Name: 时空映射和粒子分析技术在细胞内 ca2 +原位信令定量中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 了解时空映射与粒子分析技术在小鼠小肠Cajal间质细胞钙信号定量中的应用。该方法通过共聚焦显微镜获取空间、时间和强度数据，为原位钙成像提供精确分析框架。

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资金由美国国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK）通过项目编号P01 DK41315提供。

作者无任何利益冲突需要披露。

对完整组织内或细胞网络中特定类型细胞的 Ca2+ 成像通常会揭示复杂的 Ca2+ 瞬变模式。此类活动需要进行细致而深入的分析与量化，以尽可能获取有关这些事件及其动力学特征的更多信息。STM 和 PTCL 分析方法能够最大限度地从此类记录中提取定量数据。
ICC-DMP 细胞呈细长的纺锤形形态，这种形态非常适合采用上述 STM 方法进行分析。然而，这种分析方法并不适用于呈星状且相互连接成网络结构的 ICC-MY 细胞（图 3A）。此外，ICC-MY 中的 Ca2+ 信号模式更为复杂，表现为从 ICC-MY 网络中多个起始位点传播的钙瞬变波（CTC）。因此，为了量化在某一视野（FOV）内整个 ICC-MY 网络中的活动情况，我们采用了一套自行开发的软件（Volumetry，版本 G8d，GWH，适用于 Mac OS 系统）进行颗粒（PTCL）分析（如需获取 Volumetry 的使用权限或相关咨询，请联系 Grant Hennig，邮箱：grant.hennig@med...

Ca2+ 是一种普遍存在的细胞内信使，可调控多种细胞过程，如肌肉收缩1,2、代谢3、细胞增殖3,4,5、神经末梢神经递质释放的刺激6,7，以及细胞核内转录因子的激活7。细胞内 Ca2+ 信号通常表现为胞质溶胶中 Ca2+ 浓度的瞬时升高，其可为自发产生，也可由不同细胞类型的激动剂刺激引发8。Ca2+ 信号固有的空间、时间和强度参数，如频率、持续时间、传播性、速度和振幅，可提供细胞内信号传导所需的生物学信息5,7,9。胞质 Ca2+ 信号可源于细胞外空间的 Ca2+ 内流，或通过内质网（ER）中的 Ca2+ 释放通道（如雷诺丁受体（RyRs）和三磷酸肌醇受体（IP3Rs））释放 Ca2+ 所致10。RyRs 和 IP3Rs 均可参与 Ca2+ 信号的生成，这些通道的协同开放，结合多种 Ca2+ 内流机制，可产生多种多样的 Ca2+ 信号模式，其形态受 Ca2+ 内流通道的数量和开放概率、Ca2+ 释放通道的表达谱、Ca2+ 内流与释放通道之间的空间邻近性，以及 Ca2+ 重摄取和外排蛋白的表达与分布所调控。Ca2+ 信号可表现为均匀、持久、高强度的全局性振荡，持续数秒甚至数分钟；也可表现为在细胞内和细胞间传播的 Ca2+ 波，其可跨越超过 100 µm 的细胞内距离10,11,12,13,14,15,16；或表现为更短暂、空间上局限的事件，如 Ca2+ 闪烁（sparks）和 Ca2+ 爆发（puffs），其发生时间尺度为数十毫秒，扩散范围小于 5 µm17,18,19,20。
荧光显微镜已广泛用于监测分离培养的细胞以及完整组织中的 Ca2+ 信号。传统上，这些实验使用荧光 Ca2+ 指示剂，包括比率型和非比率型染料，如 Fura2、Fluo3/4 或 Rhod2 等21,22,23。这些指示剂被设计为可穿透细胞膜，随后通过内源性酯酶裂解酯基而被细胞截留。当细胞和组织被适当波长的光照射时，Ca2+ 与高亲和力指示剂结合会引起荧光变化。细胞可渗透 Ca2+ 指示剂的使用极大地增进了我们对活细胞中 Ca2+ 信号传导的理解，并实现了对这些信号的空间分辨与定量分析，而这是通过其他方法（如电生理学）检测 Ca2+ 信号所无法实现的。然而，传统的 Ca2+ 指示剂存在若干局限性，例如在长时间记录过程中会发生光漂白24。尽管较新的 Ca2+ 指示剂染料（如 Cal520/590）显著提高了信噪比以及检测局部 Ca2+ 信号的能力25，但光漂白问题对部分研究者而言仍是一个关注点26,27,28。急剧的光漂白还限制了可用于记录的放大倍数、图像采集速率和分辨率，因为提高物镜功率和加快图像采集速率需要更强的激发光强度，从而加剧光漂白。
当在原位记录Ca2+信号时，传统Ca2+指示剂染料的这些局限性尤为突出，例如从完整组织中记录细胞内Ca2+信号时。由于上述问题，使用细胞通透性Ca2+指示剂在原位可视化Ca2+信号通常仅限于低倍放大和较低的图像采集速率，这限制了研究人员记录和量化时空上受限的亚细胞Ca2+信号的能力。因此，难以捕捉、分析并充分认识Ca2+信号在空间和时间上的复杂性，而这种复杂性在产生特定生物学反应过程中可能至关重要，如上所述。对原位细胞Ca2+信号的分析通常依赖于在视野（FOV）内选定的兴趣区域（ROI）进行简单的强度测量。ROI的数量、大小和位置的选择具有任意性，取决于研究者的主观判断，这可能严重偏倚所得结果。除了ROI分析本身固有的偏差外，该方法还忽略了视野中包含的大量重要信号信息，因为仅选择在任意划定的ROI内发生的动态Ca2+事件进行分析。此外，ROI分析无法提供有关所观察到的Ca2+信号空间特征的信息。例如，仅通过ROI内Ca2+信号的统计结果，可能无法区分由传播性Ca2+波引起的Ca2+升高与高度局限性的Ca2+释放事件。
基因编码的钙指示剂的出现2+ 指示剂（GECIs）彻底改变了Ca2+ 可以进行成像 原位29,30,31,32,33使用GECI相较于染料具有多个优势。其中最重要的或许是GECI可实现细胞特异性表达，从而减少非目标细胞带来的背景干扰。GECI相较于传统Ca2+ 与染料标记的样本相比，一个指标是光漂白现象减少（因为只有在细胞处于活跃状态时才会发生荧光，进而产生光漂白），尤其是在高倍率和高成像速率下更为明显。34因此，利用GECI（如光遗传学传感器GCaMP系列）进行成像，使研究人员能够记录短暂且局域化的亚细胞Ca2+ 信号 原位 并研究Ca2+ 在细胞的天然环境中实现此前无法完成的信号传导研究。为了从这些高分辨率记录中最大限度地获取信息，需对Ca进行适当的空间和时间分析2+ 信号是必需的。需要注意的是，尽管GECI可能具有一些明显优势，但最近的研究表明Ca2+ 利用常规Ca，可同时对大量不同神经化学类别神经元群体成功进行成像2+ 非遗传编码的指示剂35该方法采用事后免疫组织化学技术，揭示了多种不同类型的神经元以高频同步簇状放电，避免了动物基因改造可能对研究者希望了解的生理行为造成的干扰35,36.
本文所述方案有助于更全面地分析和定量检测Ca2+ 使用基于时空图（STM）分析与基于粒子的分析相结合的方法，记录来自原位细胞的信号。这些方案还描述了不同模式的Ca2+ 原位观察到的不同细胞群体中的信号传导可得到适当分析。为作说明，该方法将检测Ca2+ 小肠中一种特化细胞群体—— Cajal 间质细胞（ICC）的信号传导。ICC 是胃肠道（GI）中的一类特化细胞，具有动态的细胞内 Ca2+ 使用表达GCaMPs的小鼠可视化信号传导37,38,39,40,41,42. 钙2+ ICC中的瞬变与Ca激活相关2+-激活的 Cl- 通道（由编码） Ano1) 在调控肠道平滑肌细胞（SMCs）兴奋性方面具有重要作用43,44,45因此，对Ca的研究2+ ICC 中的信号传导对于理解肠道运动功能至关重要。小鼠小肠是进行此类演示的极佳范例，因为其中存在两类在解剖上相互分离且可独立观察的 ICC：i）ICC 位于环形肌与纵行平滑肌层之间，环绕肌间神经丛（ICC-MY）。这些细胞作为起搏细胞，产生称为慢波的电活动。46,47,48,49；ii) ICC 也位于富含运动神经元末梢的神经丛中（即深层肌间神经丛，因此称为 ICC-DMP）。这些细胞在肠源性运动神经传递反应中起中介作用37,39,40,50ICC-MY 和 ICC-DMP 在形态上存在差异，且其 Ca2+ 信号行为因各自特定功能而存在显著差异。ICC-MY 呈星状，通过缝隙连接形成相互连通的细胞网络51,52. Ca2+ ICC-MY中的信号表现为短暂且空间局限的Ca2+ 通过ICC-MY网络在多个位点异步发生的释放事件，如在视野内（使用60倍物镜成像）所观察到的38这些异步信号在时间上被组织成1秒的簇，当它们被汇总在一起时，相当于细胞内Ca²⁺净上升持续1秒。2+这些信号在ICC网络内进行细胞间的传播，从而调控Ca2+ 信号，由亚细胞位点产生，传递至组织范围的Ca2+ 波。Ca²⁺的时间聚类与整合2+ ICC-MY中的信号被称为Ca2+ 循环肿瘤细胞簇（CTCs）38CTC 在小鼠中以节律性方式出现（例如，每次 CTC 持续时间相近，且 CTC 之间的周期相似），每分钟约发生 30 次。相反，ICC-DMP 呈纺锤形细胞，部分具有二级突起，分布于 SMC 和曲张的神经突起之间，且不独立形成网络51,52ICC-DMP 与 SMC 形成缝隙连接，并在这一更大的合胞体（即 SIP 合胞体）中发挥功能53. Ca2+ 信号在细胞的多个位点沿其长度方向出现，但这些瞬时信号并未像在ICC-MY中观察到的那样发生同步化或在时间上成簇出现。37. Ca2+ ICC-DMP 中的信号以随机方式发生，具有可变的强度、持续时间和空间特征。以下方案以 Ca2+ 在ICC-MY和ICC-DMP中研究信号传导，描述原位分析特定细胞类型复杂信号传导的技术。我们采用了可诱导的Cre-Lox p&#160;系统在由ICC特异性启动子驱动的Cre重组酶（Cre）激活后，特异性地在ICC中表达GCaMP6f试剂盒).

<table><tbody><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td>1.5a</td><td>ImageJ 软件</td></tr><tr><td>体积测量</td><td>GWH</td><td>体积测量 8Gd</td><td>定制分析软件</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td><td>NDC 10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>GCaMP6F 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td><td></td></tr><tr><td>Kit-Cre 小鼠</td><td>由 Dieter Saur 博士惠赠</td><td>c-Kit&lt;sup&gt;+/Cre-ERT2&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>SDA 2B-6</td><td></td></tr></tbody></table>

时空映射与颗粒分析技术在原位定量细胞内 ca2+ 信号传导中的应用

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

对完整组织中分离的细胞或特定类型细胞进行 Ca2+ 成像，常可揭示复杂的 Ca2+ 信号模式。为了尽可能获取有关基础生物学事件的全部信息，此类活动需要进行细致而深入的分析与定量。Ca2+ 信号固有的空间、时间和强度参数，如频率、持续时间、传播、速度和振幅，可能提供细胞内信号传导所需的某些生物学信息。高分辨率 Ca2+ 成像通常会产生大量数据文件，将成像信息转化为可量化数据的过程耗时较长，且容易受到人为误差和偏倚的影响。对原位细胞 Ca2+ 信号的分析通常依赖于在视野（FOV）内任意选择的兴趣区域（ROI）进行简单的强度测量，这种方法忽略了 FOV 中包含的大量重要信号信息。因此，为了最大限度地从使用 Ca2+ 染料或光遗传学 Ca2+ 成像所获得的高分辨率记录中提取信息，必须对 Ca2+ 信号进行适当的空间和时间分析。本文所述方案将介绍如何通过基于时空图（STM）的分析与基于粒子的分析相结合的方法，从 Ca2+ 成像记录中获取大量数据，以促进对细胞记录的 Ca2+ 信号进行更全面的分析与定量。这些方案还描述了如何适当地分析不同细胞群体中原位观察到的不同模式的 Ca2+ 信号。为说明该方法，将以小肠中一种特化的细胞群体—— Cajal 间质细胞（ICC）为例，使用 GECI 探针研究其 Ca2+ 信号活动。

利用 Kit-Cre-GCaMP6F 小鼠（图 1），可在原位成像胃肠道中 ICC 的动态 Ca2+ 信号行为。通过共聚焦显微镜，可获得特定 ICC 群体的高分辨率图像，且不会受到同一组织中其他解剖学层面不同的 ICC 群体信号的干扰（图 2A）37,39,40,41。该方法能够记录持续时间短暂（&lt;100 ms）、局灶性的 Ca2+ 事件，而此类事件使用膜通透性 Ca2+ 指示剂无法实现。通过 Volumetry 或 ImageJ 软件进行时空映射，可在原位生成细胞内所有 Ca2+ 事件的时空图谱（STM）。...

基因编码的 Ca2+ 指示剂（GECIs）彻底改变了原位Ca2+ 进行成像。为了从此类记录中最大限度地回收数据，需对Ca2+ 信号是必需的。本文中的方案有助于Ca的定量分析2+ 使用时空映射和基于粒子的分析在原位记录的信号。

时空映射与颗粒分析技术在原位定量细胞内 Ca2+ 信号传导中的应用

对完整组织中分离的细胞或特定类型细胞进行的 Ca2+ 成像通常会揭示复杂的 Ca2+ 信号模式。这种活动需要……

从钙成像实验中获取大量数据的能力已显著提升，尤其是在组织成像实验中。我们的方案描述了用于定量和描述这些数据集的适当分析技术。我们的方案可生成一系列与整个组织中钙信号传导固有的空间、时间和强度值，而这些信息可能在更为基础的分析方法中丢失。在成像转移前一小时，将从小鼠中获取的表达基因编码钙指示剂的卡哈尔间质细胞（ICC）的小肠组织置于旋转盘共聚焦显微镜的载物台上，并持续用37°C的Krebs-Ringer碳酸氢盐（KRB）溶液灌流组织。使用60至100倍放大倍数，在小肠环形肌与纵行平滑肌层之间定位星状的肌间神经丛卡哈尔间质细胞（ICC-MY）。然后在环形平滑肌层与黏膜下神经丛之间的一个平面内找到纺锤形的深层肌丛间质细胞（ICC）或ICC-DMP，并将视频保存为TIFF图像堆栈。为生成ICC-DMP钙活动的时空图（STMs），在ImageJ中打开图像堆栈，点击Image（图像）、Type（类型），选择32-bit（32位）以调整图像质量。要创建线扫描，右键单击线条选择工具，然后选择分段线（segmented line）。使用单次左键点击沿单个 ICC-DMP 的中轴绘制一条线，当整个细胞被勾勒完毕后双击。选择 图像、堆栈 和 重新切片，将弹出一个窗口。选择旋转90度，使线扫描从左到右定向，以便在x轴上按时间、y轴上按空间进行校准和读取，然后单击“确定”。时空图将出现。为了准确测量该图中钙信号的幅度，请选择矩形选区工具，在STM内荧光最均匀且强度最低的区域周围绘制一个感兴趣区域。单击“分析”和“直方图”，获取所选感兴趣区域内的平均强度值，然后单击“编辑”、“选区”、“全选”，以选中整个STM。接下来，点击“Process”（处理）、“Math”（数学运算），然后选择“Divide”（除法），在弹出窗口中输入所选STM感兴趣区域的平均强度值。此时STM图像将变为黑色。通过在弹出窗口中依次点击“Image”（图像）、“Adjust”（调整）、“Brightness/Contrast”（亮度/对比度），然后选择“Auto”（自动）来校正此问题。现在将使用荧光强度对线扫描的振幅进行校准，荧光强度表示为荧光信号除以零荧光信号。STM 将在 x 轴上显示 TIFF 图像栈中的帧数，在 y 轴上显示代表细胞长度的像素数。为了量化钙信号的时间和空间数据，请点击图像（Image）和属性（Properties），并在弹出窗口中输入适当的值，以对 STM 的空间和时间参数进行完整校准。要分析单个钙信号事件，请点击“直线工具”，然后在STM上点击并拖动，沿钙信号事件中心绘制一条与x轴平行的水平直线。接着点击“分析”并选择“绘制轮廓图”。此时将弹出一个窗口，显示该钙信号事件的轮廓图谱。对于ICC-MY钙信号数据的基于颗粒的分析，在Volumetry中打开视频文件，右键单击以选择STK滤镜中的“微分”（Differentiate）。再次右键单击以输入微分值，按Enter键，然后左键单击以启动微分操作。为生成颗粒，请使用鼠标中键滚动浏览视频，选择一个包含20到40帧的片段，该片段应包括一个静息期，随后出现钙瞬变簇，以及紧随其后的20到40帧。当所有帧选定后，在视频窗口中单击右键，进入STK OPS Ramp DS颗粒信息界面，点击运行颗粒分析程序，该程序将阈值从最大强度逐步递减至最小强度。为确保颗粒分析成功，请尽量包含足够的钙瞬变簇出现前的无活动期以及钙瞬变簇结束后的无活动期数据。这将有助于提高信噪比。分析结果将在绘图窗口中以噪声曲线图的形式显示，同时在轨迹窗口中以三条彩色轨迹显示，其中绿色轨迹代表粒子数量，红色轨迹代表平均粒子尺寸，蓝色轨迹代表绝对强度阈值。要对粒子噪声曲线图进行直方图均衡，请按键盘上的 H 键。然后按右方括号键切换配色方案，直至背景变为白色，彩色轨迹显示在上方。按一次键盘上的 F 键以调出测量工具，再按一次 F 键，在轨迹窗口的滚动条上绘制一条垂直线，位置位于彩色曲线开始向右侧偏移的交点处。在轨迹窗口中，使用鼠标中键从红色轨迹的拐点滚动至标记的白色垂直线。记录显示的Y轴平均值后，再次在轨迹窗口内单击鼠标中键以取消选中蓝色轨迹。在视频窗口中，单击C键调出颜色轮盘，单击D键调整阈值。有效的颗粒将显示为红色，而达到饱和的颗粒将显示为白色。使用鼠标左键滚动，直至去除白色区域，并使用鼠标中键调整色轮中的黄色数值，使其等于Y方向的平均值，从而在确定的阈值下将所有红色区域指定为活跃的钙瞬变颗粒。要将数据保存为基于坐标的颗粒文件，请右键单击以进入STK 3D，保存颗粒零点，然后左键单击以保存文件。要创建粒子活性热图，请打开已保存的粒子文件，在视频窗口中右键单击以访问粒子 STKops、StatMap Flag，并输入标志分配以进行分析。单击应用分析，将生成一幅热图，显示整个记录时长内的总粒子数，不同颜色代表在记录过程中出现的百分比。右键单击可将热图另存为 TIFF 文件。然后在电影窗口中右键单击，以访问粒子测量、粒子统计 STK 等于，并为分析输入一个标志分配。一系列轨迹将在轨迹窗口中生成。STM 分析能够监测和记录钙信号的空间特征，例如空间扩散范围和传播速度。这些信息可以汇总，从而提供细胞在其天然环境中钙信号行为的相当完整的视图。通过颗粒分析，可通过测量颗粒面积和颗粒数量来计算钙信号的定量信息，二者结合可用于确定在特定视野内钙信号激活的空间范围。颗粒分析还可通过检测钙释放位点的位置和触发概率，实现对细胞内钙信号的深入定量分析。通过根据颗粒的时间特征将其分配到不同的标记中，可以精确定位起始颗粒。此外，还可获得大量硬数据，包括起始位点的数量、位点的大小（以像素和微米为单位）、每个钙瞬变簇期间各个起始位点单次或多次激活的概率，以及每个钙瞬变簇周期中激活位点所占的百分比。该方案成功的关键在于保持一致性。所有数据集和所有视频必须采用完全相同的方式处理，以确保结果的可靠性和可重复性。在处理粒子文件时，这一点尤为重要。我们的方案能够对原位钙信号进行深入表征，结合适当使用的多种统计学方法，可评估一系列空间和时间参数之间的差异。本方案中的这些分析技术使研究人员能够提出并回答此前难以解决的科学问题，涉及肠道起搏、肠道神经支配以及下尿路的神经调控等方面。

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