时空映射与颗粒分析技术在原位定量细胞内 Ca²⁺ 信号传导中的应用

从钙成像实验中获取大量数据的能力已显著提升，尤其是在组织成像实验中。我们的方案描述了用于定量和描述这些数据集的适当分析技术。我们的方案可生成一系列与整个组织中钙信号传导固有的空间、时间和强度值，而这些信息可能在更为基础的分析方法中丢失。

在成像转移前一小时，将从小鼠中获取的表达基因编码钙指示剂的卡哈尔间质细胞（ICC）的小肠组织置于旋转盘共聚焦显微镜的载物台上，并持续用37°C的Krebs-Ringer碳酸氢盐（KRB）溶液灌流组织。使用60至100倍放大倍数，在小肠环形肌与纵行平滑肌层之间定位星状的肌间神经丛卡哈尔间质细胞（ICC-MY）。

然后在环形平滑肌层与黏膜下神经丛之间的一个平面内找到纺锤形的深层肌丛间质细胞（ICC）或ICC-DMP，并将视频保存为TIFF图像堆栈。为生成ICC-DMP钙活动的时空图（STMs），在ImageJ中打开图像堆栈，点击Image（图像）、Type（类型），选择32-bit（32位）以调整图像质量。要创建线扫描，右键单击线条选择工具，然后选择分段线（segmented line）。

使用单次左键点击沿单个 ICC-DMP 的中轴绘制一条线，当整个细胞被勾勒完毕后双击。选择 图像、堆栈 和 重新切片，将弹出一个窗口。

选择旋转90度，使线扫描从左到右定向，以便在x轴上按时间、y轴上按空间进行校准和读取，然后单击“确定”。时空图将出现。为了准确测量该图中钙信号的幅度，请选择矩形选区工具，在STM内荧光最均匀且强度最低的区域周围绘制一个感兴趣区域。单击“分析”和“直方图”，获取所选感兴趣区域内的平均强度值，然后单击“编辑”、“选区”、“全选”，以选中整个STM。

接下来，点击“Process”（处理）、“Math”（数学运算），然后选择“Divide”（除法），在弹出窗口中输入所选STM感兴趣区域的平均强度值。此时STM图像将变为黑色。通过在弹出窗口中依次点击“Image”（图像）、“Adjust”（调整）、“Brightness/Contrast”（亮度/对比度），然后选择“Auto”（自动）来校正此问题。

现在将使用荧光强度对线扫描的振幅进行校准，荧光强度表示为荧光信号除以零荧光信号。STM 将在 x 轴上显示 TIFF 图像栈中的帧数，在 y 轴上显示代表细胞长度的像素数。为了量化钙信号的时间和空间数据，请点击图像（Image）和属性（Properties），并在弹出窗口中输入适当的值，以对 STM 的空间和时间参数进行完整校准。

要分析单个钙信号事件，请点击“直线工具”，然后在STM上点击并拖动，沿钙信号事件中心绘制一条与x轴平行的水平直线。接着点击“分析”并选择“绘制轮廓图”。此时将弹出一个窗口，显示该钙信号事件的轮廓图谱。

对于ICC-MY钙信号数据的基于颗粒的分析，在Volumetry中打开视频文件，右键单击以选择STK滤镜中的“微分”（Differentiate）。再次右键单击以输入微分值，按Enter键，然后左键单击以启动微分操作。

为生成颗粒，请使用鼠标中键滚动浏览视频，选择一个包含20到40帧的片段，该片段应包括一个静息期，随后出现钙瞬变簇，以及紧随其后的20到40帧。当所有帧选定后，在视频窗口中单击右键，进入STK OPS Ramp DS颗粒信息界面，点击运行颗粒分析程序，该程序将阈值从最大强度逐步递减至最小强度。为确保颗粒分析成功，请尽量包含足够的钙瞬变簇出现前的无活动期以及钙瞬变簇结束后的无活动期数据。

这将有助于提高信噪比。分析结果将在绘图窗口中以噪声曲线图的形式显示，同时在轨迹窗口中以三条彩色轨迹显示，其中绿色轨迹代表粒子数量，红色轨迹代表平均粒子尺寸，蓝色轨迹代表绝对强度阈值。要对粒子噪声曲线图进行直方图均衡，请按键盘上的 H 键。

然后按右方括号键切换配色方案，直至背景变为白色，彩色轨迹显示在上方。按一次键盘上的 F 键以调出测量工具，再按一次 F 键，在轨迹窗口的滚动条上绘制一条垂直线，位置位于彩色曲线开始向右侧偏移的交点处。

在轨迹窗口中，使用鼠标中键从红色轨迹的拐点滚动至标记的白色垂直线。记录显示的Y轴平均值后，再次在轨迹窗口内单击鼠标中键以取消选中蓝色轨迹。在视频窗口中，单击C键调出颜色轮盘，单击D键调整阈值。

有效的颗粒将显示为红色，而达到饱和的颗粒将显示为白色。使用鼠标左键滚动，直至去除白色区域，并使用鼠标中键调整色轮中的黄色数值，使其等于Y方向的平均值，从而在确定的阈值下将所有红色区域指定为活跃的钙瞬变颗粒。要将数据保存为基于坐标的颗粒文件，请右键单击以进入STK 3D，保存颗粒零点，然后左键单击以保存文件。

要创建粒子活性热图，请打开已保存的粒子文件，在视频窗口中右键单击以访问粒子 STKops、StatMap Flag，并输入标志分配以进行分析。单击应用分析，将生成一幅热图，显示整个记录时长内的总粒子数，不同颜色代表在记录过程中出现的百分比。右键单击可将热图另存为 TIFF 文件。

然后在电影窗口中右键单击，以访问粒子测量、粒子统计 STK 等于，并为分析输入一个标志分配。一系列轨迹将在轨迹窗口中生成。STM 分析能够监测和记录钙信号的空间特征，例如空间扩散范围和传播速度。

这些信息可以汇总，从而提供细胞在其天然环境中钙信号行为的相当完整的视图。通过颗粒分析，可通过测量颗粒面积和颗粒数量来计算钙信号的定量信息，二者结合可用于确定在特定视野内钙信号激活的空间范围。颗粒分析还可通过检测钙释放位点的位置和触发概率，实现对细胞内钙信号的深入定量分析。

通过根据颗粒的时间特征将其分配到不同的标记中，可以精确定位起始颗粒。此外，还可获得大量硬数据，包括起始位点的数量、位点的大小（以像素和微米为单位）、每个钙瞬变簇期间各个起始位点单次或多次激活的概率，以及每个钙瞬变簇周期中激活位点所占的百分比。该方案成功的关键在于保持一致性。

所有数据集和所有视频必须采用完全相同的方式处理，以确保结果的可靠性和可重复性。在处理粒子文件时，这一点尤为重要。我们的方案能够对原位钙信号进行深入表征，结合适当使用的多种统计学方法，可评估一系列空间和时间参数之间的差异。

本方案中的这些分析技术使研究人员能够提出并回答此前难以解决的科学问题，涉及肠道起搏、肠道神经支配以及下尿路的神经调控等方面。