利用颅骨共培养与组织形态计量学测量骨重塑并重建肿瘤-骨微环境

本实验的目的是建立一种离体模型，用于评估骨重塑，并通过颅骨培养或与癌细胞共培养来重建肿瘤-骨微环境。目前大多数颅骨培养技术是一种器官培养系统，利用新生小鼠的颅骨骨组织来评估骨重塑过程。您可利用该系统检测多种分子的治疗潜力，或通过与癌细胞共培养来重建骨-肿瘤微环境。

所有这些均可在短时间内通过一种简单、便捷且低成本的检测方法实现。该技术的目的是利用小鼠颅骨器官培养的离体模型，作为评估癌症骨微环境中骨再生的工具。首先，选择一只幼鼠并将其置于超净台中。

我们使用5至7日龄小鼠幼崽的颅骨。用注射器固定头部，剪开皮肤，充分暴露头皮区域以便分离颅骨。辨认颅骨的缝合线，包括矢状缝、冠状缝和人字缝。

沿人字缝做一直线切口，切至眼睛水平位置。在两侧分别从人字缝向冠状缝方向切割。以45度角再做一切口，连接先前切口的末端与前囟切口的末端。

明确定义颅骨缝线（矢状缝、额缝、冠状缝、人字缝）对于确保正确的组织包埋和组织学分析至关重要。使用尖头镊子取下颅盖骨，并将其置于培养皿盖上。用手术刀从后囟处沿矢状缝经冠状缝作一直线切口。

获得两半头盖骨。用镊子分别夹取每一块头盖骨，放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的新培养皿中。进行培养时，将头盖骨半片置于含有1毫升培养基的24孔组织培养板中，在37摄氏度下孵育24小时。

我们还可以利用原代颅骨细胞培养来重建肿瘤-骨微环境，以研究骨吸收。为此，可将颅骨组织与癌细胞共培养，或与癌细胞的条件培养基共同培养。24小时后，移除原培养基，并更换为含有待测处理因素的新培养基。

如果希望评估癌细胞与骨之间的相互作用，或重建肿瘤-骨微环境，可将颅骨瓣转移至低细胞黏附培养板中，以避免癌细胞黏附于培养板表面。用胰蛋白酶消化癌细胞，计数后小心地将其接种于半颅骨瓣的上方。也可使用癌细胞的条件培养基，并用其孵育半颅骨瓣。

在37摄氏度、5% CO2条件下培养六至七天。第三天更换培养基后继续培养。共培养中使用的细胞数量取决于癌细胞系。

首先，需要优化用于诱导反应的细胞数量。培养后，颅骨需经过固定、脱钙和石蜡包埋处理。随后，组织在切片机中切片，进行染色，并开展组织形态计量学分析。

包埋颅骨时可能会比较困难。为确保组织在包埋过程中得到保护，可将组织置于海绵之间，或在放入包埋盒前用滤纸或其他吸水纸包裹。进行组织处理时，用滤纸将半颅骨包裹起来。

然后，将样本放入包埋盒中，在4°C条件下用中性缓冲福尔马林固定24小时。为脱去颅骨的钙质，将包埋盒置于10% EDTA溶液中，在4°C条件下脱钙48小时。使用自动组织处理机对含有半颅骨的组织包埋盒进行组织处理。

按照常规的日间轮转周期进行处理，然后包埋于石蜡中。切片时，使用切片机切出四张显微切片，将切片贴附于玻璃载玻片上，并用苏木精和伊红染色。通过组织学分析对骨表面及骨重塑区域进行定量分析。

使用成像软件分析了第七天颅骨的图像。进行定量评估时，首先定义分析区域。在组织切片上寻找四叉形的顶骨区域，以确定方位和骨缝位置。

定义冠状缝，并识别一侧的长骨表面，然后识别另一侧的短表面。在40倍放大倍数下，找到冠状缝，并沿长骨表面向远离缝线方向移动两到三个视野。拍摄该区域的图像用于分析。

可以使用图像软件分析骨组织的结构完整性。可对颅顶骨半片的厚度和骨面积进行定量组织形态学分析。准确的颅顶骨分析依赖于良好的包埋和正确的取向，以获得一致的组织学结果。

每个实验条件务必使用至少三块颅骨。此处，我们可以观察到骨的结构。橙色部分显示的是骨组织。

我们还可以观察到骨膜、骨细胞、骨内膜以及骨的其他部分。在本实验中，我们使用胰岛素来促进骨重建。与对照组相比，可见骨面积显著增加。

在此，我们可以观察到 MDA-MB-231 细胞系对颅骨模型的影响。与对照组相比，癌细胞的存在会诱导破骨因子的产生，从而促进骨破坏。我们采用颅骨模型，通过将癌细胞与骨组织共培养并结合组织学分析，来评估骨再生及癌细胞与骨之间的相互作用。

我们还通过定量实时 PCR 验证数据。该体外模型具有多种优势，例如骨组织的三维结构和细胞多样性得以保留，且实验条件可控。此外，该模型操作简便，可在较短时间内观察到结果，且成本较低。

并且可与其他技术结合使用，如定量实时 PCR、显微镜和微计算机断层扫描。