Name: 利用多功能生化方法鉴定新型 ck2 激酶基材 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学习利用多功能生化方法鉴定新型CK2激酶底物，通过机械裂解、离心分离和免疫沉淀等技术从细胞或组织裂解液中特异性标记、富集并鉴定内源性CK2底物。该方法适用于多种细胞类型，有助于深入研究CK2在细胞过程中的生物学功能。

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本工作部分由宾夕法尼亚州卫生部向 T.I.S. 提供的联邦通用研究增强基金资助。

注意：确保所需材料已准备齐全并经过适当处理（参见材料表）。
1. 准备
<ol>
	<li>机械裂解组织样本（1-2 mg 组织加入 100 µL 裂解缓冲液，表 1）或培养细胞（一个 10 cm 培养皿，汇合度为 80-90%，加入 350 µL 裂解缓冲液），目标是为实验收集总共 900 µL 样本。注意，此体积略高于下述实验所需量。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 17,500 × g 离心 3 分钟，使样品沉淀。离心完成后，将上清液各 270 µL 转移至三个新的 1.7 mL 微量离心管中。每管中约剩余 90 µL。从中取出 40 µL 作为“输入对照”并置于新管中。将所有样品置于冰上。</li>
</ol>
2. 激酶活性检测：硫代磷酸化与烷基化
<ol>
	<li>将三个各装有 270 µL 液体的离心管分别标记为：“kinase rxn”、“GTPγS only”和“PNBM (p-nitrobezyl mesylate) only”。准备激酶反应。
	<ol>
		<li>向“kinase rxn”管中加入 2.7 µL（相当于 1,350 U）的 CK2，然后加入 2.7 µL 的 2.5 mM GTPγS。</li>
		<li>向“GTPγS only”管中加入 2.7 µL 的 2.5 mM GTPγS，然后加入 2.7 µL 裂解缓冲液。</li>
		<li>向“PNBM only”管中加入 5.4 µL 裂解缓冲液。轻轻弹击所有离心管以混匀，随后立即置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将三个离心管在 30 °C 水浴中孵育 1 分钟。孵育结束后，向三个管中各加入 13.5 µL 的 12 mg/mL PNBM。颠倒混匀样品。将这些样品在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>在步骤 2.2 开始孵育后，应尽快准备脱盐柱，因为该过程大约需要 45 分钟。</li>
</ol>
3. 脱盐柱的制备
<ol>
	<li>首先准备色谱柱（本示例实验使用3根），通过反复倒置每根柱子数次，使Sephadex G-25树脂在保存缓冲液中充分重悬。将每根柱子固定在夹具架上，静置约5分钟，让树脂自然沉降。</li>
	<li>Sephadex G-25树脂沉降后，取下柱子顶部和底部的盖帽，使保存缓冲液在重力作用下自然流出，并在柱子底部出口下方放置收集管以接收流出液，随后弃去。</li>
	<li>待保存缓冲液完全流出后，加入约2.7 mL裂解缓冲液以平衡色谱柱。收集流出液并弃去。重复此步骤3次。最后一次平衡完成后，色谱柱即可用于步骤4.1。</li>
</ol>
4. 去除PNBM
<ol>
	<li>完成1小时孵育（步骤2.2）和柱子准备（步骤3）后，将样品加入各柱中。将每根柱子标记为：“kinase rxn”、“GTPγS only”和“PNBM only”。将每个样品全部上样至对应的柱子中。收集并弃去穿流液。</li>
	<li>通过向每根柱子中加入420 µL裂解缓冲液来洗涤样品。使裂解缓冲液流经柱子，收集穿流液并弃去。完成此洗涤步骤后，将收集管置于相应位置以准备收集样品。</li>
	<li>通过向每根柱子中加入500 µL裂解缓冲液进行洗脱。收集含有硫代磷酸化和烷基化CK2底物的穿流液。</li>
</ol>
5. 免疫沉淀：第一部分
<ol>
	<li>通过从第 4.3 步收集的各次洗脱液（“激酶反应”、“仅 GTPγS”和“仅 PNBM”）中分别取出 80 µL 作为“洗脱上样对照”样本来准备免疫沉淀样品。从每个样品中取出 80 µL 后，每个样品将剩余约 420 µL。
	<ol>
		<li>将每个样品均分至两个含有各 200 µL 的离心管中。将各管分别标记为：“激酶反应 anti-thiophosphate ester”、“激酶反应 IgG”、“GTPγS anti-thiophosphate ester”、“GTPγS IgG”、“PNBM anti-thiophosphate ester”和“PNBM IgG”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个标注为 anti-thiophosphate ester 的试管中加入 2.8 µg anti-thiophosphate ester 抗体，向每个标注为 IgG 的试管中加入 2.8 µg 同型对照抗体。将试管置于 4 °C 条件下在旋转仪上孵育 2 小时。</li>
	<li>在步骤 5.2 的 2 小时孵育期最后 15 分钟内，开始准备蛋白 A/G 磁珠。</li>
</ol>
6. 蛋白A/G琼脂糖微珠的制备
<ol>
	<li>轻轻涡旋混匀储存管，确保磁珠完全重悬。使用干净的刀片切掉P200移液器吸头的末端，以增大孔径。每管免疫沉淀反应中加入100 µL磁珠悬液至新的1.7 mL微量离心管中。本示例中共需6个离心管。</li>
	<li>在4 °C条件下，以17,500 × g 离心1分钟。吸除上清液并弃去。用200 µL裂解缓冲液重悬磁珠，并短暂涡旋混匀。重复离心和洗涤步骤共3次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将磁珠置于冰上，直至步骤5.2的孵育完成。</li>
</ol>
7. 免疫沉淀：第二部分
<ol>
	<li>完成步骤5.2中的2小时孵育后，在4 °C条件下以17,500 × g离心3分钟。离心后，将每个样品中的200 µL加入已洗涤的珠子管中。将管子置于4 °C旋转仪上孵育1小时。</li>
	<li>完成1小时孵育后，在4 °C条件下以17,500 × g离心1分钟。随后从每个样品中移除40 µL上清液，作为“耗竭对照”保存（共6管）。弃去剩余上清液，注意不要扰动珠子。</li>
	<li>向样品中加入200 µL裂解缓冲液，短暂涡旋混匀以洗涤样品。然后在4 °C条件下以17,500 × g离心1分钟。移去上清液并弃去。重复洗涤和离心步骤共3次。操作过程中注意不要扰动珠子。</li>
	<li>完成洗涤步骤后，向每个含珠子的样品中加入50 µL 2×上样缓冲液。对于其余所有样品（“上样对照”、“洗脱上样对照”和“耗竭对照”），各加入8 µL 6×上样缓冲液。</li>
	<li>缓冲液加入管中后，用移液器吹打混匀，随后将所有样品在95 °C加热5分钟，然后进行SDS-PAGE分析。</li>
</ol>
8. 结果分析与验证
<ol>
	<li>验证CK2依赖性硫代磷酸化和烷基化是否成功。
	<ol>
		<li>为确定第2.2步中CK2介导的硫代磷酸化效率，取第5.1步收集的“洗脱上样对照”样品15–20 µL，通过12.5%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。</li>
		<li>使用以下抗体探测膜：抗硫代磷酸酯抗体、抗CK2α抗体以及抗GAPDH抗体（或其他合适的上样对照抗体）。若该步骤成功，则“激酶反应”泳道中的抗硫代磷酸酯信号应明显强于另外两个泳道（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察富集的CK2潜在底物并确定蛋白质身份。
	<ol>
		<li>为评估免疫沉淀步骤是否成功，取第7.4步从磁珠洗脱的样品25–30 µL，在另一块12.5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。确保所有设备清洁，并在整个操作过程中佩戴手套，以尽量减少污染。</li>
		<li>用考马斯亮蓝染色凝胶，以观察实验流程各阶段富集的蛋白质（图3）。使用新的剃刀刀片，仔细切下“激酶反应-抗硫代磷酸酯免疫沉淀”泳道中出现的独特条带，并记录其近似的分子量。</li>
		<li>将这些条带送交进行液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/MS）以鉴定蛋白质（图4）。若针对所鉴定蛋白质的抗体可用，可通过SDS-PAGE及对实验过程中收集的上样、耗竭和免疫沉淀组分进行免疫印迹分析，验证质谱结果（图4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种相对简单的生物化学方法，用于从复杂的生物样品中鉴定蛋白激酶CK2的底物。该实验方案的关键步骤基于CK2独特的酶学特性，包括利用GTPγS实现CK2依赖性的硫代磷酸化修饰特定底物蛋白，随后进行免疫沉淀及鉴定。我们已在人胶质母细胞瘤细胞和Drosophila卵巢中应用了这一策略，结果证明了该方法的实用性和广泛适用性18。
已有若干先前发表的研究利用定量磷酸化蛋白质组学方法成功鉴定了新的CK2底物19,20,21,22,23。然而，其中一些策略使用了固定化的底物阵列，而固定化蛋白的构象可能导致潜在的磷酸化位点无法被激酶接触。本文所述技术可在更接近生理或天然的环境中（即细...

蛋白激酶是信号转导级联反应中的关键组分。这些酶对底物蛋白的磷酸化可引发生物学反应，调控细胞分裂、代谢、分化等重要生命过程。CK2是一种普遍表达的嗜酸性丝氨酸/苏氨酸激酶，在从酵母到人类的物种中均保守，参与多种细胞过程，包括转录调控、细胞周期进程以及凋亡1,2,3。该酶是由两个催化性α（或α'）亚基和两个调节性β亚基组成的异源四聚体4。除了具有高度多效性外，CK2还表现出另外两个异常特性，使其研究变得复杂，即组成型活性5和双辅底物特异性6。后一特性使CK2能够利用ATP和GTP作为磷酸化底物蛋白的磷酸供体。
在小鼠中敲除CK2的催化亚基或调节亚基会导致胚胎致死，表明其在发育和器官形成过程中发挥着至关重要的作用7,8。CK2在多种癌症中也存在过表达，因此被视为一个有前景的治疗靶点9,10,11。事实上，目前已有针对CK2激酶活性的特异性抑制剂正在研究中12,13,14。尽管抑制CK2是一种可行的策略，但考虑到其多效性，另一种或许更为合理的方法是靶向那些介导特定癌症进展的关键CK2底物蛋白。因此，系统性地鉴定和表征CK2底物蛋白将有助于阐明该激酶在特定组织或肿瘤类型中的具体功能。
在此，我们描述一种通用的生化方法，用于从复杂的生物样品（如细胞或组织裂解液）中鉴定CK2底物。该方案利用CK2对双共底物的特异性，使用GTP类似物GTPγS（鸟苷5'-[γ-硫代]三磷酸），而其他内源性激酶无法利用该类似物。这有效地使激酶能够 &#34;标签&#34; 该样品中其底物的后续分离与鉴定。

<table><tbody><tr><td>12 mg/mL PNBM</td><td>Abcam</td><td>ab138910</td><td>40.5 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>2.5 mM GTP&amp;gamma;S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8634-1MG</td><td>5.4 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Anti-CK2&amp;alpha; (E-7) 小鼠单克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-373894</td><td>Western 印迹检测按 1:1000 稀释</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH (6C5) 小鼠单克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32233</td><td>Western 印迹检测按 1:1000 稀释</td></tr><tr><td>Anti-核仁素 兔多克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab22758</td><td>Western 印迹检测按 1:1000 稀释</td></tr><tr><td>Anti-硫代磷酸酯 [51-8] 兔单克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab92570</td><td>使用量可变（每样品终浓度为 2.8 &amp;micro;g）</td></tr><tr><td>预冷至 4&amp;ordm;C 的离心机</td><td>ThermoScientific</td><td>Sorvall Legend Micro 21R 货号 75-772-436&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td>见下方配方</td><td>见下方配方</td><td>30 mL</td></tr><tr><td>正常兔 IgG 抗体（同型对照）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2729S&amp;nbsp;</td><td>使用量可变（每样品终浓度为 2.8 &amp;micro;g）</td></tr><tr><td>PD MiniTrap 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-10</td><td>3 根柱</td></tr><tr><td>Protein A/G Plus 琼脂糖微珠</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td>600 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>重组人 CK2 全酶</td><td>New England Biolabs</td><td>P6010S</td><td>2.7 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>Labnet: Mini Labroller</td><td>Mini Labroller 货号 H5500</td><td></td></tr><tr><td>T98G 人胶质母细胞瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>预热至 30&amp;ordm;C 的水浴锅</td><td>Shel Lab</td><td>H20 Bath 系列 型号 SWB15</td><td></td></tr></tbody></table>

利用一种通用的生化方法鉴定新型ck2激酶底物

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

研究激酶与其底物之间的关系对于全面理解这些酶在生理和病理状态下的功能及其下游靶点至关重要。CK2是一种在进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，其已知底物数量不断增加，已达数百种，参与多种细胞过程。由于CK2具有多效性，识别并表征一组全面的CK2底物一直极具挑战性，也是当前研究这一重要激酶的主要障碍。为应对这一挑战，我们设计了一种多功能实验策略，可实现对潜在CK2底物的靶向富集与鉴定。该方案利用CK2独特的双重共底物特异性，使其能够在细胞或组织裂解液中特异性地对底物进行硫代磷酸化修饰。随后，这些底物蛋白经过烷基化、免疫沉淀，并通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行鉴定。我们此前已成功应用该方法从黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中鉴定出CK2底物，本文中进一步将该方案拓展至人胶质母细胞瘤细胞，展示了该方法在多种模式生物和实验体系中研究该激酶生物学功能的广泛适用性。

实验流程的示意图见图1。该技术的基本原理在于CK2具有利用GTP进行磷酸基团转移的特殊能力。向细胞裂解液中加入外源性CK2全酶以及GTP类似物GTPγS，可导致内源性CK2底物发生硫代磷酸化。随后用烷基化试剂p-硝基苄基甲磺酸酯（PNBM）处理裂解液，可在这些特定底物蛋白上生成硫代磷酸酯基团，该基团可通过抗硫代磷酸酯抗体进行免疫沉淀，并最终通过质谱法鉴定。图2展示了将CK2和GTPγS加入T98G（胶质母细胞瘤）细胞裂解液后，再加入PNBM所获得的阳性结果。这些结果表明，CK2依赖性的硫代磷酸化及后续的烷基化反应均成功实现。正如预期，仅在含有完整激酶反应体系的泳道中通过Western blot检测到增强的抗硫代磷酸酯信号，而在仅含GTPγS或仅含PNBM处理的样品中则未检测到该信号。图3显示了使用同型对照IgG或抗硫代磷酸酯抗体对免疫沉淀并洗脱的蛋白进行考马斯亮蓝染色的凝胶图谱...

本实验方案的目的是对来自复杂生物样品（如细胞裂解液或组织匀浆）中的蛋白激酶CK2底物进行标记、富集和鉴定。该方法利用了CK2生物学特性的独特之处来实现这一目标。

利用一种通用的生化方法鉴定新型CK2激酶底物

激酶-底物关系的研究对于全面理解这些酶的功能及其下游靶点至关重要……

该实验方案可实现对复杂生物样品（如细胞或组织裂解液）中内源性CK2底物的特异性标记，进而对其进行富集和鉴定。该方法适用于任何类型的细胞或组织，从而有助于在多种生物学背景下开展CK2的研究。本实验操作将由我实验室的研究生 John Chojnowski 演示。首先，按照文本方案中所述方法对组织样本或培养细胞进行机械裂解，以收集总共 900 µL 的样本。在 4 °C 条件下，以 17,500 ×g 离心 3 分钟。然后，将上清液中的 270 微升转移至三个新的 1.7 毫升微量离心管中。另取出 40 微升剩余的上清液作为输入对照，转移至新的离心管中。将所有样品置于冰上。首先，按照此处所示标记三个样本管。向激酶反应管中加入 2.7 µL CK2 和 2.7 µL 2.5 mM GTPgammaS。轻轻弹击管壁混匀，并立即置于冰上。向仅含GTPgammaS的离心管中加入2.7微升2.5毫摩尔的GTPgammaS以及2.7微升裂解缓冲液。轻轻弹动该管以混匀，并立即置于冰上。向仅含PNBM的离心管中加入5.4微升裂解缓冲液。轻轻弹击离心管以混匀，并立即置于冰上。将全部三个离心管在30°C水浴中孵育1分钟。此后，向每根离心管中加入13.5 µL浓度为12 mg/mL的PNBM。将试管倒置以混匀样品，并在室温下孵育样品1小时。在样品孵育的同时，按照此处所示，标记每根层析柱对应的样品上样位置。通过反复倒置每根层析柱数次，使Sephadex G-25树脂在保存缓冲液中充分重悬，以完成层析柱的准备。将每根色谱柱固定在夹具支架上，静置约五分钟，使树脂充分沉降。随后，在每根色谱柱底部出口下方放置一个离心管。取下每根色谱柱顶部和底部的盖子，使保存缓冲液在重力作用下流入离心管中。当储存缓冲液耗尽后，向每个柱中加入约 2.7 毫升裂解缓冲液以平衡柱子，并确保收集并弃去流出液。重复加入裂解缓冲液并弃去流出液的操作，共三次。首先，将每个样品分别加入对应的柱中。收集并弃去穿流液。向每个柱中加入420微升裂解缓冲液以洗涤样品。让裂解缓冲液通过柱子过滤，收集并弃去穿流液。然后，将离心管置于每根柱子下方以收集样品。向每根柱子中加入 500 µL 裂解缓冲液，以洗脱样品。收集流出液，其中现在含有在激酶反应中富集的硫代磷酸化和烷基化 CK2 底物。仅含GTPgammaS的反应将包含由内源性CK2催化硫代磷酸化和烷基化的底物。仅含PNMB的反应将包含背景烷基化蛋白。从每份洗脱液中移除80微升作为洗脱输入对照样本。接下来，将每个样品均分到两个含有 200 微升的离心管中。按照图中所示，将每个离心管标记为抗硫代磷酸酯或免疫球蛋白 G。向每个抗硫代磷酸酯管中加入 2.8 微克的抗硫代磷酸酯抗体。向每个 IGG 管中加入 2.8 微克同型对照抗体。然后将管子置于 4°C 条件下的旋转仪上孵育 2 小时。在样品孵育的最后 15 分钟内，使用洁净的刀片切掉 P200 移液器吸头的末端，以增大其孔径。使用前，立即将含有琼脂糖珠的储存管短暂涡旋振荡。用剪去尖端的移液枪头，每项免疫沉淀反应转移100 µL珠子悬液至新的1.7 mL微量离心管中。每次转移前必须涡旋振荡珠子，以防止珠子沉降。将离心管在4°C条件下以17,500 × g离心1分钟。移除并弃去上清液。加入200 µL裂解缓冲液，通过短暂涡旋振荡重悬磁珠。重复离心和洗涤磁珠的操作共三次。最后一次洗涤后，将磁珠置于冰上，待后续操作时使用。当样品完成孵育后，在4°C条件下以17,500 ×g离心3分钟。然后，将每个样品的 200 微升转移至含有洗涤后磁珠的离心管中。将离心管置于 4 摄氏度的旋转仪上孵育 1 小时。接着，在 4 摄氏度条件下，以 17,500 ×g 离心 1 分钟。从每个上清液中取出 40 微升作为耗竭对照保存。移除并弃去剩余的上清液，注意不要扰动磁珠。向每个样本中加入 200 微升裂解缓冲液，短暂涡旋振荡以洗涤样本。在4°C条件下，以17,500 × g离心1分钟，弃去上清液。重复此洗涤和离心过程三次，注意不要扰动磁珠。此后，向每个含有磁珠的样品中加入50 µL的2×上样缓冲液。对于所有其他样品，包括输入对照、洗脱输入对照和耗竭对照，加入 8 微升 6X 上样缓冲液。除含有磁珠的管外，用移液器吹打各管以混匀，然后将所有样品在 95 摄氏度加热 5 分钟，随后进行 SDS-PAGE。为评估免疫沉淀是否成功，将从磁珠上洗脱的每种样品取 25 至 30 微升，上样于独立的 12.5% 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。使用考马斯亮蓝染色每块凝胶，以观察实验方案各个阶段富集的蛋白质。使用新的洁净剃须刀片，仔细切下激酶反应抗硫代磷酸酯免疫沉淀泳道中出现的独特条带，并记录其近似的分子量。每条独特的条带都应使用新的剃须刀片。该技术的基本原理在于CK2具有利用GTP进行磷酸基团转移的特殊能力。将外源性CK2全酶与GTP类似物GTPγS一同加入细胞裂解液中，可使内源性CK2底物蛋白发生硫代磷酸化修饰。随后用烷基化试剂对硝基苄基甲磺酸酯（p-Nitrobenzyl mesylate）处理裂解液，可在这些特异性底物蛋白上生成硫代磷酸酯基团，进而利用抗硫代磷酸酯抗体对该修饰蛋白进行免疫沉淀，并最终通过质谱分析加以鉴定。在此展示的代表性阳性结果中，依赖于CK2的硫代磷酸化及后续烷基化均成功实现。正如预期，只有在含有完整激酶反应的泳道中，通过Western blot检测才观察到增强的抗硫代磷酸酯信号，而在仅含GTPγS以及仅含PNMB处理的样品中则未观察到该信号。对免疫沉淀并提及的蛋白质进行考马斯亮蓝染色的凝胶，也显示出阳性结果。只有在抗硫代磷酸酯免疫沉淀泳道中才能观察到多条独特的条带，该泳道中的裂解液经过外源性CK2和GTPγS孵育。随后将标记的条带从凝胶中切下，并送交质谱分析以进行蛋白质鉴定。通过该流程鉴定出的潜在CK2底物，必须采用其他方法进行验证，例如通过标准的体外激酶实验检测CK2依赖性磷酸化。

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学习利用多功能生化方法鉴定新型CK2激酶底物，通过机械裂解、离心分离和免疫沉淀等技术从细胞或组织裂解液中特异性标记、富集并鉴定内源性CK2底物。该方法适用于多种细胞类型，有助于深入研究CK2在细胞过程中的生物学功能。

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