Name: 用于表征复杂天然有机物混合物的单吞吐量互补高分辨率分析技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习使用质谱与核磁共振波谱技术对单一复杂天然有机物样本进行全面的分子表征。该方法结合代谢组学、蛋白质组学和脂质组学分析，可推断代谢与分解途径，适用于多种生态系统样本。

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我们感谢 J.P. Chanton、J.E. Kostka 和 M.M. Kolton 在采集泥炭样品过程中提供的帮助。本研究的部分工作在美国能源部科学办公室下属的环境分子科学实验室（Environmental Molecular Sciences Laboratory）完成，该实验室由生物与环境研究办公室资助，属于科学办公室用户设施。太平洋西北国家实验室（PNNL）由巴特尔公司（Battelle）根据合同号 DE-AC05-76RL01830 为美国能源部运营。本研究得到了美国能源部科学办公室和生物与环境研究办公室的资助（项目编号：DE-AC05-00OR22725、DE-SC0004632、DESC0010580、DE-SC0012088 和 DE-SC0014416）。

1. 从土壤、沉积物或泥炭中连续提取有机质
<ol>
	<li>采集土壤、沉积物或泥炭 通过 钻取岩芯并根据待检验的假设对岩芯进行分割（例如，深度）。将样品储存于聚四氟乙烯涂层容器中，并于 -80 ℃ 冷冻保存 &#176;分析前于 C 保存。 
	注意：本方案需要约 25 mg 碳。对于泥炭（通常含碳 45%），需使用 50 mg 干燥泥炭。对于有机质含量较低的样品（如矿质土或林地高地土壤），根据碳含量不同，可能需要更多样品量（最多达 5 g）。由于有机溶剂提取会将任何聚乙二醇（PEG）带入提取物中，从而在步骤 2.4 中对离子化产生不利影响，因此在样品采集、储存和提取过程中的任何环节都应避免样品接触塑料材料。</li>
	<li>当准备分析样品时，将样品冷冻干燥至恒重，然后使用不锈钢研磨球在高速球磨机中研磨样品，以实现均质化并打破任何聚集体。 
	注意：本实验步骤可在此处暂停，材料可于 -80 ℃ 保存 &#176;C.</li>
	<li>使用经乙醇清洗过的不锈钢工具，将每份干燥样品各50 mg分装至各自的2 mL玻璃小瓶中。这些样品将依次使用一系列溶剂进行提取，以从每个样品中连续提取极性逐渐降低的代谢物。加入1 mL蒸馏并脱气的水（H₂O），涡旋振荡10分钟，然后在4 °C、15,000 × g条件下离心15分钟。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，保存于-80 °C，用于后续的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。向剩余的沉淀中加入1 mL甲醇（MeOH），涡旋振荡10分钟，然后在4 °C、15,000 × g条件下离心15分钟。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，保存于-80 °C，用于后续的核磁共振（NMR）分析。向剩余的沉淀中加入1 mL甲醇：二氯甲烷（1:1，v/v），涡旋振荡10分钟，然后在4 °C、15,000 × g条件下离心15分钟。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，保存于-80 °C，用于后续的气相色谱-质谱（GC-MS）分析。向剩余的沉淀中加入1 mL二氯甲烷：乙酸乙酯（1:1，v/v），涡旋振荡10分钟，然后在4 °C、15,000 × g条件下离心15分钟。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，保存于-80 °C，用于后续的傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）分析。2向每个样品中加入 O)，盖紧瓶盖，并在摇床中振荡 2 小时。</li>
	<li>振荡后，将溶液于室温（RT）静置 20 分钟，然后在 15,000 × g 离心 30 分钟，倾出并保留各管上清液。 
	注意：这些溶液将通过直接进样注入傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）。</li>
	<li>进行Folch提取21 （也称为 MPLEx）20) 通过重复步骤 1.3 和 1.4，用 1 mL 的 -20 ℃ 预冷的甲醇替代水，对当前的水提取残留物进行处理 &#176;C 4:3&#160;步骤1.3中用于水的氯仿:甲醇混合物 
	警告：氯仿和甲醇均高度易燃且有毒。请使用适当的个人防护装备（PPE），避免皮肤接触，并远离明火。</li>
	<li>小心分离两种形成的溶剂层（两者在视觉上可区分），分别用于傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）分析，可使用分液漏斗进行分离，或通过小心移液去除上层溶剂。 
	注意：含氯仿的组分位于下层，而含甲醇的组分密度较小，位于上层。</li>
	<li>将氯仿提取物（步骤1.6）用甲醇按1:1比例稀释，水相提取物（步骤1.4）用甲醇按2:1比例稀释，以提高通过直接进样进行傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）分析时的电喷雾离子化（ESI）效率。 
	注意：步骤1.7中含甲醇的组分无需用甲醇进一步稀释。甲醇层将直接进样进行傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）分析。</li>
</ol>
2. FTICR-MS 分析
<ol>
	<li>使用 FTICR 质谱仪时，通过直接进样 100 &#181;升的调谐溶液（参见 材料表) 进样至傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS），质量范围约为100–1,300 Da。</li>
	<li>制备腐殖酸标准品（参见 材料表) 通过配制 1 mg mL-1 用超纯过滤水配制溶液，然后将所得溶液稀释至20 &#181;g mL-1 在甲醇中。&#160;</li>
	<li>直接进样 23 &#181;将该终溶液的 L 通过设定流速为 3.0 的注射泵导入与傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FTICR-MS）联用的电喷雾电离（ESI）源 &#956;L min-1. 将针电压设为 +4.4 kV，Q1 设为 150 m/z 和玻璃毛细管在180 &#176;C. 使用分析软件检查所得谱图（参见 材料表) 以确认数据的质量。</li>
	<li>使用HPLC级甲醇在运行样品之前以及采样过程中监测残留。引入23 &#956;每份提取物的升数 通过 通过设定流速为3.0的注射泵，将样品直接注入与傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FTICR-MS）联用的电喷雾电离源（ESI源） &#956;L min-1. 将针电压设为 +4.4 kV，Q1 设为 150 m/z 和玻璃毛细管在180 &#176;C.</li>
	<li>根据样品或样品组间碳浓度的差异，调整每个样品的离子积累时间（IAT）。典型值介于0.1至0.3秒之间。每个样品采集144次扫描，对扫描信号进行平均后，使用同系CH2系列（即质荷比相差14 Da）进行内标校准。&#160; 
	注意：在完成傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）分析后，可选择将水相和甲醇提取相合并，以简化后续步骤；也可在后续所有步骤中保持两相分离。每种方法的优缺点在文中已详细描述。 讨论若进行此操作，合并水相和甲醇提取相。&#160;</li>
	<li>使用浓缩仪干燥提取物，并保留剩余提取物（约 1 mL）用于后续的气相色谱-质谱（GC-MS，水、甲醇或水+甲醇）、液相色谱-质谱（LC-MS，氯仿）和核磁共振（NMR，水+甲醇）分析。&#160; 
	注意：本实验步骤可在此处暂停，材料可于 -20 ℃ 保存 &#176;C.</li>
</ol>
3. FTICR-MS 数据处理
<ol>
	<li>使用 Formularity 软件对整个数据集的所有样品峰列表进行共校准，以减少质量偏移并标准化峰的指认22 在分子式指派之前</li>
	<li>使用 Formularity 软件22 使用信噪比大于7且质荷比测量误差 &#60; 1 ppm，并允许含有C、H、O、N、S和P，排除所有其他元素。</li>
	<li>若某一质荷比对应多个候选分子式（在500 Da以上时常见），应施加与所采样物质性质一致的限制条件。例如，在泥炭样品中，典型的限制条件包括：质量误差最小、杂原子（N、S、P）数目最少，且当含有P时，必须处于氧化态形式即，分子式中每个 P 原子至少必须含有 4 个 O 原子。&#160;</li>
</ol>
4. 气相色谱-质谱法的化学衍生化
<ol>
	<li>在GC-MS自动进样瓶中准备HPLC级正己烷的空白对照样品23。将100 mg脂肪酸甲酯混合物（FAMEs：C8 - C28）保留时间标准品溶于200 µL正己烷中。</li>
	<li>为保护羰基基团，向2.6步骤所得的甲醇提取物、水提取物（或合并的甲醇/水提取物，如使用）以及空白样品和FAME校准样品23中，各加入20 μL浓度为30 mg mL-1的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液。用瓶盖密封样品瓶。 
	警告：吡啶具有高毒性和易燃性。操作时应穿戴适当的个人防护装备，防止皮肤或眼睛接触，并避免接触明火。此外，吡啶在室温下易挥发，会造成有害空气污染。操作必须在通风良好的通风橱内进行。</li>
	<li>涡旋振荡提取物20秒，超声处理60秒，随后在离心机中37 °C、100 × g条件下孵育90分钟。 
	注意：碳水化合物或盐类含量过高可能导致提取物干燥后代谢物结晶。超声处理有助于将结晶的代谢物重新溶解于衍生化试剂中。</li>
	<li>孵育结束后，向每个样品中加入80 μL含1%三甲基氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺，涡旋振荡20秒，超声处理60秒，再于离心机中37 °C、100 × g条件下孵育30分钟。</li>
	<li>将提取物冷却至室温（20 - 24 °C），然后转移至GC-MS自动进样瓶中。</li>
</ol>
5. 气相色谱-质谱分析
<ol>
	<li>根据厂商建议（参见材料表）在分析前对质谱仪进行调谐和校准，以确保仪器正确读取质谱数据。检查氦气压力是否在规定范围内。</li>
	<li>在气相色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）上分离极性代谢物。设定进样口温度程序如下：（1）初始温度60 °C，保持1 min；（2）以10 °C min-1的速率升至325 °C；（3）在325 °C下保持5 min。</li>
	<li>使用与单四极杆质谱仪联用的气相色谱仪分析提取物。将进样口温度设为恒定的250 °C。以不分流模式注入1 μL各衍生化提取物。</li>
</ol>
6. GC-MS 数据处理
<ol>
	<li>检查所有数据文件，确保其已正确采集。注意内标保留时间及强度是否存在潜在偏移，以确认整个分析过程中数据采集的一致性。</li>
	<li>如有需要，将厂商特定的质谱数据格式转换为通用质谱格式。使用 MetaboliteDetector24 对原始数据文件进行处理，并基于 FAME 内标校准保留指数。在对齐所有数据文件的保留时间后，继续进行解卷积，最终通过将保留指数和 GC-MS 谱图与 FiehnLib 极性代谢物谱库25 匹配来实现代谢物鉴定。</li>
	<li>将仍未鉴定的代谢物通过谱图匹配方式与 NIST14 GC-MS 谱库进行交叉核对。逐一验证鉴定结果，以消除错误鉴定并减少解卷积误差。</li>
</ol>
7. 液态核磁共振分析
<ol>
	<li>将剩余的水提取物（约 300 µL）用 5 mM 的 2,2-二甲基-2-硅代戊烷-5-磺酸钠-d6 内标溶液按 10%（体积/体积）稀释。或者，将步骤 1 中获得的水相和甲醇相提取物合并，然后重新溶于水中。但需注意，此操作可能导致部分挥发性化合物在冷冻干燥过程中损失。典型的最终样品体积范围为 180–300 µL。</li>
	<li>将混合液转移至高质量的外径为 3 mm 的硼硅酸盐玻璃 NMR 样品管中。</li>
	<li>使用配备有 5 mm 三共振耐盐低温探头和低温碳预放大器的核磁共振波谱仪（理想情况下至少 600 MHz）采集谱图。</li>
	<li>在 298 K 条件下，采用一维核奥弗豪泽效应波谱法（NOESY）预饱和实验采集一维 1H 谱，参数设置为：采集时间 4 s，循环延迟 1.5 s，65,536 个复数数据点，扫描次数 512 次。</li>
	<li>采集二维 1H-13C 异核单量子相关（HSQC）谱和二维 1H-1H 全相关（TOCSY）谱，以辅助代谢物的归属与验证。</li>
	<li>使用核磁共振分析软件（见材料表）对所有谱图进行处理、归属和分析，以内标为参照定量各信号强度。通过将样品中化学位移、J-耦合及强度信息与数据库中的标准谱图比对，鉴定代谢物。&#160; 
	注意：该数据库通过定期添加定制的靶向代谢物标准品和代谢物加标样品持续扩充和完善。本步骤可作为暂停点，样品可于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
8. 液相色谱-质谱脂质组学分析
<ol>
	<li>用200 μL的氯仿重新溶解在步骤2.5中生成的干燥氯仿提取物 &#956;升甲醇</li>
	<li>注入10 &#956;L 的每种提取物注入超高效液相色谱仪，该色谱仪与轨道阱质谱仪联用，并配备反相带电表面杂化柱（3.0 mm &#215; 150 mm &#215; 1.7 &#956;m粒径）。设置34分钟梯度（流动相A：乙腈/H2O (40:60)，含10 mM乙酸铵；流动相B：乙腈/异丙醇（10:90），含10 mM乙酸铵），流速为250 &#181;L/min。采用负离子和正离子化模式，结合高能碰撞解离和碰撞诱导解离。 
	警告：乙腈对眼睛、皮肤和呼吸道具有刺激性。请穿戴适当的个人防护装备。此外，乙腈具有可燃性，禁止与氧化剂接触，燃烧时可能产生有毒烟雾。</li>
	<li>将原始的 LC-MS/MS 数据文件上传至 LIQUID&#160;以及目标文件（即，列表 &#62; 25,000 种脂质物种）进行相应电离模式（正离子或负离子模式）的分析。处理原始文件，通过检查二级质谱（MS/MS）中是否存在特征性离子（如适用）、碎片离子匹配情况（例如脂肪酰基链）、同位素间距、前体离子的质量偏差（ppm）以及保留时间，对鉴定结果进行人工验证。将确信鉴定的脂质列表导出为 .tsv 文件。 
	注意：本实验步骤可在此处暂停，并将样品在 -20 ℃ 保存 &#176;C.</li>
</ol>
9. 蛋白质组学分析
<ol>
	<li>根据 MPLEx 方案提取蛋白质20 从步骤2.4所得甲醇相的剩余部分中，通过用相当于提取物体积20倍的额外冷（-20℃）甲醇洗涤提取物 &#176;C) 甲醇</li>
	<li>使用1 mL/50 mg硅胶基吸附剂（参见 材料表) 用 3 mL 甲醇和 2 mL 含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的水溶液依次活化 C18 固相萃取柱，然后以不超过 1 mL/min 的流速加入第 9.1 步所得提取物。</li>
	<li>加入样品后，用4 mL水:乙腈:TFA（95:4.9:0.1）洗涤柱体，然后使其干燥。将一个1.5 mL收集管置于固相萃取柱下方，用1 mL甲醇:水:TFA（80:19.9:0.1）洗脱样品。</li>
	<li>将提取物浓缩至100 &#181;在真空辅助冷冻干燥机中冻干，然后通过二辛可宁酸（BCA）比色法测定蛋白质浓度26&#160;在562 nm波长下。</li>
	<li>在 4 ℃ 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟 &#176;C. 弃去上清液，将剩余沉淀在真空下干燥 5 分钟。将蛋白质沉淀重悬于水中，至终浓度为 0.1 &#181;微克肽每 &#181;L.</li>
	<li>加入二硫苏糖醇至终浓度为 5 mM，并在 60 °C 下孵育 &#176;C 下孵育 30 分钟。用 100 mM NH₄HCO₃ 溶液稀释 10 倍。4HCO38 M 尿素溶液，37 ℃孵育 &#176;在 1 mM CaCl 存在下，于 C 条件下孵育 3 小时2 以及猪胰蛋白酶，酶与蛋白质的比例为1:50。 
	注意：本实验步骤可在此处暂停，并将样品在 -20 ℃ 保存 &#176;C.</li>
	<li>分离提取物 通过 使用水相流动相（A）和乙腈流动相（B），其中均含0.1%甲酸，采用指数梯度在10 kpsi压力和500 nL/min流速下进行液相色谱分离-1.</li>
	<li>将所得洗脱液引入电喷雾电离（ESI）耦合质谱仪，采集质荷比400–2,000范围内的质谱图 m/z 分辨率为100,000 m/z 400 在线性离子阱（LTQ）Orbitrap 质谱仪中。</li>
	<li>使用 msConvert 或 ProteoWizard 将 RAW 谱图文件转换为 mzML 格式，接受所有默认参数。利用通用数据库搜索工具 MSGFPlus，将得到的蛋白质组与从相关宏基因组组装基因组预测出的目标蛋白质序列数据库进行比对搜索。</li>
	<li>添加常见污染物（例如胰蛋白酶、角蛋白、白蛋白）并去除所有完全重复的蛋白质序列，以提高肽段与质谱匹配的统计可靠性。评估MSGF得出的谱图概率得分，以确定最佳的肽段-质谱匹配。利用MSGFPlus提供的Q值对全部数据进行筛选，使错误发现率（FDR）控制在1%。</li>
</ol>
10. 代谢组学分析与代谢网络构建
<ol>
	<li>将步骤3、6、7和8中鉴定出的所有代谢物分子式汇总，建立一个包含样品中所有代谢物的单一数据库。将这些代谢物与步骤9中鉴定出的酶的酶学委员会（EC）编号或KEGG直系同源（KO）编号进行整合，并利用该整合数据集在KEGG27&#160;数据库的代谢通路部分进行检索。</li>
	<li>手动评估检索结果，确定最可能的代谢通路，并将其整合至代谢模型中。&#160;</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

用于表征代谢物和蛋白质组的单一流通、完全偶联分析流程，可揭示复杂生态系统中碳循环发生的途径。土壤和泥炭是具有异质性的基质，因此该方法的关键步骤之一是在最初阶段确保起始的泥炭或土壤材料高度均一。最好充分研磨样品，因为团聚体可能降低提取效率。对于团聚性土壤以及碳含量低、矿物含量高的土壤，这一问题尤为突出，可能需要使用不锈钢球磨机进行充分均质化。由于实验区域内土壤和泥炭的空间异质性可能较高，强烈建议设置生物学重复。
该方法使用三种溶剂：水、甲醇和氯仿，这些溶剂会影响可提取化合物的类型。原则上，这种顺序提取法应能溶解极性范围较广的化合物。然而，这些溶剂并未针对有机-矿物复合物或高度稳定的复合物的提取进行优化。如果需要提取此类化合物，更强烈的溶剂（如强酸和强碱）更为合适，但更剧烈的提取过程可能会改变样品的化学性质。在提取流程的最后阶段引入此类溶剂，可能有助于最小化这种影响。此外，氯仿可通过溶解细胞膜脂质，使临床上重要的土壤和泥炭中的细菌、病毒病原体以及其他致病性生物因子失活。因此，在提取方案中加入氯仿可降低研究可能携带来自世界各地病原体的样本时所涉及的风险。如果对提取后残留的死亡微生物细胞、...

全球范围内，湿地估计含有529 Pg的碳（C），主要以有机碳的形式埋藏于泥炭沉积物中1目前，这类泥炭地作为净碳汇，每年封存29 Tg C-1 仅在北美地区1然而，环境扰动（如排水、火灾、干旱和温度升高）会通过加速有机质分解，导致碳损失增加，从而抵消这一碳汇效应。 通过 温室气体（二氧化碳 [CO2] 和甲烷 [CH4]) 的生成1,2气候变化可能导致碳流失，如果温度升高或气候变干会促进微生物对碳的分解速率。或者，温度升高和大气CO₂浓度增加可能通过增强植物生长而增加碳输入，从而部分抵消碳分解的增加。2 浓度可能促进初级生产，从而固定更多的CO2 为有机碳（OC）。该有机碳被分解为CO的程度和速率如何2 和 CH4 取决于电子供体底物、电子受体的可利用性以及介导转化过程的微生物之间的复杂相互作用。在许多情况下，这些机制尚未被充分表征，因此它们对环境扰动的响应尚不明确，气候变化对泥炭地生态系统碳平衡的最终影响仍不清楚。
天然有机质（NOM）结构复杂，使得历史上即使要鉴定其混合物中存在的有机化合物也极为困难。近年来的技术进步显著提升了我们对这些化合物的表征能力，其中许多化合物传统上被视为难降解的腐殖酸或富里酸类物质，且在一定程度上至今仍被如此归类。3,4,5我们现在了解到，这些化合物中的许多实际上可被微生物利用，如果提供了合适的末端电子受体（TEA），就可能被分解。6,7计算化合物中碳的名义氧化态（NOSC）可为预测其分解潜力及所需终端电子受体（TEA）的能量产率提供量化指标。然而，该计算需要对有机质进行分子水平的表征。7NOSC 由分子式计算得出 通过 以下方程7：NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4，其中 z 为净电荷。NOSC 与热力学驱动力相关8，其中NOSC较高的化合物更容易降解，而NOSC较低的化合物则需要能量更高的TEA才能被还原。NOSC低于−2的化合物需要高能量产出的TEA（如O₂）才能发生还原反应。2，硝酸盐或MnIV，且无法被常见的低能量产出的电子受体（如Fe）降解III 或硫酸盐7。在湿地常见的积水缺氧环境中，这一点尤为重要2 以及其他高能量产出的终端电子受体较为稀缺9 因此，在这些条件下，较低NOSC化合物的降解在热力学上受到限制。环境扰动可通过影响O的水文变化，进而影响生态系统的热力学状态2 （能量最高的电子受体）、由初级生产所提供的有机底物和电子受体的变化，以及在较小程度上受温度的影响。湿地系统中温度效应的一个重要实例体现在同型产乙酸作用（homoacetogenesis）所发生的权衡关系中即，一氧化碳产生乙酸2 和 H2）和利用氢的产甲烷作用（即, CH4 CO 的生成2 和 H2）。在较低温度下，同型乙酸生成似乎略占优势，而较高温度则有利于CH4 生产10。这种温度效应可能对生态系统对气候变化的响应具有重要意义，因为CH4 是一种比CO更强的温室气体211 从而增加CH的生成4 以一氧化碳为代价2 在较高温度下可能会加剧气候变暖的正反馈效应。
泥炭地通过微生物对天然有机质的呼吸作用，产生具有全球重要意义的 CO2 和 CH46。有机碳底物的氧化态碳数（NOSC）决定了所产生的 CO2 与 CH4 的相对比例，这一参数至关重要，因为 CH4 的辐射强迫效应高于 CO211，同时建模研究也已将该比例确定为估算泥炭地碳通量的关键参数12。在不存在除 CO2 以外的终端电子受体的情况下，通过电子平衡可以证明：NOSC &#62; 0 的有机碳底物将产生 CO2:CH4 &#62; 1 的比例；NOSC = 0 的有机碳产生等摩尔的 CO2 和 CH4；而 NOSC &#60; 1 的有机碳则产生 CO2:CH4 &#60; 1 的比例13。自然生态系统中有机碳（OC）的分解由微生物介导，因此即使特定化合物的降解在热力学上是可行的，其反应速率仍受微生物酶活性的动力学限制，并且在缺氧条件下还受到热力学驱动力（即，NOSC）的制约7。迄今为止，全面表征有机质仍具挑战性，因为其中所含化合物的多样性需要多种互补的技术手段进行分析。近期的技术进展已弥补了这一空白；通过一系列分析技术，我们能够对广泛的有机化合物进行分子水平的表征，某些情况下还可实现定量分析，涵盖从葡萄糖等小分子初级代谢物到分子量达 800 Da 的多杂环化合物。过去，此类大而复杂的分子通常仅被笼统归类为“类木质素”或“类单宁”，并假定其难以降解。&#160;然而，分子水平的表征使得即使对这些大分子复杂化合物也能计算其 NOSC 值。这些 NOSC 值与热力学驱动力呈线性相关，从而可用于评估可供分解利用的有机质质量，结果表明在许多情况下，即使在湿地普遍存在的缺氧条件下，这些复杂分子实际上仍可能被微生物降解。
由于引入 O2 可使几乎所有自然观测到的 NOSC 值的有机物发生分解，因此本文重点关注湿地（i.e.，O2 受限）系统中有机物和微生物蛋白质组学的变化，这些变化可能是驱动此类系统的主要因素。然而，我们讨论的所有技术均可应用于来自任何生态系统的有机物。通常，基于光学和荧光分析的综合测量方法已被用于评估有机物质量3,14。然而，使用此类综合测量方法时，大量分子被归入腐殖质或富里酸等泛称类别中，导致精细结构信息丢失。这些类别的定义尚不明确，实际上可能因研究而异，从而导致无法进行比较。此外，综合测量无法提供计算系统热力学所必需的分子层面细节，因此在真正评估有机物质量方面存在局限15。
傅里叶变换离子回旋共振质谱法（FTICR-MS）、核磁共振（NMR）波谱法、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）等单独技术确实能够提供此类分子水平的详细信息。尽管这些技术各自存在一定的局限性，但它们也具备独特的优势，可通过整合方法加以利用，以获得从严格的热力学意义上量化有机质质量所需的精细分子信息。GC-MS 有助于鉴定可能对 CO 具有直接作用的关键小分子代谢物2 和 CH4 生产（例如,&#160;葡萄糖，乙酸盐 等等。）；然而，气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）需依赖标准品进行验证，因此仅限于数据库中已知化合物的鉴定，无法识别新化合物。此外，GC-MS是一种半定性技术，只能推断相对浓度的变化，无法提供计算吉布斯自由能等所需的绝对浓度信息。最后，GC-MS在分析前需对分子进行衍生化处理，这限制了其对分子量小于约400 Da的化合物的分辨能力，且在干燥步骤中易导致挥发性醇类损失。
一维（1D） 1液态核磁共振（1H NMR）可对小分子代谢物（包括初级小分子代谢物及挥发性物质，如乙醇、乙酸、丙酮、甲酸、丙酮酸、琥珀酸、短链脂肪酸，以及在基于质谱的方法中通常缺失或受损的一系列碳水化合物）进行高度定量的表征，其浓度数据在热力学参数计算中尤为有用。然而，与气相色谱-质谱联用（GC-MS）类似，复杂混合物的一维核磁共振（1D NMR）需依赖数据库进行标准化，因此单独使用时难以便捷地鉴定在复杂且动态变化的自然生态系统中可能大量存在的新型化合物。此外，核磁共振的灵敏度低于基于质谱的技术，因此只有使用配备氦冷却低温探头的核磁共振系统，才能实现浓度高于1 µM的定量代谢物分析。值得注意的是，部分核磁共振低温探头具有耐盐性，在使用较小直径（&#60; 3 mm 外径样品管16然而，核磁共振（NMR）的另一个复杂因素是存在大量顺磁性金属和矿物质（例如,&#160;Fe 和 Mn 含量高于 1 - 3 wt%)，这在高地土壤中可能含量较高，会导致光谱特征变宽，从而增加核磁共振（NMR）谱图解析的难度。采用固相萃取（SPE）可通过减少矿物盐含量并提高谱图质量，有助于基于NMR和质谱（MS）的代谢组学方法的解析。
直接进样FTICR-MS是一种高度敏感的技术，能够从单个样品中检测出数以万计的代谢物，但无法捕获乙酸、丙酮酸和琥珀酸等关键的小分子代谢物，且在检测糖类及其他碳水化合物方面素来具有挑战性17，也无法提供定量信息。然而，与其他技术不同，傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）在鉴定新型化合物并确定其分子式方面表现卓越，因此能够识别出最多数量的化合物，提供的分子信息也超过其他所述任何技术。这一点具有重要意义，因为FTICR-MS（及其他技术）所提供的分子信息可用于计算NOSC，而NOSC与决定某些化学反应发生可能性的热力学驱动力相关。8 及其在特定条件下的速率7此外，将傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）与分离技术（如液相色谱联用串联质谱）相结合，可获得定量的结构信息，从而弥补该技术的部分局限性。液相色谱-质谱（LC-MS）适用于鉴定其他方法难以表征的类脂化合物及其他代谢物。将液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振质谱（LC-FTICR-MS）或液相色谱-质谱（LC-MS）与组分收集器联用，收集特定未知目标组分，并通过二维（2D）液态核磁共振（NMR）进行结构解析，是鉴定和定量未知化合物的理想策略。18,19然而，这一步骤非常耗时，仅在需要时才使用。单独来看，每种技术仅能提供有机质的不同侧面信息，而通过整合这些技术，我们能够获得比单独使用任一技术更全面的理解。
尽管热力学因素决定了系统中可能发生转化的最终限制条件，但有机质的分解过程是由微生物介导的，其酶活性控制着反应速率。因此，要充分理解有机质分解的调控机制以及最终的温室气体（CO₂2 和 CH4湿地中温室气体的产生需要采用整合组学方法来表征微生物酶活性以及代谢物。本文介绍了一种利用单一样品进行综合分析的方法，通过连续提取策略实现完全配对的分析结果。该方法在代谢物、蛋白质和脂质提取（MPLex）方案的基础上进行了拓展，将蛋白质组学与气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）相结合。20 通过整合定量代谢物信息来鉴定小分子代谢物、蛋白质和脂质 通过 核磁共振与较大次级代谢产物的鉴定 通过 FTICR-MS。与MPLex略有不同，本方案首先进行水相提取，随后使用极性依次降低的溶剂进行连续提取。所有提取步骤均在同一份样品上进行，这在样品体积有限或难以获取时可节约样本量，并减少因非均质样品基质中分装 aliquots 差异所引入的实验误差。例如,&#160;土壤和泥炭）或储存条件与时间的差异。
最后，通过将有机质分析与微生物群落的蛋白质组学分析相结合，我们可以构建描述有机质分解途径及其转化过程的代谢网络。这使我们能够检验关于系统扰动将如何影响最终CO₂排放的具体假设。2 和 CH4 通过改变可利用的有机底物、电子受体以及介导反应的微生物群落来调控产物生成 通过 酶催化剂的活性。
该方法的总体目标是提供一种高通量的实验流程，能够从单一样本中同时分析代谢物、脂质和微生物蛋白，从而生成完全配对的数据集，用于构建代谢网络，并有效控制分析误差。

<table><tbody><tr><td>盐酸甲氧基胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>226904</td><td>衍生化试剂</td></tr><tr><td>5 mm 三共振耐盐低温探头&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>毛细管气相色谱柱 HP-5MS 柱（30 m &amp;times; 0.25 mm &amp;times; 0.25 &amp;mu;m）</td><td>Agilent</td><td>AG19091S-433</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>反相带电荷表面杂化柱（3.0 mm &amp;times; 150 mm &amp;times; 1.7 &amp;mu;m 粒径）</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>2 mL 玻璃小瓶</td><td>VWR International</td><td>46610-722</td><td>样品瓶</td></tr><tr><td>自动进样瓶</td><td>VWR International</td><td>97055-324; 9467671</td><td>样品瓶</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR International</td><td>JT9174-3</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR International</td><td>BDH67002.400</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR International</td><td>BDH85681.400</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>吡啶</td><td>VWR International</td><td>BDH67007.400</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>178837</td><td>标准品</td></tr><tr><td>C8-C24 脂肪酸甲酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CRM18918</td><td>标准品</td></tr><tr><td>N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td>标准品</td></tr><tr><td>苏万尼河富里酸标准品</td><td>国际腐殖酸学会</td><td>2S101F</td><td>标准品</td></tr><tr><td>三甲基氯硅烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89595</td><td>标准品</td></tr><tr><td>调谐溶液</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FTICR-MS 分析软件</td><td>Bruker</td><td>Compass DataAnalysis 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Formularity 软件</td><td>太平洋西北国家实验室</td><td>Formularity</td><td>可于以下网址下载：https://omics.pnl.gov/software/formularity</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent</td><td>Agilent GC 7890A 配 MSD 5975C</td><td></td></tr><tr><td>基于二氧化硅的固相萃取吸附剂</td><td>Phenomenex (Torrance, CA)</td><td>Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)</td><td></td></tr><tr><td>NMR 管 3 mm 8 150 CS5</td><td>VWR International</td><td>KT897820-0008</td><td>NMR 管</td></tr><tr><td>Varian Direct Drive 600-MHz NMR 波谱仪&amp;nbsp;</td><td>Varian Inova</td><td>Varian Direct Drive 600-MHz</td><td>NMR 波谱仪</td></tr><tr><td>Chenomx NMR Suite 8.3</td><td>Chenomx</td><td>Chenomx NMR Suite</td><td>NMR 软件</td></tr><tr><td>超高效液相色谱仪&amp;nbsp;</td><td>waters</td><td>Aquity UPLC H&amp;nbsp;</td><td>液相色谱仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Velos-ETD Orbitrap 质谱仪&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos</td><td>质谱仪&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

天然有机质（NOM）由数千种有机化合物组成的高度复杂混合物，历史上难以对其进行表征。然而，为了理解由NOM分解所导致的温室气体（二氧化碳[CO2]和甲烷[CH4]）生成的热力学和动力学控制机制，必须结合分子水平的表征与微生物蛋白质组分析。此外，气候与环境变化预计将扰动自然生态系统，可能破坏影响有机质底物供应以及执行转化过程的微生物之间复杂的相互作用。要预测环境变化影响的方向和程度，必须对有机质进行详细的分子表征，开展微生物蛋白质组学研究，并明确有机质分解的途径与转化过程。本文描述了一种方法流程，可通过直接进样傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）、气相色谱-质谱（GC-MS）、核磁共振（NMR）波谱、液相色谱-质谱（LC-MS）以及蛋白质组分析，在单个样品中实现全面的代谢物表征。该方法可获得完全配对的数据集，从而提高推断有机质分解路径、相应CO2和CH4生成速率及其对环境扰动响应的统计置信度。本文展示了将该方法应用于从泥炭地采集的NOM样品的结果；但该方案适用于任何NOM样品（e.g., 泥炭、森林土壤、海洋沉积物、etc.）。

我们执行了上述补充分析方案，比较了美国明尼苏达州Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments（SPRUCE）实验点S1泥炭沼泽中不同深度的泥炭特征。这些结果与瑞典北部永久冻土泥炭沼泽和泥炭湿地的数据进行了对比，以展示不同地点在代谢物和酶活性方面的差异。在蛋白质组学分析中，我们鉴定了3,312种酶。对酶活性随深度变化的分析显示，在SPRUCE沼泽中，酶的数量在15 cm至45 cm深度之间急剧下降（图1）。
蛋白质组学结果指明了哪些蛋白质被表达，而代谢组学数据则揭示了实际发生的化学反应。总体而言，通过傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）、核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）分析的联合应用，我们在所有泥炭样品中鉴定出67,040种代谢物（包括脂类）。其中，我们为15,385种化合物确定了分子式（图2）。整合后的代谢组学数据涵盖了广泛的氧化态、分子量...

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。

天然有机质（NOM）由数千种有机化合物组成的高度复杂混合物构成，从历史上看，这类物质一直难以……

本方案描述了一种利用质谱技术（包括代谢组学、蛋白质组学和脂质组学）以及核磁共振波谱平台，对单个样品进行全面、无偏倚的分子表征的方法。该方法的意义在于，我们可以通过鉴定多种类型的分子，对基因组下游的生物系统进行表征，从而推断出代谢和分解途径。顺序提取技术首先使用水提取生物可利用的极性化合物，随后采用MPLEx方法，从同一样品中进一步提取其他极性化合物或代谢物，以及蛋白质和脂质。该方法的可视化演示至关重要，因为它指导科研人员在第二次提取步骤中分离三层，并将提取物分配至不同的分析仪器。整合性多组学分析有助于更有效地开展研究，并全面理解复杂的生物系统。该方法可提取多种多样的分子，适用于多种类型的样本。按照文本方案所述，首先进行样品的采集与制备。使用经乙醇清洗过的不锈钢工具，将每种干燥样品各50毫克分装至各自的2毫升玻璃管中。向每个样品中加入1毫升蒸馏且脱气的水。然后盖紧小瓶，在摇床上震荡两小时。将样品在15,000 ×g 条件下离心30分钟。随后让溶液在室温下静置20分钟。将每个样品的上清液倾析并保存。对已进行水提取的残渣采用MPLEx提取法，重复上述提取步骤，但需用-20°C的氯仿-甲醇（4:3）混合液替代蒸馏脱气水。小心分离两种形成的溶剂层，可通过仔细移除上层液体来实现视觉区分。将下层非极性层在冷冻干燥机中干燥。一旦干燥完成，若在接下来的几天内进行分析，则加入5 µL氯仿和195 µL甲醇。为了通过直接进样方式提高傅里叶变换离子回旋共振质谱（简称 FTICR-MS）的电喷雾电离效率，将氯仿提取物用甲醇按 1:1 比例稀释，水相提取物用甲醇按 2:1 比例稀释。通过直接注入 100 微升调谐溶液对 FTICR 质谱仪进行校准，该溶液的质量范围约为 100 至 1,300 道尔顿。将100微升苏万尼河富里酸标准品直接注入电喷雾电离源中。通过设定流速为每分钟3.0微升的注射泵与傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪耦合。将针头电压设置为正4.4千伏。将质荷比设定为1至100，并将玻璃毛细管温度设为180摄氏度。使用分析软件检查所得谱图，以确认数据质量。随后，通过直接进样将每种提取物各100微升引入电喷雾电离源，经由设定流速为3.0微升每分钟的注射泵连接至FTICR质谱仪。设置参数与之前相同。根据每个样品或每组样品中碳浓度的差异，调整离子累积时间。每个样品采集144次扫描，对扫描结果进行平均，然后使用同系的CH2系列进行内部校准。使用浓缩仪干燥提取物，并保留剩余提取物用于后续的气相色谱-质谱、液相色谱-质谱和核磁共振波谱分析。为进行GC-MS分析，首先按照文本方案中的说明制备空白对照样品。为保护羟基，向每个样品（包括甲醇提取物、水提取物、空白样品和FAME校准样品）中加入20微升含30毫克/毫升甲氧胺盐酸盐的Paradyne溶液。用瓶盖密封小瓶。将提取物涡旋振荡20秒，然后超声处理60秒。在37°C条件下，以100 × g离心力离心提取物90分钟。向每个样品中加入80微升含1%三甲基氯硅烷的MSTFA。将提取物涡旋振荡并超声处理后，再次在37摄氏度下以100倍重力离心30分钟。待提取物冷却至室温后，转移至GC-MS自动进样瓶中。按照文本方案中所述步骤进行气相色谱-质谱分析及数据处理。为准备液态核磁共振分析，将剩余水提取物用5毫摩尔DSS内标稀释10%。将混合物转移至高质量、外径3毫米的硼硅酸盐玻璃核磁共振管中。按照文本方案中所述进行核磁共振（NMR）分析和数据处理。为进行液相色谱-质谱（LC-MS）脂质组学分析，将每份提取物各取10 µL注入超高效液相色谱系统，该系统通过反相带电表面杂化柱与Orbitrap质谱仪联用。根据文本方案中列出的条件，设置34分钟梯度洗脱程序，流速为250 µL/min。采用负离子和正离子化模式，并结合高能量碰撞解离和碰撞诱导解离。为进行蛋白质组学分析，首先根据文中所述MPLEx方案，提取剩余甲醇相中的蛋白质。在美国明尼苏达州的“变化环境下的云杉和泥炭地响应”（Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments，简称SPRUCE）试验点S1沼泽中，对泥炭进行了随深度变化的比较分析。蛋白质组学分析共鉴定出 3,312 种酶。对酶活性随深度变化的分析显示，在 SPRUCE 泥炭藓沼泽中，酶的数量在 15 厘米至 45 厘米深度之间急剧下降。为了展示不同采样点在代谢物和酶活性上的差异，将 SPRUCE 的结果与瑞典北部永久冻土泥炭藓沼泽和贫营养沼泽的结果进行了比较。通过傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）、核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）分析的综合结果，在所有SPRUCE泥炭样品中总共鉴定出67,040种代谢物。此处显示的是利用不同技术在不同深度所鉴定出的各类化合物的相对比例。氨基酸和糖类的含量随深度增加而减少，但脂类未表现出这一趋势。通过将所有分析中鉴定出的代谢物与KEGG数据库进行交叉验证，确定这些鉴定出的化合物参与了三羧酸循环、糖酵解和糖代谢等常见代谢通路。在整个实验过程中，必须注意潜在的污染源。从样品采集到分析的各个环节，样品均不应接触含塑化剂的塑料制品，以免对离子化产生不利影响。提取过程中使用的许多溶剂具有危险性或易燃性。操作时应始终穿戴适当的个人防护装备，以避免皮肤和眼睛接触，并防止样品污染。

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用于表征复杂天然有机物混合物的单吞吐量互补高分辨率分析技术

本方案描述了一种利用微孔板读数仪测量并分类土壤磷的高通量酶解法，可将土壤磷分为单酯磷、二酯磷和无机磷。在标准实验室中，可同时测定多达96个样品。...

环境样品中有机磷的高通量测定与分类

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

植物细胞壁的结构和化学特性被用于评估生物燃料和生物材料的理想原料。传统方法在处理大规模数据集时存在局限性。这些高通量的预处理、酶解糖化以及热解-分子束质谱分析方法，能够在减少实验时间和成本的同时，对大量生物质样品进行比较分析。...

木质纤维素生物质抗降解性变异的高通量筛选：总木质素、木质素单体及酶解糖释放

本文描述了一种采用二维气相色谱-飞行时间质谱法对藻类水热液化所生成生物原油中水相组分进行表征的方法。该方案也可用于分析快速热解、催化快速热解、催化脱氧及加氢处理所得液态产物中水相组分的化学组成。...

利用飞行时间质谱联用二维气相色谱对藻类水热液化水相组分进行定性表征

质子转移反应飞行时间质谱法可实现对挥发性有机化合物的高灵敏度、快速且无创的分析。为展示其应用潜力，本文提供三个示例：酸奶的乳酸发酵过程（在线生物过程监测）、不同苹果基因型（大规模筛查）以及饮用咖啡后经鼻腔空间的分析（鼻腔空间分析）。...

PTR-ToF-MS 联用自动采样系统及定制化数据分析在食品研究中的应用：生物过程监测、筛选与鼻腔空间分析

本文介绍了一种通过实时直接分析-高分辨质谱法结合多变量统计分析对植物材料进行物种鉴定的方法。...

利用实时直接分析高分辨质谱法快速高通量鉴定植物材料物种

本文介绍了一种从单个土壤样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质的实验方案，可缩短样品前处理时间，并实现对样品量有限的样本进行多组学质谱分析。...

用于土壤样本多组学分析的 MPLEx 方案

本文介绍一种高通量的全面药物监测方法，该方法可提高对多种滥用药物及其代谢物的分辨率和检测能力，并基于多段进样-毛细管电泳-质谱技术进行质量控制。...

高通量、全面性药物监测的多段注入-毛细管电泳-质谱联用技术

我们提出了一种利用宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术获取化学图像的实验方案。该方案基于采用多通道差分锁相检测的SRS显微镜，详细描述了样品制备、SRS仪器调节以及化学计量学方法，用于解析化学非均质样品中不同组分的成分信息。...

基于宽带受激拉曼散射显微技术的多重化学成像

我们介绍了一种将高分辨率质谱分析与分子对接相结合的通用方案，用于中药研究。...

高分辨率串联质谱法用于研究菊三七（Gynura bicolor DC）的化学成分

学习使用质谱与核磁共振波谱技术对单一复杂天然有机物样本进行全面的分子表征。该方法结合代谢组学、蛋白质组学和脂质组学分析，可推断代谢与分解途径，适用于多种生态系统样本。

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

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