通过纵向荧光显微镜监测神经元存活

本方案使研究人员能够在单细胞水平上监测细胞存活情况，并识别显著预测细胞死亡或存活的变量。传统的细胞毒性检测方法仅评估细胞群体，无法区分单个细胞。纵向显微镜技术则能够为群体中的每个细胞确定其死亡时间。

该技术非常适用于评估神经退行性疾病及其他疾病的新型疗法。该方法在探索神经退行性疾病的发病机制方面已被证明具有重要价值，并可同样有效地应用于其他涉及细胞死亡的疾病研究。研究人员可能在实现足够转染效率的同时避免过度毒性方面面临困难。

通过练习多通道移液器并熟悉实验方案，这些困难将随着时间的推移而减少。显微镜技术本质上是一种视觉化的方法，因此，通过观看结合阅读的方式可能更易于理解该技术。

首先，将适量的低血清培养基与转染试剂加入一个离心管中，另取一个离心管加入低血清培养基和DNA。室温孵育5分钟。然后，将两管内容物混合，并在室温下继续孵育20分钟。

使用多通道移液器和无菌塑料槽，每孔加入 100 µL 神经基础培养基，对皮层神经元洗涤两次。将条件培养基及其他剩余培养基置于 37 °C 保存。每孔更换为 100 µL 预先配制的 NBKY 溶液。

孵育20分钟后，将50微升转染试剂与DNA的混合物逐滴加入每孔中。将细胞在37摄氏度下孵育20分钟。用NBKY溶液冲洗细胞两次。

然后向孔中加入 100 µL 条件培养基和 100 µL NBC 溶液。开始对细胞进行成像时，将 96 孔板放置在荧光显微镜上。使用每个孔板特有的基准标记作为后续对齐的参考，并保存图像以供后续参考。

然后，导航至感兴趣的区域，并记录其相对于标记的 x 和 y 坐标。使用每个培养板特有的基准标记作为未来对齐的参考，并保存图像以供后续参考。最后，聚焦于表达荧光标记的转染细胞。

在适当的荧光通道中，以规则的时间间隔采集多张图像。开始图像处理时，双击 Fiji 图标，然后单击并拖动图像处理宏至 Fiji 工具栏，以在 Fiji 中打开该宏。

根据文本方案调整图像下划线处理宏的第二至第七行。然后，单击拼接，再选择网格/集合拼接。在下拉菜单中调整类型和顺序等设置，直至生成准确拼接的图像。

根据上述选择，调整第八行和第九行中的网格类型和拼接顺序参数。然后，根据需要调整第十行以指定每个孔中的图像数量，并在第十四行中将背景减除选项设置为 true。根据文本方案调整第十五行，设置滚动球半径，然后单击运行。

最后，打开输出的图像序列，根据文本方案手动识别死亡的神经元，并将数据记录在电子表格文件中。为进行统计分析，双击存活率对应的图标。

R 脚本。选中第二行，然后点击运行按钮以加载生存分析库。接着，修改第五行中的路径以调用输入的电子表格，再点击运行按钮。

选中第八行和第九行，然后点击运行按钮以执行Cox比例风险分析。选中第12至16行以及第19至24行，点击运行按钮，将死亡累积风险和生存数据以Kaplan-Meier曲线形式绘出。

本研究中，大鼠皮层神经元在铺板后第4天转染编码荧光蛋白M apple的质粒。转染24小时后，连续10天每天通过荧光显微镜对神经元进行成像。图像采集完成后，对图像进行处理，并依次检查以标记细胞死亡。

每种细胞的死亡时间通过荧光变化、形态改变以及细胞体的断裂来确定。对突变神经元的生存数据进行Cox比例风险分析，得到的风险比为2.2，表明与野生型群体相比，突变神经元的死亡速率更快。

进行此操作时最重要的是要小心移液。尽量减少空气暴露并避免产生气泡，对转染成功至关重要。转染后，可通过纵向荧光显微镜追踪多种可能影响细胞死亡的因素，包括蛋白质定位、周转率和表达水平，以及细胞存活情况。

在神经退行性疾病领域，纵向显微成像技术的动态特性有助于揭示与疾病相关的蛋白聚集究竟是毒性事件还是保护性事件。这些试剂和仪器均无危害性。