利用一种通用的生化方法鉴定新型CK2激酶底物

该实验方案可实现对复杂生物样品（如细胞或组织裂解液）中内源性CK2底物的特异性标记，进而对其进行富集和鉴定。该方法适用于任何类型的细胞或组织，从而有助于在多种生物学背景下开展CK2的研究。

本实验操作将由我实验室的研究生 John Chojnowski 演示。首先，按照文本方案中所述方法对组织样本或培养细胞进行机械裂解，以收集总共 900 µL 的样本。在 4 °C 条件下，以 17,500 ×g 离心 3 分钟。

然后，将上清液中的 270 微升转移至三个新的 1.7 毫升微量离心管中。另取出 40 微升剩余的上清液作为输入对照，转移至新的离心管中。将所有样品置于冰上。

首先，按照此处所示标记三个样本管。向激酶反应管中加入 2.7 µL CK2 和 2.7 µL 2.5 mM GTPgammaS。轻轻弹击管壁混匀，并立即置于冰上。

向仅含GTPgammaS的离心管中加入2.7微升2.5毫摩尔的GTPgammaS以及2.7微升裂解缓冲液。轻轻弹动该管以混匀，并立即置于冰上。向仅含PNBM的离心管中加入5.4微升裂解缓冲液。

轻轻弹击离心管以混匀，并立即置于冰上。将全部三个离心管在30°C水浴中孵育1分钟。此后，向每根离心管中加入13.5 µL浓度为12 mg/mL的PNBM。

将试管倒置以混匀样品，并在室温下孵育样品1小时。在样品孵育的同时，按照此处所示，标记每根层析柱对应的样品上样位置。通过反复倒置每根层析柱数次，使Sephadex G-25树脂在保存缓冲液中充分重悬，以完成层析柱的准备。

将每根色谱柱固定在夹具支架上，静置约五分钟，使树脂充分沉降。随后，在每根色谱柱底部出口下方放置一个离心管。取下每根色谱柱顶部和底部的盖子，使保存缓冲液在重力作用下流入离心管中。

当储存缓冲液耗尽后，向每个柱中加入约 2.7 毫升裂解缓冲液以平衡柱子，并确保收集并弃去流出液。重复加入裂解缓冲液并弃去流出液的操作，共三次。首先，将每个样品分别加入对应的柱中。

收集并弃去穿流液。向每个柱中加入420微升裂解缓冲液以洗涤样品。让裂解缓冲液通过柱子过滤，收集并弃去穿流液。

然后，将离心管置于每根柱子下方以收集样品。向每根柱子中加入 500 µL 裂解缓冲液，以洗脱样品。收集流出液，其中现在含有在激酶反应中富集的硫代磷酸化和烷基化 CK2 底物。

仅含GTPgammaS的反应将包含由内源性CK2催化硫代磷酸化和烷基化的底物。仅含PNMB的反应将包含背景烷基化蛋白。从每份洗脱液中移除80微升作为洗脱输入对照样本。

接下来，将每个样品均分到两个含有 200 微升的离心管中。按照图中所示，将每个离心管标记为抗硫代磷酸酯或免疫球蛋白 G。向每个抗硫代磷酸酯管中加入 2.8 微克的抗硫代磷酸酯抗体。

向每个 IGG 管中加入 2.8 微克同型对照抗体。然后将管子置于 4°C 条件下的旋转仪上孵育 2 小时。在样品孵育的最后 15 分钟内，使用洁净的刀片切掉 P200 移液器吸头的末端，以增大其孔径。

使用前，立即将含有琼脂糖珠的储存管短暂涡旋振荡。用剪去尖端的移液枪头，每项免疫沉淀反应转移100 µL珠子悬液至新的1.7 mL微量离心管中。每次转移前必须涡旋振荡珠子，以防止珠子沉降。

将离心管在4°C条件下以17,500 × g离心1分钟。移除并弃去上清液。加入200 µL裂解缓冲液，通过短暂涡旋振荡重悬磁珠。

重复离心和洗涤磁珠的操作共三次。最后一次洗涤后，将磁珠置于冰上，待后续操作时使用。当样品完成孵育后，在4°C条件下以17,500 ×g离心3分钟。

然后，将每个样品的 200 微升转移至含有洗涤后磁珠的离心管中。将离心管置于 4 摄氏度的旋转仪上孵育 1 小时。接着，在 4 摄氏度条件下，以 17,500 ×g 离心 1 分钟。

从每个上清液中取出 40 微升作为耗竭对照保存。移除并弃去剩余的上清液，注意不要扰动磁珠。向每个样本中加入 200 微升裂解缓冲液，短暂涡旋振荡以洗涤样本。

在4°C条件下，以17,500 × g离心1分钟，弃去上清液。重复此洗涤和离心过程三次，注意不要扰动磁珠。此后，向每个含有磁珠的样品中加入50 µL的2×上样缓冲液。

对于所有其他样品，包括输入对照、洗脱输入对照和耗竭对照，加入 8 微升 6X 上样缓冲液。除含有磁珠的管外，用移液器吹打各管以混匀，然后将所有样品在 95 摄氏度加热 5 分钟，随后进行 SDS-PAGE。为评估免疫沉淀是否成功，将从磁珠上洗脱的每种样品取 25 至 30 微升，上样于独立的 12.5% 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。

使用考马斯亮蓝染色每块凝胶，以观察实验方案各个阶段富集的蛋白质。使用新的洁净剃须刀片，仔细切下激酶反应抗硫代磷酸酯免疫沉淀泳道中出现的独特条带，并记录其近似的分子量。每条独特的条带都应使用新的剃须刀片。

该技术的基本原理在于CK2具有利用GTP进行磷酸基团转移的特殊能力。将外源性CK2全酶与GTP类似物GTPγS一同加入细胞裂解液中，可使内源性CK2底物蛋白发生硫代磷酸化修饰。随后用烷基化试剂对硝基苄基甲磺酸酯（p-Nitrobenzyl mesylate）处理裂解液，可在这些特异性底物蛋白上生成硫代磷酸酯基团，进而利用抗硫代磷酸酯抗体对该修饰蛋白进行免疫沉淀，并最终通过质谱分析加以鉴定。

在此展示的代表性阳性结果中，依赖于CK2的硫代磷酸化及后续烷基化均成功实现。正如预期，只有在含有完整激酶反应的泳道中，通过Western blot检测才观察到增强的抗硫代磷酸酯信号，而在仅含GTPγS以及仅含PNMB处理的样品中则未观察到该信号。对免疫沉淀并提及的蛋白质进行考马斯亮蓝染色的凝胶，也显示出阳性结果。

只有在抗硫代磷酸酯免疫沉淀泳道中才能观察到多条独特的条带，该泳道中的裂解液经过外源性CK2和GTPγS孵育。随后将标记的条带从凝胶中切下，并送交质谱分析以进行蛋白质鉴定。通过该流程鉴定出的潜在CK2底物，必须采用其他方法进行验证，例如通过标准的体外激酶实验检测CK2依赖性磷酸化。