生物大分子晶体的完全自主表征及数据采集
March 22nd, 2019
在这里, 我们将介绍如何使用某些同步加速器波束线提供的自动筛选和数据收集选项。科学家将冷冻样品发送到同步加速器, 并对衍射特性进行筛选, 收集和处理数据集, 并在可能的情况下执行结构解决方案--所有这些都无需人工干预。
X射线晶体学是确定蛋白质三D结构信息的主要技术。需要同步加速器光束线才能从蛋白质产生的弱衍切晶体中获取数据。海量线是一条独特的光束线，因为它完全自动化了从生物大分子收集数据的过程。
从样品安装、位置和最终数据收集。这种完全自动化是非常重要的，因为它允许研究人员在实验室里度过他们的时间，而不是在光束线上收集数据。光束线也是智能的，平均而言，可以收集比光束线由人类操作时更好的数据。
要开始此协议，请执行晶体安装，并请求像文本协议中描述的大规模协议上的光束时间。导航到蛋白质晶体学光束线的信息系统，或 ISPyB 网站。选择 MX 实验，使用实验编号和密码登录。
单击货件、添加新信息并提供必要信息。然后单击"保存"。单击添加宗地，并填写请求的信息。
单击"保存"，然后单击"添加容器"。给冰球条形码作为名称，并选择脊柱冰球，再次点击保存。单击容器符号并编辑，并在冰球中填写有关样品的必要信息，如蛋白质名称、首选工作流程和晶体位置。
选择经ESRF安全小组批准的蛋白质。输入唯一的示例名称以标识每个示例。可选地扫描引脚条形码。
要包含的其他信息也是可选的。对于每个单独的示例，输入实验类型。这定义了用于处理每个晶体的自动工作流程。
鉴于 GCSH 晶体是针，请选择 MX 按 P.Next，输入空间组。如果存在，则用于数据收集策略计算，并由可用的自动数据处理管道。输入所需的分辨率。
这定义了晶体到探测器与初始网格扫描、表征和默认数据收集的距离。现在，设置所需的阈值分辨率，以防止从晶体中收集完整的数据集，这些晶体不会扩散到此限制。这可以节省数据存储空间和分析时间。
设置所需的完整性。然后设置所需的多重性。如果样品支持上包含多个晶体，请设置要分析的最大晶体数量。
MX 压压 P 的默认值为 1 或 5。也可以选择适当的光束尺寸。将空间组（如果已知）放入力空间组列中。然后设置晶体的辐射灵敏度。
如果需要，请设置要为完整数据集集合收集的总旋转角度。将所有信息输入系统后，保存值。单击，返回货件，然后按发送件到 ESRF。
打印发货标签并发送样品。用户应使用 ESRF 帐户详细信息安排与快递员一起取件。在实验当天，样品被转移到大规模一大容量露水。
然后，光束线科学家启动数据收集，用户可以远程跟踪。对于每种不同的示例类型，用户会收到一封电子邮件，通知他们数据收集已经开始。可以在线和实时执行所有工作流中的所有步骤。
用户可以通过登录到 ISPyB 来访问此功能。还可以查看和下载结果。对于分析的每个样本，检查 ISPyB 上的自动实验结果。
单击 ID30A1 上所需的实验会话。选择首选的自动处理管道。下载以最高完整性和最高分辨率在正确的空间组中写入的数据。
通过点击最后收集结果，然后下载。ESRF 光束线大规模使用 MX 压波 P 工作流程，以完全自动安装、在 X 射线光束中居中、表征和从一系列人类 GCSH 晶体中收集完整的衍射数据集。对样品进行了安装，并分析了循环以进行扫描。
衍射分析后，在晶体内选择了四个点进行数据收集。通过分子替换进行手动结构测定，经过一个自动化优化循环后，得出了高质量的电子密度图。对于此数据集，自动管道以一点三二焦虑分辨率削减数据。
但是，用户可以决定以较低的分辨率剪切数据。连续电子密度是可见的整个氨基酸链，除了电子组织标签。在区分人类和牛GCSH的四种替代物中，有三种在电子密度中很容易识别。
对于阿斯巴酸以125替代，这不太清楚。由于灵活性，侧链的电子密度仅部分解决。当前获得的模型具有 20 点 4% 的 R 工作值和 23 点 8% 的 R 自由值，可以通过自动和手动模型构建和优化的附加周期进一步优化。
根据您的系统定制需求非常重要。例如，将已观察到的分辨率设置为已知值可以节省时间并确保更好的数据收集。全自动数据收集已经民主化的晶体学，现在即使是小实验室也可以开始著名的项目，当这是可行的之前，只有巨大的人的力量。
概述
本文描述了蛋白质晶体学同步加速器光束线的自动筛选和数据收集过程。该完全自动化系统允许研究人员高效地收集和处理来自低温冷却样品的数据，无需人工干预。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质晶体学
- X射线衍射
- 数据收集自动化
背景
- X射线晶体学对于确定蛋白质结构至关重要。
- 同步加速器光束线对于从弱衍射晶体获得数据至关重要。
- 自动化提高了数据收集的效率和质量。
- Massive one光束线为生物大分子提供了全自动化的工作流程。
研究目的
- 展示同步加速器光束线的自动化数据收集过程。
- 突出蛋白质晶体学中自动化的优势。
- 为研究人员提供详细的协议以供遵循。
使用的方法
- 样品安装和运送到同步加速器。
- 利用ISPyB信息系统进行实验管理。
- 自动化数据收集和处理工作流程。
- 实时监控数据收集和结果分析。
主要结果
- 成功收集到来自人类GCSH晶体的高质量衍射数据。
- 自动处理产生了高分辨率的电子密度图。
- 确定了人类和牛GCSH之间的结构差异。
- 展示了自动化工作流程在晶体学中的有效性。
结论
- 数据收集的自动化使得晶体学更加民主化。
- 较小的实验室现在可以承担以前仅限于大型设施的复杂项目。
- 调整实验参数可以提高数据收集效率。
常见问题
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
