用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

本方案描述了一种利用质谱技术（包括代谢组学、蛋白质组学和脂质组学）以及核磁共振波谱平台，对单个样品进行全面、无偏倚的分子表征的方法。该方法的意义在于，我们可以通过鉴定多种类型的分子，对基因组下游的生物系统进行表征，从而推断出代谢和分解途径。顺序提取技术首先使用水提取生物可利用的极性化合物，随后采用MPLEx方法，从同一样品中进一步提取其他极性化合物或代谢物，以及蛋白质和脂质。

该方法的可视化演示至关重要，因为它指导科研人员在第二次提取步骤中分离三层，并将提取物分配至不同的分析仪器。整合性多组学分析有助于更有效地开展研究，并全面理解复杂的生物系统。该方法可提取多种多样的分子，适用于多种类型的样本。

按照文本方案所述，首先进行样品的采集与制备。使用经乙醇清洗过的不锈钢工具，将每种干燥样品各50毫克分装至各自的2毫升玻璃管中。向每个样品中加入1毫升蒸馏且脱气的水。

然后盖紧小瓶，在摇床上震荡两小时。将样品在15,000 ×g 条件下离心30分钟。随后让溶液在室温下静置20分钟。

将每个样品的上清液倾析并保存。对已进行水提取的残渣采用MPLEx提取法，重复上述提取步骤，但需用-20°C的氯仿-甲醇（4:3）混合液替代蒸馏脱气水。

小心分离两种形成的溶剂层，可通过仔细移除上层液体来实现视觉区分。将下层非极性层在冷冻干燥机中干燥。一旦干燥完成，若在接下来的几天内进行分析，则加入5 µL氯仿和195 µL甲醇。

为了通过直接进样方式提高傅里叶变换离子回旋共振质谱（简称 FTICR-MS）的电喷雾电离效率，将氯仿提取物用甲醇按 1:1 比例稀释，水相提取物用甲醇按 2:1 比例稀释。通过直接注入 100 微升调谐溶液对 FTICR 质谱仪进行校准，该溶液的质量范围约为 100 至 1,300 道尔顿。

将100微升苏万尼河富里酸标准品直接注入电喷雾电离源中。通过设定流速为每分钟3.0微升的注射泵与傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪耦合。将针头电压设置为正4.4千伏。

将质荷比设定为1至100，并将玻璃毛细管温度设为180摄氏度。使用分析软件检查所得谱图，以确认数据质量。随后，通过直接进样将每种提取物各100微升引入电喷雾电离源，经由设定流速为3.0微升每分钟的注射泵连接至FTICR质谱仪。

设置参数与之前相同。根据每个样品或每组样品中碳浓度的差异，调整离子累积时间。每个样品采集144次扫描，对扫描结果进行平均，然后使用同系的CH2系列进行内部校准。

使用浓缩仪干燥提取物，并保留剩余提取物用于后续的气相色谱-质谱、液相色谱-质谱和核磁共振波谱分析。为进行GC-MS分析，首先按照文本方案中的说明制备空白对照样品。为保护羟基，向每个样品（包括甲醇提取物、水提取物、空白样品和FAME校准样品）中加入20微升含30毫克/毫升甲氧胺盐酸盐的Paradyne溶液。

用瓶盖密封小瓶。将提取物涡旋振荡20秒，然后超声处理60秒。在37°C条件下，以100 × g离心力离心提取物90分钟。

向每个样品中加入80微升含1%三甲基氯硅烷的MSTFA。将提取物涡旋振荡并超声处理后，再次在37摄氏度下以100倍重力离心30分钟。待提取物冷却至室温后，转移至GC-MS自动进样瓶中。

按照文本方案中所述步骤进行气相色谱-质谱分析及数据处理。为准备液态核磁共振分析，将剩余水提取物用5毫摩尔DSS内标稀释10%。将混合物转移至高质量、外径3毫米的硼硅酸盐玻璃核磁共振管中。

按照文本方案中所述进行核磁共振（NMR）分析和数据处理。为进行液相色谱-质谱（LC-MS）脂质组学分析，将每份提取物各取10 µL注入超高效液相色谱系统，该系统通过反相带电表面杂化柱与Orbitrap质谱仪联用。根据文本方案中列出的条件，设置34分钟梯度洗脱程序，流速为250 µL/min。

采用负离子和正离子化模式，并结合高能量碰撞解离和碰撞诱导解离。为进行蛋白质组学分析，首先根据文中所述MPLEx方案，提取剩余甲醇相中的蛋白质。在美国明尼苏达州的“变化环境下的云杉和泥炭地响应”（Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments，简称SPRUCE）试验点S1沼泽中，对泥炭进行了随深度变化的比较分析。

蛋白质组学分析共鉴定出 3,312 种酶。对酶活性随深度变化的分析显示，在 SPRUCE 泥炭藓沼泽中，酶的数量在 15 厘米至 45 厘米深度之间急剧下降。为了展示不同采样点在代谢物和酶活性上的差异，将 SPRUCE 的结果与瑞典北部永久冻土泥炭藓沼泽和贫营养沼泽的结果进行了比较。

通过傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）、核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）分析的综合结果，在所有SPRUCE泥炭样品中总共鉴定出67,040种代谢物。此处显示的是利用不同技术在不同深度所鉴定出的各类化合物的相对比例。氨基酸和糖类的含量随深度增加而减少，但脂类未表现出这一趋势。

通过将所有分析中鉴定出的代谢物与KEGG数据库进行交叉验证，确定这些鉴定出的化合物参与了三羧酸循环、糖酵解和糖代谢等常见代谢通路。在整个实验过程中，必须注意潜在的污染源。从样品采集到分析的各个环节，样品均不应接触含塑化剂的塑料制品，以免对离子化产生不利影响。

提取过程中使用的许多溶剂具有危险性或易燃性。操作时应始终穿戴适当的个人防护装备，以避免皮肤和眼睛接触，并防止样品污染。