高通量、全面性药物监测的多段注入-毛细管电泳-质谱联用技术

目前，针对滥用药物的尿液药物筛查策略在进行常规分析时成本较高，尤其是在工作场所检测以及治疗药物监测应用中需要检测日益增多的药物种类。此外，基于氨基酸检测的方法容易产生偏差，最终仅限于对已知药物组合的目标分析。我们所采用的方法称为MSI-CE-MS，其主要优势在于能够快速、高准确度地筛查无限种类的药物及其代谢物，且样品前处理步骤极少。

迫切需要一种高通量且经济的筛查方法，以通过确认患者用药依从性、优化药物剂量方案并揭示非法药物使用情况，从而改善患者的治疗效果。这种多重分离平台还可应用于多种其他研究领域，涉及复杂生物样本中靶向或非靶向代谢物谱的分析。首先，将来自已知处方药使用史患者的匿名晨尿样本从–80°C储存条件下取出，在冰上解冻，并对解冻后的样本涡旋振荡30秒。

接下来，通过离心沉淀样品，并将每份样品的三份10 µL等分试样与10 µL氘代内标、5 µL 4-氟-L-苯丙氨酸和3-氯-L-酪氨酸溶液以及25 µL去离子水混合。然后将混合物离心1分钟，并将每份样品中的20 µL转移至各自的聚丙烯小瓶中。为设定未涂层熔融石英毛细管的预处理参数，从线圈上截取一段长度为135 cm、内径为50 µm、外径为360 µm的毛细管。

使用毛细管窗口制作器从每根毛细管两端去除约 7 毫米的聚酰胺涂层。接下来，将毛细管两端以两圈 360 度盘绕的方式插入毛细管电泳（CE） cartridge 的进样口，并确保毛细管出口端从 CE 喷雾针中伸出约 2 毫米。当所有毛细管安装完毕后，小心地将 CE cartridge 装入 CE 系统，并将 CE 喷雾头移出离子源存放。

将液相色谱（LC）喷雾器放入离子源中，并在系统软件中选择“冲洗”以进行毛细管预处理。设置甲醇、1 摩尔氢氧化钠、去离子水和背景电解质的冲洗时间，每次冲洗持续 30 分钟，在毛细管预处理期间将等度泵置于待机状态。最后一次冲洗结束后，用浸有甲醇的擦拭纸清洁毛细管电泳质谱仪（CE-MS）喷雾器和 CE 电极。

使用等体积的异丙醇水溶液清洗 CE-MS 接口，以去除任何残留的盐沉积物。将液相色谱喷雾器更换为已清洗的 CE-MS 喷雾器，并将一根新活化的毛细管插入同轴鞘液接口中。然后启动等度泵，施加 30 千伏电压持续 15 分钟，以确保在进行尿液分析前获得稳定的 CE 电流曲线。

在系统软件中，选择预处理，将冲洗时间设置为 600 秒，并指定背景电解质文件的位置。设置进样程序：以 100 毫巴压力流体动力进样 5 秒，然后以 30 千伏电压电动进样背景电解质间隔区 75 秒。设置施加电压为 30 千伏，卡盒温度为 25 摄氏度，总运行时间为 40 分钟。

然后，根据时间表，在分离过程中从 0 到 40 分钟以每分钟 2 毫巴的压力梯度加压。样品采集完成后，将毛细管置于离子源的 CE 喷雾器中，用背景电解质在 50 毫巴压力下冲洗过夜。将 TOF-MS 正离子检测设置为质荷比范围 50 至 1,700，数据采集速率为每谱 500 毫秒，并确认轮廓数据和质心数据均以 D 文件格式存储。

将电喷雾电离条件设置为毛细管电压和喷嘴电压均为 2000 伏，雾化气为 10 磅/平方英寸，干燥气流速为 8 升/分钟、温度为 300 摄氏度，鞘气流速为 3.5 升/分钟、温度为 195 摄氏度。然后将质谱的碎裂器、鞘流管和八极杆射频电压分别设置为 120、65 和 750 伏，并根据实验设计设定仪器控制和数据采集参数。进行数据分析时，在系统软件中打开多段 CE-MS 数据。

在色谱图下方，将提取数据以及色谱图和质谱数据格式设置为轮廓模式。在平滑选项中，选择二次或三次Savitzky-Golay法，并将函数宽度设置为15个点。然后点击积分MS，并将积分器设置为agile。

在峰过滤器设置中，将最大峰数设为11。在视图中，单击积分峰列表，并选择峰编号、保留时间、峰面积、峰高和信噪比。然后将参数保存为唯一的命名方法，并将该方法应用于数据处理流程，以解析每组数据。

在此项对多种同分异构滥用药物及其代谢物的代表性分析中，从10份独立的药物混合物样品中共检测到30个分离良好的色谱峰，且无样品残留。另外两种同量异位阿片类药物通过全扫描数据采集方式也实现了完全分离，共得到20个不同的峰。类似地，在此次多段毛细管电泳-质谱（CE-MS）分析中，两种苯丙胺位置异构体也被完全区分开来，从而能够区分非法滥用甲基苯丙胺与可能滥用处方兴奋剂芬特明（一种用于减肥的食欲抑制剂）的情况。

在此代表性药物筛选分析中，通过检测到一个与甲基二氢吗啡酮-d3 峰共迁移且质量误差较小的强信号峰，推断出美沙酮筛查结果为阳性。在同一次运行中的其他尿液样本中未检测到任何其他信号，且检测到的美沙酮浓度相较于其在样本中的离子响应比，并经四倍尿液稀释因子校正后，超过推荐截断限13倍，证实了患者依从美沙酮维持治疗。在此，采用多段毛细管电泳-质谱（multi-segment CE-MS）中的连续进样配置，将五种不同药物校准品与合成尿液空白样在同一运行中重复分析两次。

通过检测高于其筛查阈值的药物代谢物增强型分子离子，可实现对药物代谢物的鉴定。采用该方法，还可利用质谱成像毛细管电泳技术分析尿液中大量极性及离子型代谢物，从而支持基于发现的代谢组学研究。此外，可实现对多种外源性药物及其代谢物的全面监测，包括非处方药以及易于滥用的非法药物。

该优化方法还可用于常规筛查其他滥用药物，例如大麻或酒精代谢物。此外，我们的方法能够区分合成或伪造的尿液基质与真实、自然捐赠的尿液样本。在处理生物液体时，务必始终谨慎操作。