一种改进的高通量呼吸道合胞病毒（RSV）微量中和实验

迫切需要一种准确且高通量的方法来检测呼吸道合胞病毒（RSV）中和抗体，因为中和抗体是抵抗RSV感染的重要保护性标志物。该方法具有高度可重复性，参考抗血清的批间差异小于10%。我们相信，该检测方法可在全球众多实验室以相对较低的成本快速建立。本文介绍了一种基于成像的微中和检测法，已用于RSV A亚群的检测，也可适用于RSV B亚群及不同类型的样本。

演示该实验操作的是MCRI研究团队成员Reuben Tse。在第一天接种培养板时，首先将A549细胞重悬于DMEM培养基中，培养基中需含有10%胎牛血清（FCS）和1,000单位的青霉素-链霉素混合液，细胞浓度为每毫升400,000个细胞。随后，在96孔平底无菌培养板中每孔加入100微升细胞悬液，使每孔接种40,000个A549细胞。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育过夜。第二天进行血清稀释时，首先将人呼吸道合胞病毒参考血清和待测血清样本在室温下解冻，然后将其置于56摄氏度水浴中加热并活化30分钟。

接下来，将1.5微升参考血清加入含青霉素-链霉素混合液的无FCS DMEM培养基中，定容至150微升，配制出1:100稀释度的参考血清溶液，并确保总体积超过110微升。用移液器将该稀释液110微升加入96孔U型底无菌板的A12孔中。为在板内进行1:2倍比连续稀释，首先向B12至H12孔各加入55微升含青霉素-链霉素混合液的无FCS DMEM培养基。

然后使用新的吸头将55微升液体从A12孔转移至B12孔。上下吹打五次以混匀溶液，并依次继续操作至H12孔。从H12孔中吸出多余的55微升溶液。

接下来，将血清待测样本进行1:100稀释，并向96孔无菌板的相应孔A1至A9以及E1至E9中各加入110微升该稀释液。然后向第1至第9列的各孔中加入55微升含青霉素-链霉素混合液的无FCS DMEM培养基。按照前述方法，从A行至D行以及E行至H行进行1:2倍比系列稀释。

向第10列和第11列的孔中加入55微升不含FCS的含青霉素-链霉素混合物的DMEM培养基。为制备病毒原液，首先将一管冷冻保存的RSV置于37摄氏度水浴中快速解冻，然后将管子置于冰上。接着，将病毒加入含有青霉素-链霉素混合物的DMEM培养基中，每孔约200 PFU，配制成总共55毫升的溶液，用于100个孔。

为制备病毒血清混合物，首先将55 µL稀释后的病毒加入第1至第9列的所有孔中，以及第10列和第11列中E至H行的所有孔中。然后将55 µL含青霉素-链霉素混合物的无FCS DMEM培养基加入第10列和第11列中A至D行的所有孔中，并将培养板置于37°C、含5% CO₂的环境中孵育1小时。在用呼吸道合胞病毒（RSV）接种A549细胞之前，需在光学显微镜下检查细胞培养板，以确认A549细胞单层达到80%融合度。

然后轻轻倒置培养板以弃去培养基，并将培养板在无菌吸水纸上轻压以吸去残留液体。每次操作后，用过滤除菌的PBS洗涤。接着根据文稿中提供的培养板模板，向A549细胞培养板的相应孔中每孔加入100 µL病毒-血清混合液，在37°C、5% CO₂条件下孵育1小时。

孵育结束后，使用移液器每孔移除90微升，然后每孔加入100微升含有1×M199、1.5% CMC和2% FCS的青霉素-链霉素混合培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育三天。固定并显色检测板时，首先轻轻倒置感染RSV的A549细胞培养板，弃去含有M199、CMC、2% FCS及青霉素-链霉素混合物的培养基。

然后向每个孔中缓慢加入 200 µL 固定缓冲液。将培养板置于 -20 °C 孵育 20 分钟。随后弃去固定缓冲液，并用吸水纸轻轻吸干。

将培养板倒置放置，静置干燥10分钟。然后用含有0.05%吐温-20的过滤PBS缓冲液配制5%脱脂奶粉封闭液。每孔加入200 µL封闭液，在室温下孵育30分钟。

孵育结束后，轻轻倒置培养板以弃去溶液，并用吸水纸吸干。制备一抗时，将1:500稀释的山羊抗RSV抗体加入封闭液中，每孔加入50微升，37摄氏度孵育1小时。

用过滤的PBS-聚山梨酯洗涤平板三次。接着，将Alexa Fluor驴抗山羊免疫球蛋白G二抗用封闭液按1:5,000比例稀释，每孔加入50 µL，并在37 °C孵育一小时。

用过滤的 PBS-聚山梨酯洗涤平板五次。若使用自动斑点计数仪计数噬斑，首先使用一个未使用的 96 孔培养板，在 FITC 通道中输入计数设置以校准仪器。然后读取细胞板，用铝箔包裹，并在 4°C 下保存。

接下来，检查各孔的图像，排除存在人为假象斑块或细胞单层被破坏的孔。计算无血清对照孔的平均斑块数，并据此确定导致病毒活性抑制50%的50%中和临界值。以血清稀释倍数的倒数作为横坐标，斑块数量作为纵坐标，在半对数坐标图上通过两点间连线进行绘制。

测试血清样本的50%中和滴度为红色，且计数紧邻无血清对照孔50%值的血清稀释度被确定。在来自冈比亚的两个不同成人队列以及墨尔本的健康志愿者中进行的RSVAPRN检测显示，冈比亚成年人的平均中和抗体滴度低于墨尔本成年人。所示的人呼吸道合胞病毒参考血清表现出极低的变异性，其变异系数为6.82%。这种改进的高通量呼吸道合胞病毒空斑减少中和检测方法可轻松在许多实验室中实施，并将支持世界卫生组织在呼吸道合胞病毒中和抗体检测方面的国际标准化努力。

这对于未来评估新型呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗候选物至关重要。