一种用于评估对Staphylococcus aureus感染先天免疫反应的小鼠模型

能够同时监测细菌负荷和中性粒细胞反应的技术，可为金黄色葡萄球菌持续感染的机制及治疗策略的有效性提供深入见解。该技术的主要优势在于，可在感染全过程对活体宿主中的多个参数进行纵向测量。明确伤口在小鼠背部的定位位置、皮肤组织的切除方法以及如何用金黄色葡萄球菌接种伤口至关重要。

首先将感兴趣的生物发光金黄色葡萄球菌菌株从-80 °C保存条件下取出，在冰上解冻。随后在5%牛血琼脂平板上划线接种，并于37 °C过夜培养。

次日早晨，从金黄色葡萄球菌平板中挑取三至四个单菌落，接种于添加了每毫升10微克氯霉素的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，在37摄氏度下振荡培养过夜。次日早晨，将120微升培养物样品加入6毫升TSB中进行稀释。

加入终浓度为每毫升10微克的氯霉素，在37摄氏度、每分钟200转的条件下孵育2小时。当600纳米处的光密度值达到0.5时，将3毫升细菌悬液转移至10毫升预冷的DPBS中。小心倾去上清液后，向菌体沉淀中加入更多预冷的DPBS，并充分涡旋重悬细菌。

第二次离心后，将细菌沉淀重悬于1.5毫升预冷的PBS中。为测定细菌浓度，取100微升细菌悬液，用新鲜PBS依次进行1×10⁴和1×10⁵倍的系列稀释，并将每种稀释液各20微升涂布于单独的琼脂平板上。

在37摄氏度下孵育过夜后，通过肉眼观察计数菌落形成单位的数量，以计算前一天的细菌浓度。对于受体动物的皮肤切除伤口操作，先确认小鼠对脚趾夹捏无反应，然后剃除小鼠背部约1英寸×2英寸区域的毛发。轻轻擦拭以去除任何散落的毛发。

使用10%聚维酮碘和70%乙醇浸湿的纱布，依次对暴露的皮肤进行消毒，从手术区域中心向外呈螺旋状擦拭。待皮肤干燥约一分钟后，在已准备好的手术区域中心用力按压一个无菌的6毫米活检打孔器。

旋转穿刺活检工具，在皮肤上形成一个环形切口，完全切透皮肤组织，并至少切断环形边缘的一处。注意不要切到下方的筋膜或深层组织。然后使用无菌剪刀和镊子，沿着穿刺活检所形成的环形印记，剪开表皮和真皮层。

对于金黄色葡萄球菌接种，使用28号胰岛素注射器吸取50 µL制备好的生物发光细菌接种物。用手指将受伤动物的真皮层向一侧牵拉。将注射器几乎与组织平行持握，缓慢插入组织中，直至感觉到阻力突然降低。

提示刺入筋膜。将针头置于伤口中心，缓慢注入全部接种物。确认接种物在伤口中心形成一个气泡，且渗漏或扩散最少。

缓慢将注射器从动物体内取出，然后将其放回带有加热和监测设备的笼子中，直至完全恢复。在造成伤口并感染后，以及实验期间每天，将麻醉的小鼠置于生物发光和荧光成像仪中，使伤口尽可能平展。

在成像软件中，选择生物发光和拍照作为成像模式。曝光时间应预设为一分钟，发光模式下使用小像素合并（binning）、光圈值为1，拍照模式下光圈值为8，发射滤光片设为开放状态。然后点击采集，以记录图像。

进行活体荧光成像时，选择荧光和拍照作为成像模式。荧光成像的曝光时间应预设为1秒，小 binning 模式，F/Stop 为1，激发波长和发射波长分别为465 ± 15 纳米和520 ± 10 纳米；拍照模式的F/Stop为8，均使用高灯强度。然后点击“acquire”以记录图像。

获取两组图像后，将动物放回笼中，并进行监测，直至其完全恢复。进行图像分析时，在合适的图像分析软件程序中打开待定量的图像，并将默认的圆形感兴趣区域覆盖整个伤口区域，包括周围皮肤。点击测量感兴趣区域，并记录伤口的平均通量值，以便绘制每个信号的平均通量随时间变化的曲线。

为了测量伤口愈合情况，将一个圆形感兴趣区域拟合到伤口边缘，并测量伤口面积（单位：平方厘米），以便绘制相对于基线的伤口面积分数变化随时间的变化曲线。在此代表性实验中，条件性表达EGFP的髓系分化初级反应88（MyD88）基因敲除小鼠相较于非条件性表达EGFP的小鼠，对金黄色葡萄球菌接种表现出更高的易感性，在感染后的前八天内观察到80%的死亡率。

两种小鼠在感染后体重均立即下降了约5%。然而，条件性表达EGFP的小鼠在第2天即恢复至原始体重，而MyD88小鼠则未恢复。

在存在金黄色葡萄球菌感染的情况下，两种品系小鼠的伤口闭合情况没有差异。然而，与条件性表达EGFP的小鼠相比，无菌处理的MyD88基因敲除小鼠在伤口愈合方面存在显著缺陷。整体动物成像显示，MyD88基因敲除小鼠伤口处的生物发光信号更强，表明其细菌负荷更高，而条件性表达EGFP的小鼠则相对较低。

与条件性表达EGFP的动物相比，MyD88基因敲除动物未感染伤口处初始中性粒细胞迁移减少了40%。在伤口形成后立即引入1 × 10⁷个菌落形成单位的金黄色葡萄球菌时，与条件性表达EGFP的动物相比，基因敲除动物的中性粒细胞迁移显著减弱。在接种细菌前，务必确保注射器内无气泡，并且针头准确地位于伤口中央。

在实验终点可采集动物组织，以检测目标蛋白的表达以及细菌从伤口的播散情况。金黄色葡萄球菌对人类具有传染性，因此在处理该细菌时应穿戴个人防护装备，并在操作含有病原体的注射器时格外小心。

该技术已帮助探索用于金黄色葡萄球菌感染的生物治疗方法，这些方法可增强宿主对感染的先天免疫反应。