基于细菌筛选与培养的Dictyostelium discoideum细胞基因工程改造

本方案的价值在于，它几乎允许对任意黏菌株（dictyostelium discoideum）进行分子遗传学操作，无论该菌株是否能在液体培养基中无菌培养。该技术的另一优势在于快速且简便。在开始混合黏菌之前，先转染细胞以导入游离型质粒。

转染后两天即可通过显微镜观察验证结果。使用盘基网柄菌细胞与细菌悬液进行实验较为特殊，可视化过程将有助于实验人员了解各实验步骤的具体操作方式。

与我共同演示该实验步骤的是我实验室的博士后 Soudabeh Imanikia。首先，根据文本方案，配制含有氯化镁和氯化钙的 1000 毫升索伦森缓冲液工作液。随后，用一单菌落的产气克雷伯菌（K aerogenes）接种一升 LB 培养基。

将细菌在37摄氏度下振荡培养过夜。将菌液分装至两个500毫升离心管中，离心收集菌体。随后用500毫升缓冲液洗涤细菌一次。

将沉淀重悬于20毫升缓冲液中。使用光度计检测样品的光密度，并用缓冲液稀释样品，直至光密度约为100。随后，根据文本方案配制H40电穿孔缓冲液。

在室温下于SM培养基中过夜培养产气克雷伯菌至汇合状态。取400微升细菌悬液加入SM琼脂平板，均匀涂布。然后用无菌接种环挑取黏菌细胞，并在平板的一侧边缘接种并涂布细胞。

将培养板在 22 摄氏度下孵育两天，以确保生长区域足够大，便于转染。向一个 10 厘米经组织培养处理的培养皿中加入 10 毫升 K. aerogenes 菌悬液。然后，使用 10 微升一次性接种环从培养板的生长区域刮取细胞。

将细胞转移至含有预冷H40缓冲液的1.5毫升离心管中，在10000 ×g条件下离心2秒。随后弃去上清液，并将细胞重悬于H40缓冲液中。

接下来，将100微升细胞加入含有1至2微克DNA的离心管中。用移液器吹打混匀，然后将细胞与DNA的混合物转移至预冷的电穿孔比色皿中。DNA用量不得超过2微克。

较高的DNA浓度对细胞具有毒性，会降低转染效率。电穿孔后，立即将细胞转移至预先准备好的10厘米培养皿中，让细胞恢复5小时。为了筛选敲除、敲入或act five敲入的转染细胞，通过在培养皿表面吹打液体使细胞脱离。

然后，根据文本方案配制选择剂的三种稀释液。最后，将150 µL已配制好的稀释液分别加入96孔平底组织培养板的每个孔中。本方案中展示了一种双报告基因染色体外质粒系统。

转染后32小时，大多数细胞均表达两种荧光标记的融合蛋白。同时尝试了act five M cherry基因敲入和NC4实验。将消化产物在琼脂糖凝胶电泳后，获得了两条条带。

4127 bp 的条带包含目的构建体。纯化的 DNA 用于转染 NC4 细胞。通过 PCR 分析了两株 NC4 转染克隆，两者均显示出预期的条带模式。

随后使用Southern印迹法验证PCR结果。NC4在细菌菌苔上的生长速度比Ax2细胞更快。四小时后，能够爬行穿过琼脂糖的NC4细胞数量多于Ax2细胞。

NC4 细胞比 Ax2 细胞移动更快，且对叶酸的趋化反应更强。务必使用新近接种的 SM 平板上的细胞。切勿使用超过四天的细胞，否则效率会下降。

新分离的、非扩展性的白色 HAP 菌株常用于研究盘基网柄菌的聚集或社会行为。我们的方法允许通过这些分离株应用分子遗传学技术。