1。Neisseria gonorrhoeae（GC）是一种革兰氏阴性双球菌细菌，是该疾病的致病因子。生殖器感染的症状可能包括排尿时疼痛、生殖器普遍疼痛以及尿道分泌物。感染常无症状2,3,4,5，这使得病原体能够长期定植。未经治疗的感染是一个重大的健康问题，因其可能促进病原体传播，并导致盆腔炎性疾病（PID）和播散性淋球菌感染（DGI）等并发症6。耐抗生素的淋病已成为重大的公共卫生危机，并带来日益加重的社会经济负担7。淋球菌对头孢菌素类药物的敏感性降低，已导致治疗方案从单一抗生素改为联合疗法，即阿奇霉素或多西环素与头孢曲松联用8。头孢曲松和阿奇霉素联合治疗失败的病例日益增多9,10，加之无症状感染的存在，凸显了深入理解淋病治疗失败机制的迫切需求。
最低抑菌浓度（MIC）试验，包括琼脂稀释法和纸片扩散法，已被用作鉴定细菌对抗生素耐药性的标准医学检测方法。然而，目前尚不清楚MIC试验是否能够反映细菌在体内的抗生素耐药性。细菌生物膜的形成有助于细菌在杀菌浓度的抗生素环境中存活：而MIC试验无法检测到这一效应11。由于淋病奈瑟菌（GC）可在黏膜表面形成生物膜12，我们推测在菌体聚集体内部的抗生素敏感性可能与单个GC菌体不同。此外，已有研究表明，三种相变异的表面分子——菌毛、孔蛋白（opacity-associated protein, Opa）和脂寡糖（lipooligosaccharides, LOS）——可调节细菌间的相互作用，并导致形成不同大小的菌体聚集体13,14,15。由于缺乏适当的研究方法，这些组分在抗生素耐药性中的作用尚未得到系统研究。
目前，已有多种方法可用于检测生物膜的清除效果。其中应用最广泛的定量方法是通过结晶紫染色来测定生物量的变化16。然而，该方法需要进行大量的实验操作，可能在重复实验中引入误差17。本文所采用的活/死染色法能够直观显示活菌与死菌及其在生物膜内的分布情况。但生物膜的结构可能形成物理屏障，限制染料的渗透。因此，为了对群体内的活/死细菌进行定量分析，该染色方法通常仅适用于较小的生物膜或其前体——微菌落或细菌聚集体。其他方法，如琼脂稀释法和纸片扩散法，均无法有效评估细菌聚集状态的影响。为了在抗生素处理后检测聚集状态下淋球菌（GC）的药物敏感性，理想的方法应同时具备定量检测活菌数量以及可视化其空间分布的能力。
本方案结合ATP利用量测定与活/死细胞染色实验，通过定量和可视化方法，在抗生素存在条件下检测聚集物内GC的易感性。

<table><tbody><tr><td>100x Kellogg's 补充剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>United States Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>BacTiter Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>头孢曲松</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC 培养基基础&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铁九水合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺结晶粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight 活/死染色试剂</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 淋病奈瑟菌菌株</td><td></td><td></td><td>由 Walter Reed 陆军研究所 Herman Schneider 博士惠赠</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾 (K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>可溶性淀粉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>硫胺素焦磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>8孔盖玻片底共聚焦培养皿&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>96孔组织培养板&amp;nbsp;</td><td>Corning, Falcon</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜（NU-425-600 II 级 A2 型层流生物危害罩）</td><td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;Model 3530</td><td></td></tr><tr><td>配备活细胞成像室的共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp; 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Glomax 发光检测仪&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 (0.1–10 &amp;micro;L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 (1000 &amp;micro;L)</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 (200 &amp;micro;L)</td><td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 2000 UV 分光光度计</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>无菌 15 ml 锥形管</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>无菌微量离心管 (1.7 mL)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>无菌聚酯头采样拭子</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Kontes</td><td>Equivelent to 9110001</td><td></td></tr></tbody></table>

抗生素敏感性的定量检测 淋病奈瑟菌 使用atp利用型商用检测试剂盒和活/死细胞染色检测聚集体

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

耐药性Neisseria gonorrhoeae（淋球菌，GC）的出现已成为全球性的健康威胁，凸显了识别治疗失败个体的迫切需求。这种革兰氏阴性细菌仅在人类中引起淋病。在感染过程中，该菌能够形成聚集体和/或生物膜。最低抑菌浓度（MIC）试验常用于测定细菌对抗生素的敏感性，并据此确定适当的治疗方案。然而，体内清除机制及其与实验室结果之间的关系尚不清楚。本研究建立了一种方法，用于考察GC聚集体如何影响其对抗生素的敏感性，并揭示聚集体大小与抗生素敏感性之间的关系。当GC形成聚集体时，其对抗生素杀灭作用的抵抗力增强，聚集体中心的细菌比边缘区域的细菌更能耐受头孢曲松治疗。研究数据表明，N. gonorrhoeae的聚集行为可降低其对头孢曲松的敏感性，而传统的基于琼脂平板的MIC方法无法反映这一现象。本研究所采用的方法将使研究人员能够在更接近临床实际的条件下检测细菌的药物敏感性。

采用了两种方法：ATP利用测定法和活/死染色测定法。这些结果可合并使用，也可单独用于检测抗生素处理后聚集物内细菌的存活情况。已有研究表明，ATP利用测定法可准确测量S. aureus生物膜中的活菌数量20,21。本研究使用MS11Opa+Pil+菌株来考察淋病奈瑟菌（GC）聚集在抗生素敏感性中的作用。将非聚集的MS11Opa+Pil+、聚集的MS11Opa+Pil+，以及经超声处理破坏聚集后的MS11Opa+Pil+菌株分别用不同浓度梯度的头孢曲松处理，并测定ATP水平（图1A）。在比较有无抗生素处理下的存活率时，与非聚集或经超声破坏聚集的GC相比，预先聚集的GC在头孢曲松浓度等于或高于0.015 µg/mL时（MIC来自琼脂稀释法测定（表4））表现出显著更高的存活率。此外，还检测了MS11Opa+Pil-、MS...

采用简单的ATP检测法和活/死染色法，对经头孢曲松处理后的Neisseria gonorrhoeae存活情况进行定量和可视化分析。该方案可扩展用于研究任何抗生素的抗菌效果，并可用于确定抗生素在细菌生物膜中的最低抑菌浓度。

抗生素敏感性的定量检测 淋病奈瑟菌 使用ATP利用型商用检测试剂盒和活/死细胞染色检测聚集体

耐药性淋病奈瑟菌（GC）的出现已成为全球性的健康威胁，凸显了识别治疗失败个体的必要性……

该技术使我们能够在更接近临床实际情况的条件下测定抗生素敏感性。该技术还可用于确定能够杀灭细菌聚集体中细菌的真实抗生素浓度。该技术可应用于确定清除GC聚集体所需的抗生素浓度。该方法也可用于测定任何能够形成聚集体的细菌的抗菌敏感性。请特别注意裂解步骤，以确保裂解完全；否则，ATP检测法将低估活菌数量。对该方法的可视化展示将有助于其他研究人员一致地跟进和重复本实验。首先，在GCK琼脂平板上划线接种淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）或GC菌株，琼脂中添加1% Kellogg，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养16至18小时。次日清晨，使用光学显微镜仔细挑选每个平板上的无深色边缘的菌毛阴性菌落或有深色边缘的菌毛阳性菌落，并将挑取的菌落划线接种至新的GCK平板，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续培养16至18小时。第二天早晨，使用无菌接种棒从每块平板上收集淋球菌（GC）菌落，并将每根拭子重悬于添加了4.2%碳酸氢钠和1%Kellogg溶液的温热肉汤中。在650纳米波长下测定光密度（OD650），以确定细菌悬液的浓度，并将淋球菌浓度调整至约1×10⁸菌落形成单位/毫升。随后，将99 µL淋球菌悬液加入96孔板的各个孔中，在37°C、5%CO₂条件下孵育6小时，使细菌聚集。孵育结束时，向每个孔中加入一微升系列稀释的头孢曲松，留出部分孔不加药物作为对照，然后将培养板放回孵育箱继续孵育24小时。次日，将每孔中的悬液在144瓦、20千赫兹条件下超声处理三次，每次五秒，并向每孔加入100微升市售的ATP利用发光试剂。小心地将每孔中的150微升混合液转移至新的96孔黑色微孔板的各个孔中，使用酶标仪在560纳米波长下测定每孔的吸光度。然后，通过系列抗生素处理后的读数与未处理孔的读数之比，计算存活率。为观察活/死淋球菌（GC）聚集体，使用无菌拭子从过夜培养的平板上收集淋球菌，并将其重悬于添加了1%Kellogg的预热GCP培养基中。通过分光光度法测定OD650，并将浓度调整至约1×10⁷菌落形成单位/毫升。接下来，将198微升GC悬液加入八孔盖玻片底培养 chamber 中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育6小时。孵育结束后，每种聚集条件下加入2微升头孢曲松处理细菌，并将chamber放回孵育箱中继续进行相应实验所需的孵育时间。孵育结束后，向每个孔中加入0.6微升活/死染色溶液，并将chamber放回孵育箱中额外孵育20分钟。然后，使用共聚焦显微镜获取 z 系列图像。为测量 GC 聚集体的大小，在 ImageJ 中打开第一幅图像，并使用自由手绘线条圈出图像中每个聚集体的区域。点击分析并测量。聚集体的大小将在“面积”列下显示。为了定量分析每个聚集体中活细胞与死细胞染色的荧光强度比值，请点击“分析”并选择“设置测量值”，在弹出窗口中勾选“积分密度”。点击“确定”，然后点击“图像”、“颜色”和“通道工具”。选择颜色和通道一作为死菌荧光染色。使用自由手绘线条圈选每个聚集体的区域，点击分析并测量，以在“总密度”列中获得每个聚集体的荧光强度比值。选择通道二作为活菌荧光染色的通道，并如前所述测量每个聚集体中的荧光强度。然后将活菌荧光强度数据除以死菌荧光强度数据，以获得活菌与死菌的荧光强度比值。在此代表性实验中，对非聚集型菌毛阳性、聚集型菌毛阳性或聚集后被破坏的菌毛阳性细菌，用头孢曲松进行系列稀释处理，随后测定其ATP水平。结果显示，在接受相同浓度或更高浓度头孢曲松处理时，预聚集的淋球菌（GC）存活率显著高于非聚集型或聚集结构被破坏的GC。与突变菌株相比，表达菌毛且形成较大聚集体的菌株在头孢曲松处理后表现出最高的ATP水平。无论测试何种菌株，在抗生素处理前的活/死染色显示，死亡细菌主要位于培养物的外层，而活的淋球菌（GC）主要存在于经头孢曲松处理的聚集体核心区域。正如预期，表达菌毛的细菌形成了最大的聚集体，而无菌毛的培养物形成的聚集体最小。值得注意的是，在抗生素处理后，菌毛阳性聚集体的核心层仍然存活，而小型疏松突变聚集体中的淋球菌（GC）则已死亡。根据GC的大小和存活情况，可以绘制相关性图，以分析细菌聚集体大小与抗生素存活率之间的关系。超声处理对于确保从紧密聚集的每个单个细菌中释放ATP至关重要。否则，测量结果将不一致。在细菌发生聚集并经抗生素处理后，必须对细菌进行平板接种，以测定存活且具有复制能力的细菌数量。该技术可测量细菌聚集对抗生素敏感性的影响，从而帮助研究人员开发出更有效的疾病治疗药物。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

atp 利用商业检测和染色法定量检测淋病奈瑟菌骨料的抗生素敏感性

来源：Cayron, J., and Lesterlin, C. 应激处理条件下细菌生长的多尺度分析。 J. Vis. Exp. (2019)本视频演示了在使用抑制细胞分裂的抗生素处理条件下，通过平板计数法测定活力以及流式细胞术分析细胞大小和DNA含量，来评估大肠杆菌（E.

评估抗生素诱导的丝状化现象 大肠杆菌 使用平板测定法和流式细胞术

来源： Maurakis, S.，和 Cornelissen, C. N. 金属限制条件下的生长 Neisseria gonorrhoeae 用于表征金属响应基因及从宿主配体获取金属的研究。 视频实验杂志 (2020)本视频演示了检测细胞表面金属转运蛋白的实验步骤 淋病奈瑟菌...

表面金属转运蛋白的检测 淋病奈瑟菌 使用点印迹法

本视频演示了一种 体外 研究抗菌治疗影响的技术 铜绿假单胞菌 （Pa）聚集体。用荧光标记的Pa细胞培养成聚集体，以模拟其在感染过程中的生长模式。当用亚致死浓度的抗生素多粘菌素挑战这些聚集体时，可实时评估细菌与抗生素之间的相互作用。 通过...

一种用于研究抗菌治疗对细菌聚集体作用的体外技术

本视频介绍了一种使用荧光素酶发光试剂的简单ATP检测方法。该检测方法用于定量测定经头孢曲松处理后Neisseria...

一种用于测定抗生素处理下细菌存活率的ATP利用检测法

细菌致病性研究的核心在于确定微生物在接触真核细胞后是否能够存活以及其存活机制。本文概述了使用荧光染料检测单个细菌在宿主细胞内及与宿主细胞相关时活力状态的实验方案。...

用于测定与哺乳动物细胞相关的细菌活力的荧光显微镜方法

本文介绍了快速筛选和表征具有抗菌活性酶的实验方案。微载玻片扩散法和染料释放法利用目标细菌作为底物，分别对酶活性进行定性和定量评估。...

定性与定量检测及表征蛋白质类抗菌物质的实验方法

该方案介绍了 大肠杆菌基于选择性压力将非天然氨基酸（ncAAs）引入乳酸乳球菌抗菌肽乳酸链球菌肽（nisin）中。其特性可在重组表达过程中被改变 通过...

通过非经典氨基酸的选择性压力整合产生的抗菌肽

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）可与共聚焦激光扫描显微镜及荧光激活细胞分选技术联用，以高分辨率观察细菌聚集体。本文详细描述了在抗菌治疗过程中评估聚集体群体的方法，为未来研究提供了一个技术平台。...

用于实时评估的工具 铜绿假单胞菌 感染模型

黏附侵袭性大肠杆菌（Escherichia...

阿米卡星保护法用于定量与可视化 大肠杆菌 细胞侵袭

了解利用ATP检测和活死染色法评估淋病奈瑟菌聚集体抗生素敏感性的实验方法。该技术可定量测定头孢曲松处理后细菌存活率，为临床相关条件下的抗菌药物敏感性测试提供可靠工具。

抗生素敏感性的定量检测淋病奈瑟菌使用ATP利用型商用检测试剂盒和活/死细胞染色检测聚集体

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