Name: 超薄聚二甲基硅氧烷微氟化片在保水作用下固定化活线虫个体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: 了解使用超薄聚二甲基硅氧烷微流控芯片固定化活秀丽隐杆线虫的方法。该技术可在保水条件下实现精准微束辐照、行为学检测及长期成像观察，为神经科学研究提供可重复利用的高效实验平台。

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作者感谢Atsushi Higashitani博士在秀丽隐杆线虫（C. elegans）处理方面提供的宝贵建议，感谢Yuya Hattori博士、Yuichiro Yokota博士和Yasuhiko Kobayashi博士的有益讨论。作者感谢秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetic Center）提供秀丽隐杆线虫（C. elegans）和大肠杆菌（E. coli）菌株。我们感谢QST高崎先进辐射源研究所（QST-Takasaki TIARA）回旋加速器团队在辐照实验中给予的热心协助。我们感谢Susan Furness博士对本手稿初稿的编辑。本研究部分由日本学术振兴会（JSPS）的KAKENHI基金（资助编号JP15K11921和JP18K18839）支持，资助对象为M.S.

1. 菌株及保藏
<ol>
	<li>根据实验目的选择合适的 C. elegans 品系和大肠杆菌 Escherichia coli（食物）。 
	注意：本文中通常使用野生型 N210C. elegans（图 2A），仅成像实验使用 HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3'utr, unc-119(+)]V11。以 E. coli OP50 作为 C. elegans 的食物。某些体形异常的突变体，例如呈卷曲形态的 unc-119(e2498) III 突变体（图 2B），也可被容纳于直形微流控通道中（图 2C）。</li>
	<li>将 C. elegans 在含有 10 mL 线虫生长培养基（NGM）的 6 cm 培养皿中，于 20 °C 培养，培养基表面接种过夜培养（37 °C）的 E. coli，具体方法如前所述10。 如有可能，应从胚胎阶段开始同步 C. elegans 的发育时期。</li>
	<li>选用营养充足、孵化后约 3–4 天的成虫，其体宽约为 50–60 µm，此尺寸最适于蠕虫芯片中的微流控通道大小。</li>
</ol>
2. 芯片上固定化缓冲液的选择
<ol>
	<li>对于可润湿的蠕虫载片，可根据实验目的使用任何缓冲液。 
	注意：先前已确定适用于PDMS微流控芯片上片上固定的合适缓冲液9，以下缓冲液在固定后对动物的运动能力无影响：含高浓度NaCl的S基础缓冲液（5.85 g NaCl，1 mL胆固醇（5 mg/mL乙醇溶液），50 mL 1 M pH 6.0磷酸钾，加H2O至1 L；经高压灭菌处理）10、M9磷酸盐缓冲液（5 g NaCl，3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，1 mL 1 M MgSO4，加H2O至1 L；经高压灭菌处理）10、含明胶的洗涤缓冲液（5 mL 1 M pH 6.0磷酸钾，1 mL 1 M CaCl2，1 mL 1 M MgSO4，0.5 g明胶，加H2O至1 L；经高压灭菌处理）12，以及超纯水9。本文中通常使用洗涤缓冲液，而S基础缓冲液仅在第3节中用于评估不同盖膜材料对片上固定效果的影响。</li>
	<li>对于不具备润湿性的传统微流控芯片，应使用洗涤缓冲液，因其能最有效地保持芯片微流道内的湿度，从而防止秀丽隐杆线虫（C. elegans）个体干燥（无论微流控芯片是否具有润湿性）。</li>
</ol>
3. 芯片上固定化适用覆盖膜的选择
<ol>
	<li>制备不同覆盖膜的操作如下。根据操作的便捷性，将以下透明且生物相容的覆盖膜裁剪至合适尺寸（即厚度为130-170 µm的盖玻片、厚度为125 µm的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜，以及厚度约为130 µm的聚苯乙烯（PS）薄膜：尺寸为宽10-15 mm，长30-50 mm。</li>
	<li>使用不同的覆盖膜进行3小时的芯片内固定，具体步骤如下：根据步骤4.1–4.6，包埋不少于10只已清洗的成年个体&#160;（孵化后3.5天）在蠕虫培养片中分别使用每种覆盖膜，静置3小时。</li>
	<li>为便于比较，按如下步骤给予3小时自由活动：将不少于10只经清洗的成年动物置于含有3 mL新鲜NGM的3.5 cm培养皿中，盖上皿盖，静置3小时。</li>
	<li>在芯片上固定3小时后，立即按照步骤5.1–5.3收集动物。取下蠕虫片上的覆盖膜，向每只动物加入一滴缓冲液。&#160;使用铂金丝挑取液滴中游动的动物，转移至含有3 mL无食物新鲜NGM的3.5 cm培养皿（实验用培养皿）中。</li>
	<li>在自由活动3小时后收集动物。向每只动物加入一滴缓冲液。用铂金丝挑取在NGM平板液滴中游动的动物，转移至检测平板。</li>
	<li>评估覆盖膜对运动性的影响（运动能力检测）。
	<ol>
		<li>转移至检测板后至少5分钟，在显微镜下人工计数“体弯”次数（定义为每20秒间隔内前段身体区域的弯曲次数）13.</li>
		<li>每种覆盖膜独立重复进行五次运动能力检测。 
		注意：在代表性结果所示的实验中，每个同时容纳多只动物的实验均评估了10只动物，而先前的研究中仅统计了5只动物13.</li>
		<li>计算每组实验中10只动物的平均体弯次数，然后对五次独立实验的结果取平均值，以评估芯片上固定化的影响。使用电子表格软件中的单因素方差分析（ANOVA）对数据进行统计分析，显著性水平设为0.01和0.05。 
		注意：根据这些实验结果，具有高透氧性的聚苯乙烯（PS）覆盖膜被认为较为合适（参见代表性结果）。这些聚苯乙烯膜随蠕虫载片一同提供。聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜因透氧性较低，不适合使用，因为在蠕虫载片上进行长期固定时，线虫容易因覆盖该膜而窒息。此外，覆盖膜在整个操作过程中保持完整、不破裂也至关重要；玻璃盖片&#160;因此也不合适（见代表性结果）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 芯片上的固定化
注意：应佩戴一次性无菌手套，以避免污染线虫培养板。
<ol>
	<li>将无自发荧光的薄透明片（如聚苯乙烯或玻璃盖片）作为底部盖片放置于实验台或显微镜载物台上。使用平头镊子轻轻将线虫样本片放置在底部盖片上。 
	注意：除了使用60 µm宽微流控通道的线虫芯片（适用于孵化后3-4天的成虫），也可使用50 µm宽通道的芯片（适用于孵化后3天的年轻成虫以及成虫期体型较小的突变体）。应根据所用线虫的体型选择合适的芯片。</li>
	<li>收集动物时，挑取一只成体个体 秀丽隐杆线虫 在体视显微镜下使用铂金挑针从培养板中挑取。若需要多个个体，可重复此步骤。</li>
	<li>用清洗动物以去除食物（细菌）。
	<ol>
		<li>在6 cm未处理（疏水性）培养皿表面放置至少三个液滴（每滴5 µL）缓冲液。</li>
		<li>使用铂金丝挑取器将动物转移至一滴液体中，使其通过游动清除体内食物。在另外两滴液体中分别清洗两次，再于另一滴液体中冲洗动物。 
		注意：在开展任何实验之前，有必要练习该操作流程，以确保能够快速完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在蠕虫观察片表面滴加2-3 µL缓冲液。用移液工具从培养皿的液滴中吸取清洗后的线虫，转移至蠕虫观察片的液滴中。</li>
	<li>将动物封闭在微流控通道中，步骤如下：使用平头镊子将聚苯乙烯（PS）覆盖膜置于蠕虫培养片上，并从培养片一端到另一端轻轻按压通道区域，以保持湿度（如前所述）。4,9). 
	注意：动物被随机包封在通道中。通过覆盖芯片片层，含有动物的液滴在蠕虫片层上扩散，使液滴广泛分布于多个通道内。每个动物可被包封于其中任意一个通道中。使用蠕虫片层进行芯片上固定的关键在于，其大范围区域内提供了多个可用通道。</li>
	<li>将动物放入微流控通道后，立即在显微镜下观察其头部是否移动，以确认动物存活例如， 1倍或2倍放大。</li>
	<li>记录动物的位置，同时执行步骤 4.6，并在专用纸上注明以下内容（补充文件 1）：动物所在通道的编号；动物在通道中的位置（左/中/右）；以及头部朝向。</li>
	<li>用箭头标出通道中每只动物的位置，箭头方向对应动物头部的方向。 
	注意：通道编号（例如， 1、5、10、15、20、25 标记刻在微流控通道左右两侧附近的蠕虫芯片表面图1B）。专用表格上的这些信息可快速定位动物，提高操作效率，同时有助于防止后续步骤中的辐射泄漏。</li>
</ol>
5. 从线虫培养皿中收集动物
<ol>
	<li>固定后立即使用平头镊子移除蠕虫片上的覆盖膜。</li>
	<li>将 10–15 µL 缓冲液滴加到容纳动物的微流控通道上，在体视显微镜下观察动物开始在液滴中游动。 
	注意：动物在新液滴中可自主开始游动，无需额外施加压力、辅助或推动。仅需在动物上方滴加缓冲液，即可使其自行游出通道。若动物在步骤 7.9 的照射过程中或在步骤 4.2–4.5 的固定过程中受到严重损伤，则可能无法在液滴中游动，但这种情况较为罕见。此外，若动物在移除覆盖膜时仍附着于膜上，则应将液滴直接滴加到覆盖膜上，而非通道内。</li>
	<li>使用铂金挑针拾取在液滴中游动的动物，并将其转移至检测培养皿中。</li>
</ol>
6. 蠕虫切片在成像观察中的应用
注意：蠕虫载片可广泛用于显微观察。该芯片能够保持水分，并且在芯片上固定线虫3小时后，不会影响秀丽隐杆线虫（C. elegans）个体的运动能力9。此外，该芯片本身无自发荧光，适用于荧光成像实验。以下提供一个荧光成像实验的应用示例。
<ol>
	<li>选择一台荧光显微镜，并在显微镜上安装数字相机或数字摄像机，以分别采集图像或视频（图3A). 
	注意：显微镜的工作距离（WD）根据物镜规格不同而超过0.2 mm（参见 图3B，C）。本文所用荧光显微镜系统的规格如表所示 材料表然而，该规格并不局限于本示例，因为它取决于观察目的和/或使用者的需求。</li>
	<li>选择任意一种荧光菌株 秀丽隐杆线虫 并按照第1节所述进行维持。 
	注意：若需观察体壁肌肉收缩（见代表性结果），请使用年轻成虫 HBR411秀丽隐杆线虫，其中使用报告基因在所有体壁肌细胞中表达钙指示剂 GCaMP3.35。应选用年轻成虫（孵化后不超过3天），其体型需小于微流控芯片通道的宽度（50 或 60 µm）。微小的间隙使得线虫能够轻微弯曲，从而可通过钙离子指示剂观察其爬行过程中的肌肉收缩与舒张。</li>
	<li>按照第4节中的固定程序对动物进行围栏操作。</li>
	<li>观察动物的荧光斑点（例如使用荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的菌株，并通过显微镜附着的数码相机采集图像。 
	注意：遵循先前已建立的方法14,15,16，因为显微镜观察方法（包括荧光观察）及显微镜系统的配置需根据观察目的而定。</li>
	<li>利用视频采集技术观察钙离子波在图像中的传播，以记录HBR4线虫体壁肌肉的收缩与舒张等动态活动视频 1).</li>
</ol>
7. 蠕虫薄片在微束辐照中的应用
注意：准直微束辐照系统5可使用由QST高崎先进辐射应用离子加速器设施（TIARA）的方位场变化回旋加速器加速产生的多种重离子粒子（图4A）。在束流出口下方设有用于辐照的自动载物台（图4B）。利用该系统对C. elegans进行重离子微束辐照的操作步骤如下。
<ol>
	<li>在专为微束辐照装置定制的铝制框架上找到包含多个动物的线虫片，并将其放置在自动载物台上进行辐照（图4C).</li>
	<li>提升照射样品（即，将装有动物的线虫培养板置于框架上，根据自动载物台下方显微镜的监测图像，调整至紧靠（约2 mm）射线出口处图4D).</li>
	<li>垂直定位后，使用定制的动物与细胞培养靶向照射软件，将每个动物定位至微束辐照的目标位置。为定位微流控通道内包含的每个动物，请参考步骤 4.7–4.8 中所述的专用工作表（见 补充文件 1）并确认通道左右边缘附近的通道编号。</li>
	<li>使用辐射软件和激光鼠标通过遥控系统控制自动载物台在 X 和 Y 方向上的移动，将动物定位在射束出口正下方。</li>
	<li>通过观察位于样品自动载物台下方的显微镜投影，调整照射区域，将光标移动至目标动物的照射位置，进行粗略调准。</li>
	<li>粗略定位后，退出并关闭辐照室，然后移至相邻的控制室，以避免操作人员受到辐照。</li>
	<li>使用与离子计数系统相连的控制台，设定一次辐照程序所需的离子粒子数量，以对应动物特定区域的辐照。 
	注意：该装置由准直微束辐照系统中的塑料闪烁体和光电倍增管组成。</li>
	<li>从辐照控制室，根据自动载物台下方显微镜的监视器图像微调动物的位置，该图像与辐照室内监视器上显示的图像相同图4E).</li>
	<li>通过点击软件中的照射按钮，对微束照射进行靶向操作。 
	注意：在下图所示示例中 图4F我们以头部区域的咽部为靶区，用适当数量的微束碳离子进行辐照。由于通过与控制台和辐照软件相连的离子计数系统对穿过样品的离子粒子数量进行计数，因此在达到预设的离子粒子数后，辐照即自动停止。</li>
	<li>在专用记录表上找到每只动物，并对每只动物进行靶向照射。重复步骤 7.8 和 7.9，直至所有动物均完成照射。</li>
	<li>辐照后立即进入辐照室，降下自动辐照载物台。取下位于自动载物台上的定制框架中的样品。</li>
	<li>按照步骤5.1-5.3所述收集动物。</li>
	<li>根据研究目的，进行行为学和/或分子分析，以评估靶向照射的效果。 
	注意：第 3.6 步中描述的运动能力检测是一种评估辐照对运动性影响的有效方法4,9.</li>
</ol>
8. 蛔虫切片的重复使用处理
注意：如果使用后按照以下方法进行清洁和灭菌，蠕虫培养片至少可重复使用10次，且对动物无任何不良影响9。
<ol>
	<li>清洗
	<ol>
		<li>将使用过的线虫芯片放置于一个6 cm的培养皿中，并在整个芯片上滴加约100 µL的灭菌超纯水。</li>
		<li>用戴着手套的手指在芯片表面轻轻搅动水分，以冲洗掉灰尘、细菌食物以及在通道中产下的任何卵等污物。</li>
		<li>使用一次性擦拭纸将芯片表面的水分彻底擦干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灭菌
	<ol>
		<li>向盛有线虫芯片的培养皿中注入约5 mL的70%乙醇，并用戴着手套的手指搅动芯片表面，以进一步清除污物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>干燥
	<ol>
		<li>将芯片从盛有70%乙醇的培养皿中取出，置于空气中自然晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>储存
	<ol>
		<li>干燥后，将线虫芯片放置于无菌培养皿中并盖上盖子。也可将芯片储存在盛有70%乙醇的无菌培养皿中。 
		注意：盖膜使用后建议丢弃；若需重复使用，应按照清洗线虫芯片的方法进行清洁。然而，若盖膜使用后出现褶皱，则无法再与芯片紧密贴合，会导致样本脱水，因此应予以更换。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-Ion+microbeams-development+and+applications+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Plasma+Science%22%5BJournal%5D)">Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies.</a> IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).</li>
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<li>Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+dirt%3A+Microfluidic+substrates+for+nematode+neurobiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior.</a> Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
<li>Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+microfluidics+device+for+mechanical+stimulation+and+high+resolution+imaging+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用可润湿的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片在活体条件下实现秀丽隐杆线虫（C. elegans）的芯片上固定，可高效地对多个线虫进行靶向微束辐照。该系统操作简便，并具备防止干燥的特性，不仅适用于微束辐照，还可广泛应用于多种行为学实验。此类线虫芯片已实现商业化，可方便获取。传统的微流控芯片（如嗅觉芯片）存在线虫和卵在封闭微通道中堵塞的问题，导致线虫难以回收，因此这类芯片通常为一次性使用，增加了实验成本。相比之下，当前线虫芯片的微流控通道为开放式设计，便于线虫的回收。因此，该线虫芯片可重复使用，更具经济性。
近年来，PDMS微流控芯片的技术创新呈现出结构复杂性和多功能性日益增强的趋势16,18,19,20,21,<sup...

辐射（包括X射线、γ射线和重离子束）广泛应用于癌症的诊断与治疗以及离子束育种等生物学领域。目前，大量研究和技术开发正集中于辐射效应1,2,3。微束辐射是一种识别生物体内辐射敏感位点的有力手段4。日本量子科学技术研究开发机构高崎先进辐射研究中心（QST-Takasaki）一直在开发一种在显微观察下利用重离子微束照射单个细胞的技术5，并已建立针对多种模式生物进行靶向微束辐照的方法，这些模式生物包括线虫Caenorhabditis elegans4,6、家蚕7和Oryzias latipes（日本青鳉）8。对线虫C. elegans进行靶向微束辐照可有效抑制特定区域（如头部的神经环），从而有助于揭示这些系统在运动等生命过程中的作用。
已开发出一种无需麻醉即可在芯片上固定秀丽隐杆线虫（C. elegans）个体的方法，以实现微束辐照4。此外，为了改进先前研究中使用的微流控芯片4，我们近期开发了具有亲水性、离子可穿透性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片，称为线虫片（见材料表），用于固定C. elegans个体9。这些线虫片由超薄柔性片材组成（厚度 = 300 µm；宽度 = 15 mm；长度 = 15 mm），其表面具有多个（20 或 25 个）直的微流控通道（深度 = 70 µm；宽度 = 60 µm 或 50 µm；长度 = 8 mm）（图 1A-D）。微流控通道是开放的，可同时容纳多个线虫个体进入其中（图 1E）。该片材具有弹性，可使微流控通道扩张约 10%（图 1F），其弹性可实现对线虫的轻柔包裹。此外，由于 PDMS 具有自吸附能力，可通过在片材表面覆盖一层薄的盖膜将线虫密封在通道内，而无需将线虫推入通道进行封闭。通过翻转盖膜，即可方便地回收线虫个体。
当线虫被限制在通道中或被收集时，这些通道不会对其造成伤害。此外，芯片由本质上具有疏水性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，但可通过赋予材料亲水性来实现保水。保水性和厚度是线虫芯片的有利特性。其保水能力可防止动物在长时间固定后脱水，从而能够进行长期观察。
此外，如先前所述9，这些芯片的厚度仅为 300 µm，允许重离子（例如在水中射程约为 1 mm 的碳离子）穿过包裹动物的芯片。这使得离子粒子能够被检测，并可准确测量施加的辐射剂量。而且，线虫芯片可重复使用，因此具有经济性。采用传统的注射方法时，被包裹的动物有时会死亡，且无法从通道中取出；其卵也可能堵塞通道，导致芯片无法继续使用。因此，这类芯片基本上是一次性的，成本效益较差。
本文详细描述了一系列利用蠕虫片在芯片上固定活体C. elegans个体的方法。通过在芯片上固定后3小时进行动物运动能力测定，我们评估了合适的盖膜。此外，我们还展示了在芯片上固定用于成像观察和微束辐照的实例。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫 &lt;/em&gt;野生型菌株</td><td>美国明尼苏达州秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td>N2</td><td>野生型 &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 本研究中通常使用的菌株</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫 unc-119(e2498) III &lt;/em&gt;突变菌株</td><td>美国明尼苏达州秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td>CB4845</td><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 仅用作体形异常突变体示例的菌株&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫转基因品系&lt;/em&gt; HBR4</td><td>美国明尼苏达州秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td>HBR4</td><td>该转基因的基因型 &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 菌株为 HBR4：&lt;em&gt;goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35::unc-54]&amp;ndash;3&amp;rsquo;utr, unc-119(+)]V&lt;/em&gt;该菌株仅用于成像观察。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌菌株&lt;/em&gt;</td><td>美国明尼苏达州秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td>OP50</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 用作食物的菌株 &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>蠕虫板红外（50/60）</td><td>Biocosm, Inc.，日本兵库县</td><td>BCM17-0001</td><td>微流控芯片，含25个直通道，50/60-&amp;micro;本文所有实验和观察中使用的通道宽度&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蠕虫培养板 60</td><td>Biocosm, Inc.，日本兵库县</td><td>BCM18-0001</td><td>带有20个直通道60的微流控芯片 &amp;micro;m-宽度通道。适用于孵化后20℃条件下饲养3-5天的成虫&amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蠕虫培养板 50</td><td>Biocosm, Inc.，日本兵库县</td><td>BCM18-0002</td><td>具有20个直通道50的微流控芯片 &amp;micro;m-宽度通道。适用于孵化后约3天、20℃条件下的年轻成虫&amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>MATSUNAMI GLASS IND. LTD.</td><td>C030401</td><td>盖玻片（厚度：130-170 &amp;micro;m）在方案3的运动测定实验中使用</td></tr><tr><td>聚苯乙烯薄膜</td><td>Biocosm, Inc.，日本兵库县</td><td>BCM18-0001/ BCM18-0002</td><td>Worm Sheets 套装物品。PS 薄膜（厚度：~130 &amp;micro;m) 在方案3的运动性实验中使用。</td></tr><tr><td>聚酯薄膜Lumirror</td><td>东丽株式会社，日本东京</td><td>Lumirror T60 (t 125 &amp;micro;m)</td><td>PET薄膜（厚度：125 &amp;micro;m) 在方案3的运动行为检测中使用</td></tr><tr><td>IWAKI 60 mm/未处理培养皿</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd.，日本静冈</td><td>1010-060</td><td>未处理的培养皿，用于孵育 &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 在方案1中</td></tr><tr><td>IWAKI 35 mm/未处理培养皿</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd.，日本静冈</td><td>1010-035</td><td>在方案3的运动性实验中使用的未经处理的培养皿</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>默克，法国</td><td></td><td>超纯水</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>日本东京 Nippon Paper Crecia 公司</td><td>62020</td><td>120 毫米 × 215 毫米；每盒 200 张</td></tr><tr><td>WormStuff 虫体挑取工具</td><td>Genesee Scientific Corporation，加利福尼亚州，美国</td><td>59-AWP</td><td>Platina 镊子，专用于夹取 &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>研究用体视显微镜系统</td><td>OLYMPUS CORPORATION，日本东京</td><td>SZX16</td><td>本文所有实验和观察所使用的显微镜</td></tr><tr><td>SZX16电动调焦支架</td><td>OLYMPUS CORPORATION，日本东京</td><td>SZX2-ILLB</td><td>此步骤用于方案3-8中的明场观察。</td></tr><tr><td>物镜（&amp;times;1)</td><td>OLYMPUS CORPORATION，日本东京</td><td>SDFPLAPO1&amp;times;PF</td><td>数值孔径：0.15；工作距离：60 mm。该物镜用于方案3-8中的明场观察。</td></tr><tr><td>物镜（&amp;times;2)</td><td>OLYMPUS CORPORATION，日本东京</td><td>SDFPLAPO2XPFC</td><td>数值孔径：0.3；工作距离：20 mm。这&amp;nbsp; 使用lends进行成像观察。</td></tr><tr><td>汞灯光源</td><td>OLYMPUS CORPORATION，日本东京</td><td>U-LH100HG</td><td>宽发射光谱使得可使用所有常见荧光染料进行多种荧光成像实验。</td></tr><tr><td>SZX16 荧光滤光片装置（YFP 高性能）</td><td>OLYMPUS CORPORATION，日本东京</td><td>SZX2-FYFPHQ</td><td>激发波长：490-500 nm；发射波长：510-560 nm。用于HBR4菌株的成像观察。</td></tr><tr><td>高速数码相机EXILIM</td><td>日本东京卡西欧计算机株式会社</td><td></td><td>EX-F1 图1B、1E、1F，图2A-C以及视频1均使用该数码相机获得。</td></tr><tr><td>Office 2013</td><td>微软公司，美国华盛顿州雷德蒙德</td><td></td><td>用于统计分析的 EXCEL 软件</td></tr></tbody></table>

使用具有保水功能的超薄聚二甲基硅氧烷微流控芯片固定活体 caenorhabditis elegans 个体

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

辐射在生物学应用和离子束育种中被广泛使用，其中微束辐射是识别生物体辐射敏感位点的一种强有力手段。本文介绍了一系列为活体生物个体的靶向微束辐射而开发的芯片上固定方法 秀丽隐杆线虫值得注意的是，我们先前开发的用于固定化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片的处理方法 秀丽隐杆线虫 无需麻醉即可对个体进行操作的详细说明如下。这种芯片被称为蠕虫片，具有弹性，可使微流控通道得以扩展，其弹性特性可轻柔地包裹动物。此外，由于聚二甲基硅氧烷（PDMS）具有自吸附能力，只需在蠕虫片表面覆盖一层薄盖膜，即可将动物密封于通道内，而无需将动物推入通道进行封闭。通过翻转盖膜，可轻松回收动物。此外，蠕虫片具有保水性能，并允许 秀丽隐杆线虫 可使个体在活体条件下长时间接受显微观察。此外，该片材厚度仅为300 µm，允许重离子（如碳离子）穿透包裹动物的片材，从而实现对离子粒子的检测，并准确测量施加的辐射剂量。由于用于包裹动物的覆盖膜的选择对成功实现长期固定至关重要，我们对多种覆盖膜进行了筛选，并推荐了其中一种适宜的膜材料。作为芯片的应用示例，我们展示了利用线虫片材的微流控通道包裹动物后，对其肌肉活动进行成像观察以及微束辐照的实验。这些实例表明，线虫片材极大地拓展了生物学实验的可能性。

使用超薄、可润湿的PDMS微流控芯片（蠕虫片）可成功固定活跃的C. elegans个体。我们按照方案第3节所述，考察了不同覆盖膜用于密封蠕虫片的适用性。为评估覆盖膜的密封效果，我们分别采用盖玻片（厚度：130–170 µm）、PET膜（厚度：125 µm）和PS膜（厚度：约130 µm）进行芯片内固定后3小时动物运动能力的检测。如图5所示，自由活动3小时的对照组动物与使用PS膜密封在蠕虫片中的动物在运动能力（体弯曲次数）上无显著差异。相比之下，使用盖玻片密封的动物其运动能力显著降低；部分动物出现干燥现象，提示盖玻片排斥液滴，导致密封不严，使动物部分脱水，从而引起运动能力下降。使用PET膜密封的动物运动能力也显著降低；尽管未观察到脱水现象，但动物运动能力呈均匀性下降趋势，提示其较低的氧气透过率（约30 mL/[24 h·m²·MPa]），约为PS膜的1/100，导致动物窒息。这些结果表明，在蠕虫片中封装动物时应使用PS覆盖膜。
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已建立一系列固定方法，可用于对活体秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）个体进行靶向辐照，所用技术基于一种新近开发的具有保水功能的超薄聚二甲基硅氧烷微流控芯片。这种新型芯片内固定方法同样适用于成像观察。本文详细说明了该芯片的处理步骤及应用实例。

使用具有保水功能的超薄聚二甲基硅氧烷微流控芯片固定活体 Caenorhabditis elegans 个体

辐射在生物学应用和离子束育种中被广泛使用，其中微束辐照是一种强有力的方法……

该方案的一个优点是线虫载片易于操作。载片具有防止干燥的特性，使我们能够对活体动物进行微束照射、执行多种行为学检测以及长期观察。该线虫载片中的微流控通道为开放式结构，便于收集动物。这些蠕虫载片也可以重复使用，因此更具经济性。在开发该技术时，我们希望在显微镜下仅用微束照射动物的部分区域，因此我们需要能够固定动物且透明、极薄的芯片。首先，将一张薄而透明的膜片放置在载物台上，用作底部盖膜。使用平头镊子轻轻地将线虫样本置于底部盖膜上。在直径为6厘米的未处理培养皿表面放置至少三滴缓冲液。然后，用铂金丝挑取器从培养板上挑选数条成年秀丽隐杆线虫。将线虫用铂金丝挑取器转移至一滴缓冲液中，使其在缓冲液中游动以去除表面附着的细菌。用另外两滴缓冲液分别清洗线虫，并在另一滴缓冲液中冲洗线虫。接下来，将一滴缓冲液滴加到蠕虫芯片表面。从缓冲液滴中取出洗涤后的动物，并将其转移到蠕虫芯片上的液滴中。使用平头镊子将一张聚苯乙烯盖膜覆盖在蠕虫芯片上，并从芯片一端到另一端轻轻按压通道区域。或者直接将动物放入液滴中，轻轻盖上封膜，使液滴在盖膜与线虫板之间展开，动物位于通道内。使用显微镜在1-2倍放大倍数下观察动物是否移动，以确认其存活状态。记录每只动物的位置，特别注明每只动物所在通道的编号及其在通道内的具体位置。收集并固定动物时，使用平头镊子移除蠕虫板上的覆盖膜，然后向包围动物的微流控通道之一加入10–15微升缓冲液。在体视显微镜下观察动物，直至其开始旋转。随后使用铂金挑针捞取游动的动物，并将其转移至检测用培养板中。将动物按先前所示方法固定后，使用荧光显微镜观察动物体内的荧光斑点。随后通过视频采集技术成像钙离子波的传播，以观察其动态活动。将使用过的线虫样品置于直径六厘米的培养皿中，并在样品上加入约100微升灭菌的超纯水。用戴手套的手指将水涂抹在纸片表面，冲洗掉任何污染物。接着，使用一次性擦拭巾去除虫片上的水分。向培养皿中加入5毫升70%乙醇，并用戴手套的手指将乙醇均匀涂抹在虫片上。最后，待胶片干燥后，将其置于无菌培养皿中并盖上盖子。通过该方案，研究了不同覆盖膜的适用性。对照组动物与使用聚苯乙烯（PS）膜封闭的微流控通道中的动物在运动能力上无显著差异。相比之下，在盖玻片封闭条件下的动物运动能力显著降低。使用 PET 薄膜封闭的动物运动能力也显著下降。在密封微流控通道时，选择盖膜需格外谨慎。通过该方案，我们在芯片固定动物3小时后，利用动物的运动能力检测评估了不同覆盖膜的适用性。采用此技术，我们旨在开发一种仅用于微束辐照的超薄可润湿芯片。然而，这些线虫芯片目前已应用于成像和行为分析，超出了其最初的使用范围。

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