一种针对实体瘤及血液系统癌细胞的嵌合抗原受体T细胞实时效价检测方法
2019年11月12日
我们描述了一种定量实时体外细胞裂解检测系统，用于评估靶向液体和实体肿瘤细胞的嵌合抗原受体T细胞的杀伤效力。该方案可扩展用于评估其他免疫效应细胞以及联合治疗方法。
xCELLigence 实时细胞分析技术可让您在无标记条件下，连续数天定量监测免疫细胞对癌细胞的杀伤作用。该系统能够提供靶向癌细胞杀伤的完整时间过程，支持在较低效应细胞与靶细胞比例下，同时筛选大量构建体、效应细胞类型或联合治疗方法。首先，在150毫升细胞培养皿中加入含DMEM培养基的1.5 × 10⁷个HEK293FT细胞，于37°C、5% CO₂及湿度环境中过夜培养。
第二天早晨，在2.5毫升转染稀释液中加入5微克慢病毒载体质粒DNA和22.5微克慢病毒包装混合物，再加入82.5微升转染试剂，混匀。室温孵育15分钟后，将反应液逐滴加入HEK293FT细胞培养皿中，并将细胞放回培养箱中继续过夜培养。次日早晨，弃去上清液，加入19毫升新鲜DMEM培养基，将细胞再次放回培养箱中过夜培养。
将上清液收集到一个50毫升的锥形管中，在4摄氏度下保存接下来的两天，于第二天早晨通过离心沉淀慢病毒，以去除溶液中的任何细胞或碎片。将含有慢病毒的上清液除约1毫升外全部转移至超清晰离心管中进行超速离心。超速离心后，小心吸除残留的含有病毒的上清液，轻轻加入100微升DMEM至沉淀中，并将离心管置于冰上静置15分钟。
孵育结束后，轻轻混匀溶液，并将慢病毒溶液分装至预冷的无菌离心管中，于负80摄氏度保存。随后根据制造商说明书，通过定量RT-PCR测定慢病毒滴度。用于CAR-T细胞的生成与扩增时，在细胞培养孵箱中，于24孔板的一个孔内，用1毫升CAR-T细胞培养基，加入等数量的CD3/CD28包被微珠，激活一至两乘以十的六次方个外周血单个核细胞，持续24小时。
接下来的两个早晨，将一微升转导增强剂与细胞混合，随后加入慢病毒，感染复数为5比1。每两到三天监测一次T细胞生长情况，根据需要添加新鲜的CAR-T细胞培养基，以维持细胞浓度在每毫升一至两乘以十的六次方个细胞。为了通过流式细胞术检测T细胞的CAR表达，将三乘以十的五次方个CAR转导和非转导T细胞分别转移至三个独立的1.5毫升微量离心管中。
通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于200微升含1%人血清的FACS缓冲液中。将每份细胞样品分装至预冷的5毫升聚苯乙烯FACS管中，每管100微升，置于冰上。5分钟后，向每种细胞类型的其中一管加入1微升生物素标记的羊抗小鼠FAB2片段，向另一管加入2微升PE标记的抗标签抗体，充分混匀。
冰上孵育30分钟后，用三毫升新鲜FACS缓冲液洗涤细胞，离心后弃去上清液。将沉淀物重悬于残留的上清液中，每管加入2 µL APC标记的抗CD3抗体和2 µL 7-AAD。向经抗FAB2抗体染色的试管中加入1 µL PE标记的链霉亲和素，短暂混匀，然后将所有试管置于冰上孵育30分钟。
孵育结束后，根据标准方案通过流式细胞术分析细胞，使用前向散射光与侧向散射光以及CD3与7-AAD表达对T细胞进行设门。对于实时细胞溶解活性检测，向e-板的每孔中加入50至100微升靶细胞培养基，并在细胞分析仪中测量背景阻抗。使用胰蛋白酶从培养板中消化获取靶癌细胞。
用 15 毫升新鲜培养基洗涤细胞并离心。将癌细胞沉淀重悬于 5 毫升新鲜培养基中进行计数，并将细胞密度调整至适当的靶细胞浓度。将细胞加入适量的孔板中，在室温下静置 30 分钟，使细胞均匀沉降到孔底。
平衡期结束后，将培养板放入实时细胞分析仪中，并自动开始每15分钟一次的阻抗测量，持续过夜。可实时监测靶细胞的贴壁和增殖情况。次日早晨，将效应CAR T细胞和对照T细胞分别稀释至适当浓度，然后从电子板（e-plate）的每个孔中移除50至100微升培养液，使每孔终体积为100微升。
接下来，将效应T细胞和对照T细胞以适当的效应细胞与靶细胞比例接种到相应的孔中，每孔加入100 µL培养基。然后将e-plate在室温下平衡30分钟，再将培养板放回细胞分析系统。为评估T细胞介导的靶向癌细胞杀伤效果，需持续监测CAR-T细胞介导的杀伤作用达96小时。
约50%的CAR-T细胞对单链可变区片段抗体呈阳性染色，表明约50%的T细胞表达了CAR。在此代表性实验中，所有组均采用10:1的效应细胞与靶细胞比例。与仅含对照T细胞和Mock CAR-T细胞的组相比，仅含Raji细胞以及经CD22-CAR T细胞处理的Raji细胞组显示出显著的杀伤效应。
在本实验中，只有表达CD47-CAR的T细胞能够有效杀伤胰腺癌细胞。此外，单独CD47-CAR-T细胞产生的阻抗信号仅略高于单独培养基孔中的细胞指数信号，表明悬浮细胞（如CAR-T细胞）本身产生的阻抗信号极小，当CAR-T细胞与靶癌细胞共培养时，其对总体阻抗信号的贡献可忽略不计。值得注意的是，与不含GITR结构域的原始CAR构建体相比，含有GITR共刺激结构域的CAR在增强CAR-T细胞对表皮生长因子受体阳性靶细胞的杀伤能力方面效果更显著。
可根据实验需求，在检测过程中或检测结束后收集 e-plate 孔中的培养基，以分析细胞因子谱。总体而言，xCELLigence 技术提高了评估多种免疫疗法效力的效率，其应用范围涵盖双特异性 T 细胞衔接分子、溶瘤病毒以及联合治疗中的免疫检查点抑制剂。
概述
本文介绍了一种定量实时体外细胞溶解检测系统，旨在评估嵌合抗原受体（CAR）T细胞对液体和实体肿瘤细胞的杀伤效力。该方法可用于评估多种免疫效应细胞及联合治疗方案的效果。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 癌症生物学
- 细胞生物学
背景
- 嵌合抗原受体T细胞经过工程化改造，可靶向特定的癌细胞。
- 对细胞相互作用的实时监测有助于深入了解免疫应答机制。
- 该检测系统可针对多种实验条件进行调整和优化。
- 理解T细胞的有效性对于开发高效的癌症治疗方法至关重要。
研究目的
- 建立一种可靠的检测方法，用于评估CAR T细胞的效力。
- 促进不同免疫效应细胞的筛选。
- 评估联合疗法在癌症治疗中的有效性。
使用的方法
- 利用xCELLigence实时细胞分析系统监测癌细胞杀伤效应。
- 转染HEK293FT细胞以产生用于CAR T细胞制备的慢病毒。
- 采用流式细胞术检测T细胞中CAR的表达。
- 通过实时阻抗测量评估随时间变化的细胞溶解效力。
主要结果
- 观察到CAR T细胞对靶向癌细胞具有显著的杀伤作用。
- 约50%的CAR T细胞表达了CAR，表明转导成功。
- 测试了不同的效应细胞与靶细胞比例以评估其效力。
- 与对照组相比，CD22-CAR T细胞表现出增强的细胞溶解活性。
结论
- 该检测系统可有效量化CAR T细胞的活性。
- 该方法可适用于多种免疫细胞类型及治疗方案。
- 实时监测为优化癌症治疗提供了宝贵的数据支持。
常见问题
行业应用价值
该实时效价检测方法使生物制药团队能够在无标记条件下，定量评估CAR T细胞对血液系统和实体瘤靶点的杀伤效果。通过连续数天提供基于阻抗的肿瘤细胞杀伤动态读数，该方法可支持CAR结构的机制性风险评估，并为早期发现阶段的决策提供依据。该检测方法适用于低效应细胞与靶细胞比例条件，并可进行多重结构并行筛选，从而提高先导分子识别和产品线筛选的通量。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将共刺激结构域（如 GITR）与针对表皮生长因子受体阳性靶点的增强细胞毒性活性相关联，验证治疗假设。
- 操作价值：可在单一工作流程中实现对 CAR 表达及效力的功能性验证，降低靶点结合过程中的不确定性。
- 预测价值：通过在体内研究前识别出具有更优肿瘤杀伤动力学特性的构建体，支持临床前模型的选择。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成可定量的、时间分辨的细胞溶解数据，能够直接比较CAR构建体、效应细胞类型或联合疗法。
- 操作价值：通过无标记、实时阻抗测量标准化效价评估，提高不同团队和实验地点间的可重复性。
- 可扩展性：可在e-plate格式中同时筛选多种条件，支持为后续免疫治疗评估做好检测准备。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过提供共刺激结构域功能的机制性见解，将发现阶段的CAR-T优化与临床前验证相衔接。
- 风险调整型推进：早期识别无效构建体（例如Mock CAR-T对照），减少对低效候选物的投入。
- 疾病相关性应用：在液体肿瘤（Raji）和实体瘤（胰腺癌）模型中均展示了应用价值，支持其在广泛肿瘤学研发管线中的适用性。
流程与工作流整合
该检测方法适用于从发现到临床前研究的连续流程，可在投入资源密集型的体内验证之前，实现CAR-T优化的迭代式设计-测试循环。
- 发现生物学：通过实时功能读数，支持对共刺激信号域（例如 GITR）和抗原-靶标配对的假设验证。
- 筛选：提供标准化的定量效价输出，可在受控的效应细胞与靶细胞比例下对 CAR-T 产品进行并行比较。
- 分析：提供基于阻抗的动力学谱型和终点测量数据，用于阐明构效关系并支持联合疗法的筛选。
- 转化研究：通过突出具有肿瘤特异性活性的构建体（例如胰腺癌中的 CD47-CAR-T），将体外效价指标与临床前决策相衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于评估多种免疫疗法，包括双特异性衔接分子和免疫检查点抑制剂，而不仅限于 CAR-T 细胞。
运营与企业影响
- 科学价值：通过将分子设计（例如 GITR 结构域）与功能性肿瘤杀伤效果相关联，提高对 CAR-T 活性的预测可信度。
- 操作价值：通过无标记、实时的阻抗监测，增强肿瘤免疫学检测的可重复性和标准化水平。
- 战略价值：基于定量的细胞溶解数据，实现 CAR-T 候选分子的早期筛选，从而提升资本使用效率。
- 项目组合影响：通过机制性降低靶点结合与效应功能方面的风险，促进对免疫治疗候选分子进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备慢病毒生产、T细胞转导以及通过流式细胞术进行CAR验证的专业技术。
- 依赖于xCELLigence或兼容的实时细胞分析仪器及e-plate耗材。
- 在比较研究中，效应细胞与靶细胞比例及检测持续时间（如96小时监测）需进行标准化。
- 若应用于原代肿瘤细胞或共培养系统，可能需要优化接种密度和培养基条件。
- 悬浮效应细胞（如CAR-T细胞）产生的阻抗信号极弱，不会干扰基于靶肿瘤细胞贴壁的检测读数。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Encoding Lentivirus Generation
2:29
CAR T Cell Generation and Expansion
3:16
CAR Expression Detection
4:55
Real-Time Cytolysis Potency Assay
6:48
Results: Representative CAR T Cell Target Cell Killing Efficacy as Assessed by RTCA
8:05
Conclusion
