由离子通道掺杂脂质膜构成的生物分子忆阻器的组装与表征

本方案描述了如何组装并进行电学表征一种掺杂肽的生物膜，该生物膜在组成、结构和传输特性方面高度模拟生物突触，并表现出可调的忆阻特性。该技术使用户能够在与生物突触和离子通道相关的时空尺度及刺激水平下，评估人工系统中依赖于活动的忆阻效应和短期可塑性。该方法为表征含有电压激活离子通道的仿生膜提供了框架，因而适用于多种细胞运输过程的表征，包括神经元中的相关过程。

我们建议新进入该领域的研究人员首先熟练掌握脂质体溶液的制备以及在导线型电极上组装液滴界面双层膜的技术。通过亲自观察液滴在电极上的分配与定位过程，能够简化双层膜的形成技术，使其立即为所有研究者所掌握。本次操作演示将由我实验室的博士后 Joseph Najem 博士进行。

首先，在微量离心管中制备阿莱霉素储备液：将阿莱霉素肽粉末溶于乙醇中，配制成终浓度为 2.5 毫克/毫升的溶液。短暂涡旋混匀后，将储备液保存于 -20 °C 冰箱中。在 1.5 毫升 Safe-Lock 管中，加入 1 微升阿莱霉素储备液至 99 微升溶液 A 中，使脂质体悬浮液中的阿莱霉素终浓度为 13 微摩尔。

涡旋混匀。所得的肽脂质体溶液为溶液B。取117微升溶液A与10微升溶液B混合，使最终阿拉丁素浓度为1微摩尔，然后涡旋充分混匀。将所得溶液记为溶液C。将溶液B和溶液C于4摄氏度保存。

将一块厚度为1毫米、尺寸为25乘以75毫米的玻璃片放置在倒置显微镜的载物台上。在玻璃片中央滴加几滴十六烷油，然后将油储液池直接放置在玻璃片上的油滴上。用十六烷油完全充满油储液池。

确保储液池位于物镜上方。然后将电极夹持器插入安装在显微操作器上的电流放大器的前置放大头段。显微操作器可缩短电极长度并减少电噪声。

然后，将带有第二根银-氯化银导线的玻璃微电极夹持器安装到另一个显微操作器上。使用显微操作器调整电极位置，使银-氯化银导线的琼脂糖包被尖端完全浸入油储液池中，并处于相近的垂直平面。对齐两个电极，并使其相隔数毫米。

为形成脂双层，将电极垂直插入油相中。使用微量移液器在每根导线上滴加200纳升脂质溶液A。静置三到五分钟，使脂质单层在水-油界面处自发组装。

如果周围的油密度足够低，液滴可能会下垂。随后，降低电极使其重新浸入，直至两个电极的末端刚好接触油槽底部。接着，通过水平移动电极使液滴相互接触，以形成双层膜。

为了获得具有钳制滞回特性的电流-电压关系，使用函数发生器向由溶液A液滴组装而成的、不含阿莱霉素（alamethicin）的脂质膜施加三角波或正弦波电压信号，并记录在多个频率下的感应电流响应。为记录脂质双层界面的尺寸，可通过计算机测量脂质膜的直径，或记录由10赫兹、10毫伏三角波引起的峰峰值电流幅值，以计算膜的面积。将导线从油相中取出，以移除不含阿莱霉素的液滴。

使用溶液C添加新的水相液滴并形成脂双层。根据方波电流的幅度，利用显微操作器调节液滴间的接触，使脂双层的面积与先前形成的相近。然后施加10赫兹、10毫伏的电压波形，并如前所述记录诱导的电流响应。

使用自定义编程软件和模拟电压源进行脉冲实验时，生成具有特定高、低幅度以及开启时间和关闭时间的电压脉冲。记录施加脉冲后产生的电流响应。电流随电压变化的曲线显示，在无短杆菌肽的脂双层上施加电压偏置后，出现非零电流响应。

加入0.017赫兹，该频率下阻抗主要由膜电阻决定。对于高度绝缘的膜，显示出较低的欧姆电流响应。由两个含有短杆菌肽A（alamethicin）肽的液滴形成的脂双层的电流-电压曲线显示，当电压超过100毫伏的插入阈值时，电流呈指数增长。

在高电压下，位于脂双层表面的阿莫芬肽会插入膜内并聚集形成导电孔道。由于来自膜两侧的不同肽群分别插入和聚集，导致两个极性下的电流响应呈对称性。必须从总电流中减去电容电流，才能获得仅反映忆阻特性的捏合滞后电流-电压响应。

生物分子忆阻器在后续电压脉冲作用下表现出电导增加的响应，即使在每次关闭期间间歇性地恢复绝缘态，其开启期间电导仍会增加。当前刺激和先前刺激均对电流的增加有贡献。在将两个液滴合并形成双层膜之前，两个液滴表面必须先形成完整且均匀的单层膜。

如果液滴过早接触，它们会合并，无法形成双层膜。目前，我们正在设计和制造基于微流控的神经网络，该网络由固态神经元组成，神经元之间通过基于膜的突触连接，并利用美国橡树岭国家实验室（ORNL）高性能超级计算机的网络融合优化技术进行支持。这些忆阻器是首次在成分、结构、开关机制和离子传输方面与生物突触相类似的器件。

因此，它们为实现类脑计算和记忆提供了生物分子基础。