Name: 一种评价金黄色葡萄球菌感染先天免疫反应的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 了解利用LysM-EGFP小鼠实时监测金黄色葡萄球菌皮肤感染先天免疫反应的方法。该技术可同时追踪细菌负荷与中性粒细胞动态，为研究感染机制和治疗策略提供重要工具。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目R01 AI129302（资助S.I.S.）以及加州大学戴维斯分校药理学培训项目：从实验室到临床（NIH T32 GM099608资助L.S.A.）提供支持。加州大学戴维斯分校分子与基因组影像中心（CMGI）提供了卓越的技术支持。

所有小鼠实验均经加州大学戴维斯分校机构动物照护与使用委员会审查和批准，并依照《动物福利法》和《健康研究扩展法》的指南进行。在处理动物时，务必使用无菌手套。
1. 小鼠来源与饲养
<ol>
	<li>如前所述，在 C57BL/6J 遗传背景下培育 LysM-eGFP 小鼠12。通过将 C57BL/6J 背景的 LysM-EGFP 小鼠与 MyD88-/- 小鼠杂交，获得 LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠。</li>
	<li>将小鼠饲养于动物实验设施中。本研究中，动物在手术前于加州大学戴维斯分校以群养方式饲养，手术后则单笼饲养。使用年龄在 10–16 周之间的小鼠。</li>
</ol>
2. 细菌制备与定量
<ol>
	<li>移除生物发光信号 S. aureus 从-80 °C保存处取出目标菌株，置于冰上融化。在5%牛血琼脂平板上划线接种。将划线后的平板置于37 °C湿润培养箱中过夜（16 h）培养。 
	注意：本实验方案中使用了 ALC2906 SH1000 菌株。该菌株含有穿梭质粒 pSK236，其上带有与青霉素结合蛋白 2 启动子融合的 luxABCDE 报告基因盒从 Photorhabdus luminescens18.</li>
	<li>将胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）粉末按每毫升纯水加入0.03 g的比例溶解，混匀后经高压灭菌以灭菌。冷却后，采用无菌操作加入所需的抗生素。本方案中加入终浓度为10 µg/mL的氯霉素。18 在TSB中选择表达含有生物发光luxABCDE盒的pSK236穿梭质粒。</li>
	<li>从平板上挑取3-4个独立的菌落 S. aureus 将菌株接种于含 10 µg/mL 氯霉素的 TSB 培养基中，开始过夜培养。将细菌置于 37 °C 摇床培养箱中孵育过夜（16 h）。</li>
	<li>从过夜培养物中取样，按1:50比例接种于含10 µg/mL氯霉素的TSB培养基中，启动新的细菌培养。在37 °C、200 rpm条件下于恒温振荡摇床中培养。</li>
	<li>分盘后两小时 S. aureus，监测 600 nm 处的光密度（OD600在分光光度计上测量吸光度（OD）。观察 OD 值600 与时间的关系以确定对数中期生长阶段。对于 ALC2906 SH1000 菌株，OD600 0.5 处于对数中期，对应浓度为 1 x 108 CFU/mL图1).</li>
	<li>当OD600 为0.5时，用预冷的DPBS以1:1比例洗涤细菌。在3,000 x g条件下离心细菌10分钟 g 以及 4 °C。小心倾去上清液，加入额外的预冷 DPBS 并充分涡旋。再次以 3,000 x g 离心 10 分钟 g 和 4 °C。</li>
	<li>小心倾去上清液。将细菌沉淀重悬于所需浓度的溶液中。本研究中，收集 3 mL ALC2906 SH1000，重悬于 1.5 mL PBS 中，对应细菌浓度约为 2 x&#160;108 CFU/mL。使用前将细菌置于冰上保存。</li>
	<li>为验证细菌浓度，将100 µL细菌样品用PBS分别稀释1:10,000和1:100,000。取20 µL稀释液接种于琼脂平板上。在37 °C湿润培养箱中培养16 h。通过肉眼观察计数菌落形成单位（CFU），并于次日计算细菌浓度。</li>
</ol>
3. 切除性皮肤伤口制备及接种 S. aureus
<ol>
	<li>向每只小鼠注射 100 µL 浓度为 0.03 mg/mL 的盐酸丁丙诺啡溶液（约 0.2 mg/kg） 通过 腹腔注射&#160;</li>
	<li>注射后20分钟，将2-4只小鼠放入麻醉舱中，以2-3 LPM氧气混合2-4%异氟烷进行麻醉。待小鼠完全麻醉后，逐只转移至连接有2-3 LPM氧气混合2-4%异氟烷的鼻罩装置中。用拇指和食指用力夹捏每只小鼠的后肢足垫，以确认其是否完全麻醉。若小鼠对夹捏无反应，则进行下一步操作。</li>
	<li>用电动剪毛器在小鼠背部剃除一块1英寸×2英寸的区域，并用干净的擦拭纸或纱布清除剪下的毛发。避免使用脱毛乳液，因其可能引起过度炎症。</li>
	<li>先用含10%聚维酮碘的纱布清洁小鼠背部，再用含70%乙醇的纱布擦拭。以螺旋方式从手术区域中心向外周清洁。手术前等待约1分钟，使手术区域完全干燥。</li>
	<li>用两根手指轻轻夹住小鼠背部剃毛区域，将无菌的6 mm打孔活检器在备皮区域中心用力按压。切勿拉紧皮肤。
	<ol>
		<li>旋转皮肤活检穿孔器，在皮肤上形成一个圆形轮廓，确保至少在轮廓的某一处完全穿透皮肤。注意不要切到深部的筋膜或组织。</li>
		<li>使用无菌剪刀和镊子，沿穿刺活检留下的圆形印迹切割表皮和真皮。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. S. aureus 接种
<ol>
	<li>用28 G胰岛素注射器吸取所需浓度的生物发光细菌接种物。本研究中，接种浓度为1 ×&#160;108 CFU/mL（50 µL）。注射体积不得超过100 µL。</li>
	<li>将50 µL接种物注射至小鼠背部伤口中心处筋膜与组织之间的间隙。确保接种物在伤口中心形成气泡，且无明显泄漏或扩散。
	<ol>
		<li>将皮肤向一侧牵拉，持注射器几乎与组织平行，缓慢刺入组织，直至阻力突然降低，表明已穿透筋膜。小心将注射器引导至伤口中心，缓慢注入接种物。随后缓慢将注射器从小鼠体内抽出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对未感染动物的伤口，按上述方法注射相同体积的无菌PBS。</li>
	<li>将动物放回笼中，将笼子置于加热灯下或加热垫上，并在动物从麻醉中恢复期间持续监测。</li>
</ol>
5. 体内生物发光成像与荧光成像
<ol>
	<li>通过仪器软件启动整只动物成像仪。将小鼠置于麻醉舱中，以每分钟2-3升氧气流速通入2-4%异氟烷进行麻醉，并将麻醉气体输送至成像仪内的鼻罩。</li>
	<li>将受伤并感染的小鼠放入成像仪中，调整小鼠位置，使伤口尽可能平展。按照以下序列设置对小鼠进行成像。
	<ol>
		<li>选择生物发光和拍照作为成像模式。曝光时间为1分钟，采用小像素合并模式，光圈F/stop 1（生物发光）和F/stop 8（拍照）。发射滤光片设置为开放。点击采集按钮以记录图像。</li>
		<li>选择荧光和拍照作为成像模式。曝光时间为1秒，采用小像素合并模式，光圈F/stop 1（荧光）和F/stop 8（拍照），激发波长为465/30 nm，发射波长为520/20 nm，并使用高亮度光源。点击采集按钮以记录图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物放回笼中，并持续监测直至从麻醉中恢复。</li>
	<li>按照上述方法每日对小鼠进行成像。</li>
</ol>
6. 图像分析
<ol>
	<li>打开待量化的图像。</li>
	<li>在图像中每只小鼠的整个伤口区域（包括周围皮肤）上放置一个较大的圆形兴趣区域（ROI）。中性粒细胞体内荧光成像（FLI）EGFP信号和体内生物发光成像（BLI） S. aureus 信号在数天后延伸至伤口边缘之外&#160;包含在这些研究中的图2A 和 2B）。点击 测量 ROI 记录每只小鼠的平均通量值，并绘制每个信号的平均通量（p/s）曲线 与 时间。</li>
	<li>如果中性粒细胞的绝对数量或 S. aureus 如果希望在伤口中实现上述效果，请进行以下实验。
	<ol>
		<li>为了将中性粒细胞数量与体内的 FLI EGFP 信号相关联，按上述方法对 C57BL/6J 小鼠造成伤口，并移植一系列骨髓来源的中性粒细胞（5 × 105 至 1 × 107来自 LysM-EGFP 或 LysM-EGFPxMyD88-/- 将供体直接置于不同伤口上方。按上述方法成像，并将体内FLI EGFP信号与已知数量的中性粒细胞进行关联。</li>
		<li>用于关联 S. aureus 将菌落形成单位（CFU）与体内生物发光成像（BLI）信号关联，按上述方法造模并感染小鼠。感染后第1天，记录小鼠体内BLI信号，随后立即处死并冷藏尸体。取下伤口组织，匀浆处理，将细菌稀释液接种于琼脂平板，过夜培养。次日计数菌落，确定每处伤口的CFU。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在伤口边缘拟合一个圆形感兴趣区域（ROI）来测量伤口愈合情况，并测量伤口面积（cm2) 并绘制相对于基线的分数变化图 vs.&#160;时间图 2C).</li>
</ol>
7. 统计学
注意：所有数据均以均值 ± 标准误表示。p &#60; 0.05 被认为具有统计学显著性
<ol>
	<li>使用 Holm-Sidak 法（alpha = 0.05）分析单日两个组别之间的差异，对每个时间点进行独立分析，不假设标准差一致。</li>
	<li>采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验，比较同一天多个组别之间的差异。实验组间的生存率差异采用 Mantel-Cox 法进行分析。</li>
</ol>

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</ol>

Lloyd S. Miller 已获得 MedImmune、Pfizer、Regeneron 和 Chan Soon-Shiong Nanthealth 基金会的资助，以及来自 Noveome Biotherapeutics 和 Chan Soon-Shiong Nanthealth 基金会的咨询费，这些资助和费用与本文报道的研究无关。其他作者无任何利益冲突需要披露。

S. aureus 感染模型利用生物发光的 S. aureus 在荧光中性粒细胞报告小鼠体内感染，并结合全动物活体光学成像的先进技术，推动了我们对感染过程中先天免疫应答的认识。先前使用 LysM-EGFP 小鼠的研究表明，在感染最初 24 小时内，多达 1 × 107 个中性粒细胞会被募集至 S. aureus 感染的伤口14，且募集至伤口的中性粒细胞在应对 S. aureus 感染伤口时，其半衰期从 1.5 天延长至 5 天22。小鼠为对抗感染而采取的一种生存策略是将造血干细胞和祖细胞（HSPC）从骨髓转运至感染伤口，在伤口局部以 TLR2/MyD88/PGE2 依赖的方式扩增为具有杀菌功能的 EGFP+ 中性粒细胞21。此外，髓外粒细胞生成可为中性粒细胞提供关键来源，从而挽救 MyD88-/- 小鼠免于 S. aureus</...

Staphylococcus aureus （S. aureus）是美国皮肤和软组织感染（SSTIs）的主要致病菌1。过去二十年来，耐甲氧西林S. aureus（MRSA）感染的发生率持续上升2，这推动了对细菌持续感染机制的研究以及新型治疗策略的探索。目前MRSA感染的标准治疗方案是全身性抗生素治疗，但MRSA对抗生素的耐药性随时间不断增强3，且这些药物可能破坏宿主有益的微生物组，导致不良健康影响，尤其在儿童中更为显著4。已有多个临床前研究探索了治疗MRSA感染的替代策略5，但由于致病因子的出现可抑制宿主免疫应答，这些方法在向临床转化过程中面临挑战6。为了深入解析驱动S. aureus皮肤和软组织感染的宿主-病原体相互作用动态，我们结合了对伤口床中募集的中性粒细胞数量的无创、纵向检测，以及对细菌载量和伤口面积的动力学测量。
中性粒细胞是人体内数量最多的循环白细胞，也是细菌感染的首要应答细胞7。由于中性粒细胞具有杀菌机制，包括产生活性氧、蛋白酶、抗菌肽，以及吞噬作用和中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap）形成等功能性反应，因此在宿主抵抗S. aureus感染的有效免疫应答中起着必要作用8,9。患有中性粒细胞功能遗传缺陷的人类患者，如慢性肉芽肿病和Chediak-Higashi综合征，对S. aureus感染的易感性显著增加。此外，中性粒细胞数量存在遗传性（如先天性中性粒细胞减少症）或获得性（如化疗患者中常见的中性粒细胞减少症）缺陷的患者，也极易感染S. aureus10。鉴于中性粒细胞在清除S. aureus感染中的重要作用，增强其免疫功能或调节S. aureus病灶内的中性粒细胞数量，可能成为治疗该类感染的有效策略。
在过去十年中，已开发出带有荧光中性粒细胞报告基因的小鼠，用于研究中性粒细胞的迁移过程11,12。将中性粒细胞报告基因小鼠与整体动物成像技术相结合，可实现对组织和器官中中性粒细胞的时空动态分析。当与发光的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株联合使用时，能够在细菌毒力因子直接影响或间接干扰受累组织中中性粒细胞数量的背景下，追踪中性粒细胞的聚集情况，并关联S. aureus的丰度与持续存在状态13,14,15,16。
小鼠对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的毒力和免疫逃逸机制的易感性低于人类。因此，野生型小鼠可能不是研究特定治疗手段对慢性金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染疗效的理想动物模型。MyD88缺陷型小鼠（即MyD88-/-小鼠）是一种免疫功能低下的小鼠品系，缺乏功能性白细胞介素-1受体（IL-1R）和Toll样受体（TLR）信号通路，其对金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染的易感性高于野生型小鼠17，且中性粒细胞向皮肤金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染部位的迁移能力受损18。在MyD88-/-小鼠中构建携带荧光中性粒细胞报告基因的小鼠品系，为研究治疗金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染的疗法疗效提供了替代模型，相较于现有的中性粒细胞报告小鼠具有优势。
在本实验方案中，我们对免疫功能低下的 LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠中的 S. aureus 感染进行了表征，并将其感染的时间进程及清除情况与 LysM-EGFP 小鼠进行了比较。LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠会发展为无法清除的慢性感染，其中 75% 在感染后 8 天内死亡。在感染的炎症阶段前 72 小时内，中性粒细胞的初始募集出现显著缺陷，且在感染后期募集的中性粒细胞数量减少了 50%。LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠感染易感性的增加，使其成为一种严格的临床前模型，可用于评估靶向 S. aureus 感染的新治疗技术的疗效，相较于使用野生型小鼠的现有模型，尤其适用于旨在增强针对感染的先天免疫应答的技术。

<table><tbody><tr><td>14 mL 聚丙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>6 mm 一次性活检穿孔器</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>生物发光 &lt;em&gt;S. aureus&lt;/em&gt;</td><td>Lloyd Miller，约翰斯·霍普金斯大学&amp;nbsp;</td><td>ALC 2906 SH1000</td><td></td></tr><tr><td>5% 牛血琼脂，Hardy Diagnostics</td><td>VWR</td><td>10118-938</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡注射液</td><td>西方医疗用品公司</td><td>7292</td><td>0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素（结晶粉末）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>329461</td><td>0.35 mm（28 G）× 12.7 mm（1/2″）</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum 活体成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 软件 &amp;ndash; IVIS Spectrum 系列</td><td>Perkin Elmer</td><td>128113</td><td></td></tr><tr><td>LysM-eGFP 小鼠</td><td>Thomas Graff 阿尔伯特·爱因斯坦医学院，纽约&amp;nbsp;</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>微量分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>MyD88基因敲除小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>009088</td><td></td></tr><tr><td>无纺布海绵</td><td>AMD- Ritmed 公司</td><td>A2101-CH</td><td>5 cm × 5 cm</td></tr><tr><td>聚维酮碘 10% 溶液</td><td>Aplicare</td><td>697731</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>GraphPad Software</td><td>许可&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于评估对staphylococcus aureus感染先天免疫反应的小鼠模型

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

金黄色葡萄球菌 (S. aureus)&#160;感染，包括耐甲氧西林菌株，给医疗系统带来了巨大负担。其发生率 S. aureus 感染率逐年上升，因此需要对其开展进一步的研究&#160;致病性。传染病的动物模型有助于加深我们对宿主-病原体相互作用的理解，并推动有效治疗手段的开发。中性粒细胞在控制先天免疫反应中发挥主要作用 S. aureus 通过形成脓肿来隔离感染并促进细菌清除；浸润的中性粒细胞数量 S. aureus 皮肤感染通常与疾病结局相关。将LysM-EGFP小鼠（其溶菌酶M（LysM）启动子区域插入了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，主要在中性粒细胞中表达）与 活体全动物荧光成像（FLI）提供&#160;一种非侵入性、纵向量化中性粒细胞迁移至受损皮肤的方法。当与生物发光技术结合时 S. aureus 通过菌株和连续的活体全动物生物发光成像（BLI），可在麻醉小鼠中从感染开始至恢复或死亡的整个过程中，纵向监测感染部位的中性粒细胞募集动态以及体内细菌负荷。小鼠对多种由病原菌产生的毒力因子具有更强的抵抗力。 S. aureus 有助于在人体内实现有效定植和感染。免疫缺陷小鼠为研究持续性感染提供了更为敏感的动物模型 S. aureus 感染以及治疗手段增强先天免疫反应的能力。在此，我们表征了LysM-EGFP小鼠与MyD88缺陷型小鼠杂交后所得后代（LysM-EGFP×MyD88）的免疫反应情况。-/- 小鼠）以及野生型 LysM-EGFP 小鼠，以开展研究 S. aureus 皮肤伤口感染。通过体内荧光成像（FLI）多光谱同步检测中性粒细胞募集动态，结合体内生物发光成像（BLI）检测细菌负荷，并对伤口愈合过程进行长期、无创的纵向监测。

LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠对 S. aureus 感染的易感性高于 LysM-EGFP 小鼠
该菌株的 S. aureus 本研究中使用，ALC290618, 使用含有质粒构建 lux 可产生生物发光信号的构建体，用于检测活的且具有活跃代谢活性的细菌。将其接种至小鼠体内后，可利用活体生物发光成像（BLI）技术对感染伤口内的细菌负荷进行纵向监测。LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠和LysM-EGFP小鼠经伤口感染，接种1 x 107 菌落形成单位（CFU）的 S. aureus 在伤口中比较它们的易感性 S. aureus 感染。LysM-EGFP×MyD88-/- 小鼠比LysM-EGFP小鼠更...

本文描述了一种实时检测小鼠皮肤损伤及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染所引发的先天免疫反应的方法。通过比较携带荧光中性粒细胞的LysM-EGFP小鼠与LysM-EGFP杂交免疫缺陷小鼠品系，我们加深了对感染机制的理解，并推动了抗感染策略的开发。

一种用于评估对Staphylococcus aureus感染先天免疫反应的小鼠模型

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）感染，包括耐甲氧西林菌株的感染，给医疗系统带来了巨大负担。其发病率……

能够同时监测细菌负荷和中性粒细胞反应的技术，可为金黄色葡萄球菌持续感染的机制及治疗策略的有效性提供深入见解。该技术的主要优势在于，可在感染全过程对活体宿主中的多个参数进行纵向测量。明确伤口在小鼠背部的定位位置、皮肤组织的切除方法以及如何用金黄色葡萄球菌接种伤口至关重要。首先将感兴趣的生物发光金黄色葡萄球菌菌株从-80 °C保存条件下取出，在冰上解冻。随后在5%牛血琼脂平板上划线接种，并于37 °C过夜培养。次日早晨，从金黄色葡萄球菌平板中挑取三至四个单菌落，接种于添加了每毫升10微克氯霉素的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，在37摄氏度下振荡培养过夜。次日早晨，将120微升培养物样品加入6毫升TSB中进行稀释。加入终浓度为每毫升10微克的氯霉素，在37摄氏度、每分钟200转的条件下孵育2小时。当600纳米处的光密度值达到0.5时，将3毫升细菌悬液转移至10毫升预冷的DPBS中。小心倾去上清液后，向菌体沉淀中加入更多预冷的DPBS，并充分涡旋重悬细菌。第二次离心后，将细菌沉淀重悬于1.5毫升预冷的PBS中。为测定细菌浓度，取100微升细菌悬液，用新鲜PBS依次进行1×10⁴和1×10⁵倍的系列稀释，并将每种稀释液各20微升涂布于单独的琼脂平板上。在37摄氏度下孵育过夜后，通过肉眼观察计数菌落形成单位的数量，以计算前一天的细菌浓度。对于受体动物的皮肤切除伤口操作，先确认小鼠对脚趾夹捏无反应，然后剃除小鼠背部约1英寸×2英寸区域的毛发。轻轻擦拭以去除任何散落的毛发。使用10%聚维酮碘和70%乙醇浸湿的纱布，依次对暴露的皮肤进行消毒，从手术区域中心向外呈螺旋状擦拭。待皮肤干燥约一分钟后，在已准备好的手术区域中心用力按压一个无菌的6毫米活检打孔器。旋转穿刺活检工具，在皮肤上形成一个环形切口，完全切透皮肤组织，并至少切断环形边缘的一处。注意不要切到下方的筋膜或深层组织。然后使用无菌剪刀和镊子，沿着穿刺活检所形成的环形印记，剪开表皮和真皮层。对于金黄色葡萄球菌接种，使用28号胰岛素注射器吸取50 µL制备好的生物发光细菌接种物。用手指将受伤动物的真皮层向一侧牵拉。将注射器几乎与组织平行持握，缓慢插入组织中，直至感觉到阻力突然降低。提示刺入筋膜。将针头置于伤口中心，缓慢注入全部接种物。确认接种物在伤口中心形成一个气泡，且渗漏或扩散最少。缓慢将注射器从动物体内取出，然后将其放回带有加热和监测设备的笼子中，直至完全恢复。在造成伤口并感染后，以及实验期间每天，将麻醉的小鼠置于生物发光和荧光成像仪中，使伤口尽可能平展。在成像软件中，选择生物发光和拍照作为成像模式。曝光时间应预设为一分钟，发光模式下使用小像素合并（binning）、光圈值为1，拍照模式下光圈值为8，发射滤光片设为开放状态。然后点击采集，以记录图像。进行活体荧光成像时，选择荧光和拍照作为成像模式。荧光成像的曝光时间应预设为1秒，小 binning 模式，F/Stop 为1，激发波长和发射波长分别为465 ± 15 纳米和520 ± 10 纳米；拍照模式的F/Stop为8，均使用高灯强度。然后点击“acquire”以记录图像。获取两组图像后，将动物放回笼中，并进行监测，直至其完全恢复。进行图像分析时，在合适的图像分析软件程序中打开待定量的图像，并将默认的圆形感兴趣区域覆盖整个伤口区域，包括周围皮肤。点击测量感兴趣区域，并记录伤口的平均通量值，以便绘制每个信号的平均通量随时间变化的曲线。为了测量伤口愈合情况，将一个圆形感兴趣区域拟合到伤口边缘，并测量伤口面积（单位：平方厘米），以便绘制相对于基线的伤口面积分数变化随时间的变化曲线。在此代表性实验中，条件性表达EGFP的髓系分化初级反应88（MyD88）基因敲除小鼠相较于非条件性表达EGFP的小鼠，对金黄色葡萄球菌接种表现出更高的易感性，在感染后的前八天内观察到80%的死亡率。两种小鼠在感染后体重均立即下降了约5%。然而，条件性表达EGFP的小鼠在第2天即恢复至原始体重，而MyD88小鼠则未恢复。在存在金黄色葡萄球菌感染的情况下，两种品系小鼠的伤口闭合情况没有差异。然而，与条件性表达EGFP的小鼠相比，无菌处理的MyD88基因敲除小鼠在伤口愈合方面存在显著缺陷。整体动物成像显示，MyD88基因敲除小鼠伤口处的生物发光信号更强，表明其细菌负荷更高，而条件性表达EGFP的小鼠则相对较低。与条件性表达EGFP的动物相比，MyD88基因敲除动物未感染伤口处初始中性粒细胞迁移减少了40%。在伤口形成后立即引入1 × 10⁷个菌落形成单位的金黄色葡萄球菌时，与条件性表达EGFP的动物相比，基因敲除动物的中性粒细胞迁移显著减弱。在接种细菌前，务必确保注射器内无气泡，并且针头准确地位于伤口中央。在实验终点可采集动物组织，以检测目标蛋白的表达以及细菌从伤口的播散情况。金黄色葡萄球菌对人类具有传染性，因此在处理该细菌时应穿戴个人防护装备，并在操作含有病原体的注射器时格外小心。该技术已帮助探索用于金黄色葡萄球菌感染的生物治疗方法，这些方法可增强宿主对感染的先天免疫反应。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一种评价金黄色葡萄球菌感染先天免疫反应的小鼠模型

小鼠皮肤和软组织感染模型用于评估耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的毒力功能及宿主免疫应答。本文介绍了一种用于皮肤和软组织感染的皮下感染模型。...

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的皮下感染

来源： Zhang, C., 等，细胞内感染模型的建立与评估 Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)该视频展示了分离含有金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

评估小鼠模型中细胞内细菌的持续存在与抗生素耐药性

监测小鼠感染模型中中性粒细胞募集动态及细菌负荷

本视频演示了一种建立小鼠皮肤伤口感染模型的技术。通过将基因改造的生物发光金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

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本视频演示了通过注射髓鞘来源的多肽并联合佐剂以激活自身反应性T细胞来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的方法。这些T细胞会迁移至脑部。同时给予百日咳毒素以增加血脑屏障的通透性，使这些T细胞及其他免疫细胞得以进入脑组织。这些免疫细胞引发脱髓鞘，导致神经传导受损，从而诱发EAE。...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

动物模型在阐明宿主和病原体特异性机制以促进慢性炎症发展方面已被证明是不可或缺的工具。本文描述了一种利用人类病原体牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas...

一种用于研究病原体诱导局部及全身慢性炎症的小鼠模型

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Staphylococcus aureus（S. aureus）具有在体内扩散的能力，可导致持续性和反复性感染。为了更好地理解这些过程，本研究建立了一种S.

细胞内感染模型的建立与评估：针对Staphylococcus aureus

本实验方案描述了一种采用皮下背部植入法的小鼠模型，用于研究植入物相关感染，可对病理生理机制进行系统性分析，并有助于建立诊断标准及开发靶向治疗策略。...

小鼠植入物相关感染的动物模型

大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）实验性心内膜炎模型

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一种用于评估对Staphylococcus aureus感染先天免疫反应的小鼠模型

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