Name: 体外和体内实验的位定向诱变-以大肠杆菌rna相互作用为例 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学习位定向诱变技术，通过两步或三步PCR方法研究大肠杆菌RNA相互作用。该方法操作简便、成本低廉，可用于验证PCR产物并深入理解分子相互作用机制。

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作者感谢南丹麦大学开放获取政策基金的支持。

1. 载体选择
<ol>
	<li>选择用于后续实验的载体。任何载体均适用于本两步和三步PCR方法。</li>
	<li>根据所选载体，选择合适的限制性内切酶用于克隆。</li>
</ol>
2. 位点定向突变的引物设计
<ol>
	<li>选择使用两步法或三步法 PCR 策略（两步法仅适用于突变位点距离目标 DNA 任一末端 &#60;200 bp 的情况）。若采用两步法 PCR，请转至步骤 2.2；若采用三步法 PCR，请转至步骤 2.3。</li>
	<li>设计两步法 PCR 引物。
	<ol>
		<li>设计引物 1 和引物 3，用于扩增目标 DNA，并在其 5’ 端添加包含 4 个核苷酸（例如 ATAT 或 AGCT）的突出端，后接克隆至所选载体所需的相应限制性酶切位点。</li>
		<li>设计引物 2，用于在目标位点引入突变，并在突变位点两侧各包含 10–15 个互补核苷酸。若突变位于 5’ 端，则设计为反向引物；若突变位于 3’ 端，则设计为正向引物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计三步法 PCR 引物。
	<ol>
		<li>设计引物 1 和引物 4，用于扩增目标 DNA，并在其 5’ 端添加包含 4 个核苷酸（例如 ATAT 或 AGCT）的突出端，后接克隆至所选载体所需的相应限制性酶切位点。</li>
		<li>设计引物 2 和引物 3，用于在目标位点引入突变，并在突变位点两侧各包含 10–15 个互补核苷酸。引物 2 与引物 3 互为反向互补序列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于克隆的野生型DNA的PCR扩增
注意：有关 PCR 的详细信息，请参见6。
<ol>
	<li>使用引物1+2（两步PCR）或1+4（三步PCR），以野生型DNA为模板进行PCR6，以获得PCR产物I。采用表1中的PCR程序。</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR结果。
	<ol>
		<li>制备琼脂糖凝胶溶液（2%），即每100 mL 1×三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（EDTA）（TAE）缓冲液中加入2 g琼脂糖。用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。向琼脂糖凝胶溶液中加入DNA染色染料溴化乙锭（终浓度约为0.5 µg/mL），以便后续观察。</li>
		<li>倒入琼脂糖凝胶，置于电泳装置中，加入已混合DNA上样染料的PCR样品以及已知大小的DNA分子量标记物。在75 W条件下电泳45分钟，或直至条带充分分离，然后在紫外（UV）透射仪或凝胶成像系统中观察条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化PCR产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化后DNA的浓度。</li>
	<li>将纯化的DNA储存于-20 °C（溶于三羟甲基氨基甲烷-EDTA（TE）缓冲液中，用于长期保存）或4 °C（溶于dH2O中，用于短期保存），待步骤5使用。</li>
</ol>
4. 通过PCR在DNA中引入定点突变
<ol>
	<li>两步法 PCR（三步法 PCR 请参见步骤 4.2）
	<ol>
		<li>使用引物 1+2（若突变位于 5’ 端）或引物 2+3（若突变位于 3’ 端）进行 PCR6，以野生型 DNA 为模板，获得 PCR 产物 II（PCR 程序见 表 1）。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳验证 PCR，方法同步骤 3.2.1 和 3.2.2。</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化 DNA 的浓度。</li>
		<li>将纯化的 DNA 储存于 -20 °C（TE 缓冲液中）或 4 °C（dH2O 中），直至步骤 5 使用。</li>
		<li>以 PCR 产物 II 作为引物，与引物 3（若突变位于 5’ 端）或引物 1（若突变位于 3’ 端）组合，以野生型 DNA 为模板进行 PCR6，获得 PCR 产物 III（PCR 程序见 表 1）。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳验证 PCR，方法同步骤 3.2.1 和 3.2.2。</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化 DNA 的浓度。</li>
		<li>将纯化的 DNA 储存于 -20 °C（TE 缓冲液中）或 4 °C（dH2O 中），直至步骤 5 使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三步法 PCR
	<ol>
		<li>分别使用引物 1+2 和引物 3+4 进行 PCR6，以野生型 DNA 为模板，获得 PCR 产物 II 和 III（PCR 程序见 表 1）。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳验证各 PCR 反应，方法同步骤 3.2.1 和 3.2.2。</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化 DNA 的浓度。</li>
		<li>将纯化的 DNA 储存于 -20 °C（TE 缓冲液中）或 4 °C（dH2O 中）。</li>
		<li>使用引物 1+4 进行 PCR6，以 2–5 ng 的 PCR 产物 II 和 III 作为模板（在同一反应中）获得 PCR 产物 IV（PCR 程序见 表 1）。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳验证 PCR，方法同步骤 3.2.1 和 3.2.2。 
		注：出现多个非特异性条带是常见现象（有时可通过减少模板量来降低）；然而，只要切取正确大小的条带并进行凝胶回收，非特异性 PCR 产物可被忽略。</li>
		<li>若结果正确，使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化 DNA 的浓度。</li>
		<li>将纯化的 DNA 储存于 -20 °C（TE 缓冲液中）或 4 °C（dH2O 中），直至步骤 5 使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 将野生型和突变型DNA重组至所选载体中
注意：有关后续步骤的详细信息，请参见7。
<ol>
	<li>使用相应的限制性内切酶消化纯化的PCR产物I和III（来自两步PCR）和/或IV（来自三步PCR）。
	<ol>
		<li>在20 µL的1×消化缓冲液中加入每种限制性内切酶各1 µL，于37 °C条件下消化200 ng PCR产物，反应30–60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用凝胶回收试剂盒（材料表）通过凝胶回收法纯化已消化的PCR产物，使用分光光度计（材料表）测定纯化后DNA的浓度，并将DNA储存于-20 °C（TE缓冲液中）或4 °C（dH2O中），直至用于步骤5.6。</li>
	<li>使用相应的限制性内切酶消化纯化的载体，并用碱性磷酸酶处理以减少载体自连事件。切勿对PCR产物进行碱性磷酸酶处理。
	<ol>
		<li>在30 µL的1×消化缓冲液中加入每种限制性内切酶各1 µL以及1 µL碱性磷酸酶，于37 °C条件下消化1,000 ng载体，反应30–60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用琼脂糖凝胶电泳方法（如步骤3.2.1和3.2.2所述）将已消化的载体与废弃DNA（例如未切割的载体和切除的DNA片段）分离。</li>
	<li>使用凝胶回收试剂盒（材料表）通过凝胶回收法纯化已消化的载体，使用分光光度计（材料表）测定纯化后DNA的浓度，并将DNA储存于-20 °C（TE缓冲液中）或4 °C（dH2O中），直至用于步骤5.6。</li>
	<li>按照表2中指定的反应条件，将已消化的PCR产物连接至已消化的载体中。</li>
	<li>在室温下孵育2小时，或在16 °C下过夜孵育。</li>
	<li>将连接反应产物转化至感受态菌株（例如E. coli K12）中。
	<ol>
		<li>将菌株培养至OD600=0.3–0.5，然后将1 mL培养物转移至与连接反应数量相同的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>在3,500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用200 μL转化缓冲液（含0.1 g/mL聚乙二醇3350、5%二甲基亚砜和20 mM MgCl2的10 mL LB培养基）重悬细胞。</li>
		<li>加入连接反应产物，将离心管置于冰上30分钟。</li>
		<li>在42 °C下热激2分钟。</li>
		<li>向1.5 mL离心管中加入1 mL LB培养基，在37 °C下孵育至少45分钟，以实现抗生素抗性表型的表达。</li>
		<li>在3,500 × g条件下离心5分钟，弃去1 mL上清液，用剩余的上清液重悬细胞。</li>
		<li>将细胞涂布于含有适当抗生素的平板上，并在37 °C下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鉴定含有成功插入DNA片段载体的转化子（例如，使用载体特异性和插入片段特异性引物进行PCR验证）。</li>
	<li>通过Sanger测序验证DNA序列。 
	注意：用于测序的引物不得与步骤5.9中所用引物相同。</li>
</ol>
6. 使用构建的载体进行体外和/或体内实验
<ol>
	<li>体内实验 
	注意：这是使用载体表达野生型/突变型 RNA 以表征转录后调控的一个示例。有关蛋白质印迹的更多细节，请参见8.
	<ol>
		<li>培养 E. coli 在适当培养基中培养含有构建载体的K12菌株，必要时诱导表达。通过离心收集样品。</li>
		<li>将细胞沉淀溶于1× SDS上样缓冲液（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8，2.5% SDS，0.002%溴酚蓝，5% β-巯基乙醇，10%甘油）中，于95 °C煮沸5分钟，以制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品。 
		注意：可以自行灌制凝胶，也可使用 commercially available precast gel（商用预制凝胶）。本文所呈现的结果中采用的是后者。 图3 (材料表).</li>
		<li>加入107 将各样本的细胞分别加入不同的孔中（包括蛋白ladder），在200 V电压下电泳，直至蛋白完全分离（约45分钟）。</li>
		<li>将蛋白质通过半干式转膜法在80 mA电流下转印1小时至纤维素膜上。</li>
		<li>用蛋白质混合物（例如，5%脱脂奶粉溶于1x Tween 20-Tris缓冲盐溶液（TTBS）缓冲液）封闭膜。</li>
		<li>加入针对目标蛋白（如GFP、FLAG或HIS标签蛋白）的一抗（溶于1x TTBS缓冲液中），室温下轻柔振荡孵育1小时。</li>
		<li>用1x TTBS洗涤膜10分钟，以去除未结合的抗体。重复此步骤两次。</li>
		<li>加入针对一抗的二抗（溶于1× TTBS缓冲液中），以实现检测（例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗），室温轻柔振荡孵育1小时。</li>
		<li>用1×TTBS洗涤膜10分钟，以去除未结合的抗体。重复此步骤两次。</li>
		<li>使用与二抗兼容的技术对膜进行显影（例如，若使用了HRP标记的二抗，则在与鲁米诺衍生产物孵育后进行成像）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外实验 
	注意：本示例展示了如何利用该载体作为体外转录RNA的模板，以表征RNA-蛋白质相互作用。有关EMSA的更多细节，请参见9.
	<ol>
		<li>使用T7体外转录试剂盒制备体外转录本（材料表）以及第5步中的载体作为模板。</li>
		<li>使用4.5%含7 M尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA转录本，并通过透析袋电洗脱法直接从凝胶中提取RNA材料表).</li>
		<li>标记RNA（例如，使用γ-32使用T4多聚核苷酸激酶进行P-ATP标记材料表）并用柱子再次纯化（材料表). 
		警告：在使用放射性物质前，须咨询当地辐射安全官员。</li>
		<li>在1x结合缓冲液（20 mM Tris，pH 8，100 mM KCl，1 mM MgCl₂）中，分别进行不同反应，将标记的RNA与浓度递增的蛋白质混合。2，1 mM 二硫苏糖醇（DTT）。 
		注意：在展示的结果中（图4)，将2 nM的放射性标记csgD mRNA与0至2 µM的Hfq蛋白（单体浓度）梯度混合。</li>
		<li>让蛋白质和RNA杂交后，将杂交混合物上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶，于200 V电压下电泳1.5小时。</li>
		<li>使用与步骤6.1.3中标记方法相兼容的技术对凝胶进行成像（例如，若使用了放射性标记，可通过磷屏成像检测）。</li>
		<li>使用图像处理程序量化迁移条带的相对强度，并利用图形与数据分析软件对数据进行曲线拟合（S型曲线）。材料表）。根据拟合曲线计算解离常数（Kd) 值可通过软件自动确定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+binding+to+5%27+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li>
<li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li>
<li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli%3A+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
<li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassette+mutagenesis%3A+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

定点突变技术具有广泛的应用，本文包含了体内和体外实验的代表性结果，用以举例说明如何利用该技术得出生物学结论。长期以来，定点突变一直是RNA相互作用研究的金标准。该技术的优势在于将引入相关突变与后续检测和实验（如Western印迹或EMSA）相结合，从而推断特定DNA位点及其在相应基因产物功能中的重要性。在决定进行定点突变时，应仔细设计引物，以最大限度地发挥该技术的效能（例如，确定需要突变的位点）；务必包含正确的末端延伸序列和限制性酶切位点，并注意引物/模板的特性。
本方案中描述的实际诱变依赖于PCR。因此，该步骤最关键的环节是PCR的反应条件。优化PCR的方法有多种，包括Mg2+浓度梯度、DMSO浓度以及退火步骤的温度梯度。更多细节请参见文献3。除了优化PCR反应本身外，在进行定点诱变时还需特别注意两点：高质量的模板和精心设计的引物。
高质量的PCR模板往往是PCR成功与失败的关键。尽管可以使用细胞裂解液作为DNA模板来源，但优先选择纯化的DNA（基因组DNA、载体DNA或PCR产物...

DNA 常被称为活细胞的蓝图，因为细胞的所有结构信息都编码在其 DNA 序列中。精确的复制和 DNA 修复机制确保了突变的发生率极低，这对于维持编码基因的正常功能至关重要。DNA 序列的改变可能在多个层次上影响后续功能，从 DNA 水平（转录因子和限制性内切酶的识别）、到 RNA 水平（碱基互补配对和二级结构的改变），以及/或者蛋白质水平（氨基酸替换、缺失、插入或移码）。尽管许多突变对基因功能影响不大，但某些 DNA 中的突变可能带来重大影响。因此，定点突变技术是研究特定 DNA 位点在各个层面重要性的有力工具。
本方案描述了一种用于引入特定突变的靶向诱变方法。该方案依赖于两种不同的PCR策略：两步PCR或三步PCR。若目标突变位于目的DNA的5'端或3'端附近，则可采用两步PCR方法（&#60;200个碱基对（bp）处）时，三步PCR在所有情况下均适用。
在两步PCR方法中，需要设计3种引物，其中一对引物用于扩增目的DNA（分别为正向引物1和反向引物3），另一种引物用于引入突变。引入突变的引物（引物2）若突变位点靠近5'端则应设计为反向，若突变位点靠近3'端则应设计为正向。在第一轮PCR中，引物1+2或2+3分别扩增靠近5'端或3'端的小片段。将所得PCR产物作为第二步中的引物，分别与引物1或引物3组合使用，从而获得在目的DNA中带有突变的PCR产物（图1A）。
在三步PCR中，共设计4条引物，其中一对引物用于扩增目的DNA片段（分别为正向引物1和反向引物4），另一对引物用于引入具有重叠互补性的特定突变（分别为反向引物2和正向引物3）。在第一步和第二步中，引物1+2和引物3+4分别扩增5'端和3'端。在第三步中，以上两步所得的PCR产物作为模板，使用引物1+4进行扩增。因此，最终获得的PCR产物即为携带目标突变的目的DNA片段（图1B）。
尽管突变后的 DNA 可用于任何后续应用，但本实验方案描述了如何将该 DNA 重新组合到克隆载体中。使用克隆载体具有多个优势，例如克隆操作简便，并可根据载体的特定特征实现特定的实验应用。这一特性常用于 RNA 相互作用研究。另一种用于 RNA 相互作用研究的技术是针对 RNA 与其他 RNA1,2 或蛋白质3,4 形成复合物时的结构探针分析。然而，结构探针分析仅能在体外进行，而定点突变及后续的克隆操作则可实现体内相互作用研究。
定点突变已广泛用于RNA相互作用研究，如此处所述。然而，关于两步或三步PCR的关键方法可适用于任何DNA片段，因此不仅限于RNA相互作用研究。
为说明该技术及其可能的应用，对mRNA转录后调控中重要区域的表征， csgD, 的 大肠杆菌 (E. coli）被使用。在 大肠杆菌，csgD 在蛋白Hfq的协助下，小非编码RNA McaS靶向抑制CsgD的蛋白表达2,4,5该技术用于向碱基配对区域引入突变 csgD 以及 McaS 和 Hfq 结合位点 csgD所获得的DNA随后被克隆至适用于后续实验的载体中。该技术的下游应用包括体内和体外实验。作为示例，示例1通过蛋白质印迹法（western blot assay）进行体内表征，示例2则通过电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）进行体外表征。在这两种情况下，均展示了位点定向诱变如何与其他技术结合使用，以对目标基因作出生物学结论。

<table><tbody><tr><td>兔源抗GroEL抗体</td><td>默克</td><td>G6532</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Azure c200</td><td>Azure</td><td>NA</td><td>凝胶成像工作站</td></tr><tr><td>定制DNA寡核苷酸</td><td>默克</td><td>VC00021</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11</td><td>DeNovix</td><td>NA</td><td>用于核酸测量的分光光度计</td></tr><tr><td>DNA上样缓冲液（6X）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>1% 溴化乙锭溶液</td><td>卡尔·罗斯</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 胶回收试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>Fermentas</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td><td>Gerard Biotech</td><td>TO12</td><td>用于电洗脱的透析管</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT 电泳槽</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1704406</td><td>水平电泳系统</td></tr><tr><td>小鼠源单克隆 ANTI-FLAG M2 抗体</td><td>默克</td><td>F3165</td><td>一抗</td></tr><tr><td>小鼠免疫球蛋白</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0447</td><td>HRP 标记的二抗</td></tr><tr><td>NucleoSpin miRNA</td><td>Macherey Nagel</td><td>740971</td><td>RNA纯化</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NP0323BOX</td><td>用于蛋白质分离的 Bis-Tris 凝胶</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 PCR 预混液（含 HF 缓冲液）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0531S</td><td>DNA聚合酶</td></tr><tr><td>PowerPac HC 高电流电源供应器</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>兔免疫球蛋白</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0448</td><td>HRP 标记的二抗</td></tr><tr><td>SeaKem LE 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc</td><td>NA</td><td>图形与数据分析软件工具</td></tr><tr><td>T100热循环仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1861096</td><td>PCR仪</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>连接酶</td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液（Tris-乙酸-EDTA）（50X）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

位点定向诱变在体外和体内实验中的应用——以大肠杆菌（escherichia coli）中的rna相互作用为例

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

定点突变是一种用于在DNA中引入特定突变的技术，以研究小非编码核糖核酸（sRNA）分子与靶标信使RNA（mRNA）之间的相互作用。此外，定点突变还可用于绘制蛋白质在RNA上的特异性结合位点。本文描述了基于两步和三步PCR引入突变的方法。该方法适用于所有蛋白质-RNA及RNA-RNA相互作用的研究。简而言之，该技术依赖于设计含有目标突变的引物，通过两步或三步PCR扩增获得带有突变的PCR产物，随后将该产物用于克隆。在此，我们介绍了如何采用两步法和三步法对sRNA分子McaS以及mRNA csgD 进行定点突变，以研究RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用。我们应用此技术研究RNA相互作用，但该技术同样适用于所有类型的突变研究（例如DNA-蛋白质相互作用、氨基酸替换/缺失/插入）。除非天然碱基外，可引入任意类型的突变，但该技术仅适用于能够将PCR产物用于后续实验操作（如克隆或作为进一步PCR的模板）的情况。

研究RNA相互作用以探讨转录后调控 csgD 双载体系统被选用：一个用于表达 csgD mRNA 和另一种用于表达小非编码 RNA McaS 的分子。 csgD 被克隆到pBAD33中，这是一种具有氯霉素抗性的阿拉伯糖诱导型中拷贝质粒，而McaS被克隆到mini R1 pNDM220中，这是一种具有氨苄青霉素抗性的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导型低拷贝质粒。野生型 csgD 使用引物1A和4A（4A包含一个FLAG序列）对目标片段进行PCR扩增，得到PCR产物IA；同时使用引物1B和4B对野生型McaS进行PCR扩增，得到PCR产物IB。采用三步PCR策略在预测的碱基配对区域引入替换突变。 csgD 和 McaS. 在前两步中，分别使用引物1A+2A和3A+4A扩增得到PCR产物IIA和IIIA。在第三步中，以PCR产物IIA和IIIA为模板，使用引物1A和4A扩增得到PCR产物IVA。图 2A</strong...

定点突变是一种用于在脱氧核糖核酸（DNA）中引入特定突变的技术。本实验方案介绍了基于两步法和三步法聚合酶链式反应（PCR）的定点突变操作方法，该方法适用于任何感兴趣的DNA片段。

位点定向诱变在体外和体内实验中的应用——以大肠杆菌（Escherichia coli）中的RNA相互作用为例

定点突变是一种用于在 DNA 中引入特定突变的技术，以研究小非编码核糖核酸与……之间的相互作用

定点突变可用于研究分子间相互作用，例如 RNA-RNA 和 RNA-蛋白质相互作用。本实验方案描述了如何通过两步或三步 PCR 方法进行定点突变。该方法的主要优势在于可引入多种不同类型的突变，且操作相对简便、成本较低。首先，使用野生型DNA模板以及针对两步法PCR的特异性引物对二、一和二、三，或针对三步法PCR的特异性引物对三、一和三、四，扩增获得PCR产物一。通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物：将2克琼脂糖溶于100毫升1×TAE缓冲液中，使用微波炉加热溶解，配制2%琼脂糖凝胶。加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5微克/毫升。然后倒入琼脂糖凝胶。待凝固后，将其放入电泳装置中。加入已知大小的DNA Marker，以及与DNA上样染料混合的PCR样品至加样孔中。以75伏电压电泳运行样品45分钟，然后在紫外透射仪或凝胶成像系统中观察条带。接下来，按照生产商的说明书，使用凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，并用分光光度计测定纯化后DNA的浓度。然后将纯化的DNA在TE缓冲液中于-20°C保存。开始进行两步PCR的定点突变时，首先使用野生型DNA模板，以及引物对2,1和2,2进行五次引物突变，或使用引物对2,2和2,3进行三次引物突变，以获得PCR产物2。通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，纯化PCR产物，并按照前述方法测定其浓度。然后以野生型DNA模板和PCR产物二作为引物，分别与引物二、三组合进行5'端突变，或与引物二、一组合进行3'端突变，获得PCR产物三。通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，纯化PCR产物，并按前述方法测定其浓度。随后将纯化的DNA溶于TE缓冲液中，于-20°C保存。开始进行三步PCR的定点突变时，首先使用野生型DNA模板以及引物对三、一和三、二，获得PCR产物二。使用野生型DNA模板以及引物对三、三和三、四，获得PCR产物三。使用野生型DNA模板以及引物对三、三和三、四，获得PCR产物三。通过凝胶电泳验证PCR产物，纯化PCR产物，并按照之前所述方法测定其浓度。最后，以2至5纳克的PCR产物二和三作为模板，分别使用引物对三、一以及三、四进行扩增，以获得PCR产物四。通过凝胶电泳验证PCR产物，纯化PCR产物，并按照之前所述方法测定其浓度。将纯化的 DNA 储存在 TE 缓冲液中，于 -20 摄氏度保存。在本研究中，采用两步法和三步法的定点突变技术，研究与 CsgD 转录后调控相关的 RNA 相互作用。通过 PCR 扩增野生型 CsgD，得到 PCR 产物 IA；扩增野生型 mcaS，得到 PCR 产物 IB。采用三步 PCR 策略，在前两步中分别合成 PCR 产物 IIA 和 IIIA，第三步合成 PCR 产物 IVA，以在 CsgD 中引入突变。同样，在 mcaS 中引入了相应的定点突变，分别在前两步中产生 PCR 产物 IIB 和 IIIB，第三步中产生 PCR 产物 IVB。Western 印迹分析显示，野生型 mcaS 的表达可抑制野生型 CsgD 的翻译，而 mcaS 或 CsgD 中的突变均可缓解这种抑制作用。然而，当 CsgD 和 mcaS 同时发生突变时，则会阻止 CsgD 的翻译。采用两步PCR策略，在第一步中合成了PCR产物IIC、IID、IIE、IIF和IIG，在第二步中合成了PCR产物IIIC、IIID、IIIE、IIIF和IIIG，以在整个CsgD DNA序列中引入突变。利用PCR产物IIIC、IIID、IIIE、IIIF和IIIG合成的体外转录的CsgD野生型和突变型RNA进行EMSA实验，结果显示突变等位基因的KD值升高。这证明HFQ与突变体RNA的结合效率降低。此外，HFQ 在 CsgD 上具有多个结合位点，这由野生型 RNA 观察到的三个迁移条带所证实。然而，对于不同的突变型 RNA，仅观察到两个结合位点。因此，定点突变方法可鉴定出 CsgD mRNA 中对 HFQ 完全结合至关重要的初级和/或二级结构。此处所述的定点突变方法依赖于 PCR。因此，良好的 PCR 操作实践对该方法至关重要，并可能需要优化才能成功。只有结合 EMSA 和 Western Blotting 等全部三种方法，定点突变才具有强大效力。其他方法，例如包括各种结构检测、一些活性检测以及翻译后修饰研究。

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JoVE Journal

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体外和体内实验的位定向诱变-以大肠杆菌rna相互作用为例

对完整质粒进行定点突变是创建原始质粒微小变异体的简便方法。本文中，我们展示了一种利用常规试剂在质粒中引入碱基替换的简单且经济有效的方法。...

全质粒自制定点突变

本研究展示了如何在染色体水平上形成RNA/DNA杂交体，并揭示遗传信息从RNA向酵母细胞基因组DNA的转移过程。...

利用含RNA寡核苷酸转化法在基因组DNA中生成RNA/DNA杂交体

本文演示了一种针对特定目标序列构建随机突变文库的简单方案。我们展示了该方法如何在大肠杆菌（Escherichia...

在 E. coli 中进行蛋白质定向进化的诱变与功能筛选方案

本文介绍了一种利用 LacI 转基因小鼠模型，针对少量纯化的造血细胞进行 体内 诱变分析的实验方法。 可通过分离 LacI...

在纯化的造血干细胞/祖细胞中鉴定DNA突变

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

本文介绍了一种在裂殖酵母中对目标基因进行随机突变的详细方法。以rpt4+基因为例，该基因编码19S蛋白酶体的一个亚基，我们筛选能够破坏异染色质稳定性的突变。...

通过基因靶向随机诱变筛选裂殖酵母中破坏异染色质稳定的蛋白酶体突变体

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

结合特定RNA序列的蛋白质在基因表达中发挥关键作用。对这些结合位点进行详细表征，对于我们理解基因调控机制至关重要。本文描述了一种针对RNA中蛋白质结合位点的单步饱和突变方法。该方法适用于RNA中所有蛋白质结合位点的研究。...

一种新型饱和突变方法：利用硫代磷酸酯一步法表征RNA中调控蛋白结合位点

本文旨在为RING型E3泛素连接酶的全面生化与功能研究提供一个框架。这一多步骤流程包含详细的实验方案，可用于验证待测蛋白的酶活性，并阐明如何将酶活性与生物学功能相联系。...

体外及植物体内RING型E3泛素连接酶的功能表征

可以从识别部分简并序列的酶出发，开发出具有新序列特异性的限制性内切酶。本文提供了我们成功用于改变NlaIV酶序列特异性的详细实验方案。该方案的关键要素包括转录/翻译反应的体外区室化，以及具有新序列特异性的变体筛选。...

体外定向进化具有更高特异性的限制性内切酶

学习位定向诱变技术，通过两步或三步PCR方法研究大肠杆菌RNA相互作用。该方法操作简便、成本低廉，可用于验证PCR产物并深入理解分子相互作用机制。

位点定向诱变在体外和体内实验中的应用——以大肠杆菌（Escherichia coli）中的RNA相互作用为例

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