体外和体内实验的位定向诱变-以大肠杆菌rna相互作用为例

站点定向突变对于研究分子相互作用（如RNA-RNA）和RNA蛋白相互作用非常有用。该协议描述了如何使用两步或三步 PCR 方法执行站点定向突变。该方法的主要优点是可合并的不同突变的多样性，以及相对容易和成本这样做。

首先，使用野生型DNA模板和底向对二、一、二、三，具体为2步，或底对为三步、一、四，专用为三步PCR获取PCR产品一。要通过阿加罗斯凝胶电泳验证PCR产品，使用微波炉在100毫升的1X TAE缓冲液中溶解两克阿加罗斯，使2%的加糖凝胶。以每毫升0.5微克的最终浓度加入溴化乙基。

然后铸造阿加罗斯凝胶。凝固后，将它放在电泳单元中。装载已知大小的DNA梯子，将PCR样品与DNA加载染料混合到井中。

以 75 伏运行样品 45 分钟。并在紫外线透光器或凝胶成像系统上可视化波段。接下来，根据制造商协议，使用凝胶提取试剂盒净化PCR产品，用分光光度计测量纯化DNA的浓度。

然后将纯化的DNA储存在零下20摄氏度的TE缓冲液中。要开始使用两步PCR进行位点定向突变，首先使用野生型DNA模板，然后底向对2、1和2、2，用于5个底基因突变，或底数对2、2、2、3个底因突变获得PCR产品2。通过凝胶电泳验证PCR产品，净化PCR产品，并测量其浓度，如前所述。

然后使用野生型DNA模板和PCR产品2作为底像，连同底像2，3为5个底基因突变，或底像2，一个为三个底基因突变，获得PCR产品三。通过凝胶电泳验证PCR产品，净化PCR产品，并测量其浓度，如前所述。然后将纯化的DNA储存在零下20摄氏度的TE缓冲液中。

要开始使用三步PCR进行现场直接突变，首先使用野生型DNA模板和底向对三、一、三、二获得PCR产品二。使用野生型DNA模板和底向对三、三、三、四，获得PCR产品三。使用野生型DNA模板和底向对三、三、四，获得PCR产品三。

通过凝胶电泳验证PCR产品，净化PCR产品，并测量其浓度，如前所述。最后使用二至五纳米的PCR产品二、三作为模板，以及底像对三、一、三、四，获得PCR产品四。通过凝胶电泳验证PCR产品，净化PCR产品，并测量其浓度，如前所述。

将纯化的DNA储存在零下20摄氏度的TE缓冲液中。在这项研究中，使用两步和三步位点定向突变来研究与CsgD的转录后调控的RNA相互作用。野生型CsgD被PCR放大产生PCR产品IA，野生型mcs被PCR放大，产生PCR产品IB。使用三步PCR策略，前两个步骤合成了PCR产品IIA和IIIA，在第三步中合成了IVA，在CsgD中引入突变。

同样，mcaS 中引入了免费的站点定向突变，在前两个步骤中产生 PCR 产品 IIB、IIIB，在第三步中引入 IVB。西方的印迹分析表明，虽然野生型 mcaS 的表达阻止野生型 CsgD 的翻译，但 mcaS 或 CsgD 的突变减轻了观察到的抑制。然而，CsgD 和 mcaS 的突变都阻止 CsgD 的翻译。

使用两步PCR策略，在第一步合成PCR产品IC、IID、IIE、IIF和IIG，在第二步中合成PCR产品IIIC、IIID、IIIE、IIIF和IIIG，将突变引入整个CsgD DNA。使用PCR产品IIIC、IIID、IIIE、IIIF和IIIG合成的HFQ结合到体外转录的CsgD野生型和突变RNA的EMSA结果表明突变等位基因的KD值增加。这证明HFQ可以更有效地与突变体结合。

此外，HFQ在CsgD上有几个结合点，这表现在野生型RNA的三个班次上。但是，对于不同的突变RNA，只观察到两个绑定位点。因此，位点定向突变方法可识别对HFQ完全结合重要的CsgD mRNA的初级和/或次要结构。

此处描述的站点定向突变发生方法依赖于 PCR。良好的 PCR 实践对于该方法至关重要，可能需要优化才能成功。站点定向突变只具有所有三种方法，如 EMSA 和西膨胀功能。

其他方法，例如，包括各种结构测定和一些活动分析，以及翻译后修改研究。