利用卡尔瓦里亚共同培养和教条法测量骨重塑和再造肿瘤-骨微环境
March 14th, 2020
骨外植物的外生培养是骨生理学研究的宝贵工具，是骨改和骨病药物的潜在评价。提交的协议描述了从新生小鼠头骨分离的钙瓦里亚的制备和培养及其应用。
此过程的目的是有一个外体模型，以评估骨重塑，并使用 calvaria 培养物或与癌细胞共同培养肿瘤骨微环境。大多数钙质技术是一种器官培养系统，使用新生儿小鼠的钙质骨来评估骨骼重塑。您可以测试不同分子的治疗潜力，甚至结合癌细胞使用骨肿瘤微环境。
所有这一切在一个简单和简单的测定在短时间内和低成本。该技术的目的是利用小鼠卡路里器官培养的外体模型，利用癌症骨骼微环境评估骨再生的工具。首先，选择一只老鼠小狗，然后把它放在引擎盖下。
我们使用从五到七天大的老鼠幼崽的卡瓦里亚。用注射器拿头，切开皮肤，清除头皮区域，足以解剖钙。确定头骨、下垂、日冕和羔羊的缝合线。
沿着羔羊缝合线做一个笔直的切口，大约在眼睛的水平。切在每一边，从羊皮缝合线到日冕缝合线。在 45 角度下，再进行一次切割，以连接与前部字体的切口进行切割的切口。
定义头骨缝合线、下垂、前冠、冠状体、羔羊类，以保证正确的组织内含和组织学分析，是极其重要的。用细尖钳，取出卡瓦里亚，并把它放在培养皿盖上。用手术刀，沿着下垂缝合线沿着下垂缝合线从后牙线直接切割，穿过日冕缝合线。
获得两个半方面变量。用钳子选取每个卡瓦里亚，并把它们放在一个新的培养皿与PBS。对于培养，将下摆放在24井组织培养板中，含有1毫升培养剂，并在37度下孵育24小时。
我们还可以使用原发性钙质培养物来再现肿瘤骨微环境，用于骨吸收。为此，我们与癌细胞或癌细胞的调节介质共同培养钙。24 小时后，卸下介质并将其替换为包含您要测试的处理效果的介质。
如果你想评估癌细胞和骨相互作用，或重新创建肿瘤骨微环境，将钙质传递到低细胞附着板，以避免癌细胞附着在板上。对癌细胞进行分析，数一数，并小心地将它们放在半膜体的顶部。您也可以使用来自癌细胞的条件介质，并用它来孵化下摆。
在37度下孵育6至7天，二氧化碳占5%。第三天，更换介质，继续孵化。在共培养中使用的细胞数量取决于癌症细胞线。
首先，您需要优化在一个单元格中诱导响应所需的单元格数。培养后，卡瓦里亚通过固定、脱钙和石蜡嵌入的过程。此外，组织被分切在微原子中，染色，并进行组织形态分析。
包含卡瓦里亚可能比较棘手。为确保组织在内含过程中受到保护，您可以将组织放在海绵之间，或使用纸巾或其他吸水纸，然后再将其放入盒式磁带中。对于组织加工，用纸巾包装下半膜。
然后，将其放入嵌入盒中，并在正式状态的中性缓冲区中固定，在四度下 24 小时。要对卡瓦里亚进行脱钙，请将盒式磁带放入 10%EDTA 中，在四度下 48 小时。在自动组织处理器中使用半圆锥形处理组织盒。
遵循常规的一天旋转周期，然后，包括在石蜡中。对于分切，用显微原子切割四个微分部分，将截面安装到玻璃显微镜幻灯片上，用赤氧树脂素、eosin进行染色。组织学分析用于对骨骼表面和骨骼重塑区域进行定量分析。
使用成像软件对7天中钙的影像进行了分析。对于定量评估，首先，定义分析区域。查看 telopa 上的部分，其中四个 X 可以确定方向和缝合线。
定义日冕缝合线，并识别一侧的长骨表面，然后识别另一侧的短面。在40X放大倍率下，识别日冕缝合线，沿着长表面将两到三个光场移离缝合线。捕获此区域的图像以进行分析。
您可以使用图像软件来分析骨骼的结构完整性。可以对半角体厚度和骨骼面积进行定量组织形态分析。正确的 calvaria 分析取决于良好的嵌入和正确的方向，以取得一致的组织学结果。
确保每个实验条件至少使用三个卡路里。在这里，我们可以看到骨骼的结构。在橙色中，观察到骨骼。
我们还可以看到周分、骨质疏松、内分泌和骨骼其他部位的存在。在我们的案例中，我们使用胰岛素来增加骨骼重塑。与控件相比，我们可以看到骨骼面积显著增加。
在这里，我们可以看到MDA-MB-231细胞系对模型卡尔瓦里亚的影响。与控制相比，我们可以看到癌细胞的存在会诱发刺激骨骼破坏的骨解因子。我们使用 calvaria 模型测量骨再生和癌细胞骨相互作用，通过与癌细胞和组织学的共培养。
我们还通过定量实时 PCR 验证数据。这种外体模型具有许多优点，如三维组织和骨骼的细胞多样性得到保存，可以控制实验条件。此外，模型很简单，可以在短时间内看到结果，而且成本低。
它可以与其他技术相结合，如定量实时PCR，显微镜和微型CT。
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概述
本文介绍了一种新生小鼠颅骨外体培养的协议，旨在研究骨骼生理学和评估药物对骨重塑的影响。该技术允许重建肿瘤-骨微环境。
关键研究组成部分
科学领域
- 骨骼生理学
- 骨重塑
- 癌症生物学
背景
- 骨组织可以培养以研究生理过程。
- 新生小鼠颅骨作为骨骼研究的模型。
- 与癌细胞共培养可以模拟肿瘤-骨微环境。
- 该方法经济实惠且简单明了。
研究目的
- 在外体模型中评估骨重塑。
- 评估各种分子的治疗潜力。
- 重建骨肿瘤微环境。
使用的方法
- 从新生小鼠中分离颅骨。
- 骨组织外体培养技术。
- 与癌细胞的共培养系统。
- 评估骨再生和药物效果。
主要结果
- 成功培养颅骨以研究骨重塑。
- 能够在受控环境中测试治疗剂。
- 展示了重建肿瘤-骨微环境的能力。
- 该方法被证明是高效且低成本的。
结论
- 外体颅骨培养是骨骼研究的宝贵工具。
- 它促进了对药物对骨骼生理的影响的研究。
- 共培养系统增强了对癌症与骨骼相互作用的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
