使用自动化活细胞成像仪的简单迁移/侵袭实验流程

癌细胞的移动性对于转移的启动至关重要。因此，研究肿瘤细胞的运动能力及侵袭能力具有重要意义。这种在同一平台上实时研究癌细胞迁移和侵袭的整合方法，为研究细胞移动性及病理过程提供了一种易于重复且高效省时的选择。

该方法可用于研究癌细胞通过细胞外基质的侵袭过程，并可应用于其他细胞类型。为获得最佳划痕时间，应确保已优化接种密度，并在细胞单层达到100%融合后避免延长培养时间。为确定迁移实验中接种细胞的最佳数量，可在96孔板中以不同密度设置三复孔进行细胞接种。

将培养板放入活细胞成像仪中，并在成像仪软件的任务列表中选择“计划扫描”。在“抽屉设置”面板中确定培养板的位置，点击“添加容器”以选择培养板类型。在“扫描设置”面板中，根据实验培养板的设置选择或编辑扫描模式，并将扫描类型设为标准模式。

右键单击时间轴，然后选择设置间隔。接着将“每隔”设置为每两小时添加一次扫描，持续 24 小时，然后单击应用。24 小时后，打开抽屉设置以选择实验板，并单击移除容器。

选择三到六张具有代表性的图像，并将它们放入一个新的图像集合中。为确定合适的处理方案，使用分割调整、清理和滤镜功能来应用适当的汇合度掩膜，并通过“预览当前全部”查看掩膜的准确性。启动分析任务，根据细胞迁移实验开始后六至十八小时内达到约100%汇合度的时间点，确定最佳的细胞密度。

然后，将自动采集的高清晰度相差图像应用汇合度分析工具，以生成随时间变化的细胞增殖曲线。在开始实验前，用50微升以冰浴细胞培养基稀释的细胞外基质凝胶（浓度为每毫升100微克）包被用于侵袭实验的培养板。随后，将培养板置于细胞培养箱中孵育过夜。

次日下午，轻柔地吸除多余培养基，将细胞以优化后的密度接种到包被了细胞外基质的培养板中相应的孔内，每组设三个复孔，同时接种至另一块未包被的96孔板中。随后，将培养板放入细胞培养箱中过夜培养。次日早晨，将未包被的迁移实验板放入划痕工具的底座支架中，并利用导向销钉小心地将支架顶部放置到底座上。

在小心抬起针块制造划痕的同时，按住黑色杠杆。每个孔中的划痕应肉眼可见，同时在显微镜下也可观察到。随后，用预热的培养基洗涤平板一至两次，以去除任何脱落的细胞或细胞层。

进行侵袭实验时，按照刚刚演示的方法划线处理包被好的培养板。去除脱落的细胞和细胞片后，使用预冷的冷藏盒将培养板在4°C条件下平衡5分钟，然后小心吸除冷培养基。接着，在相应的孔中加入50 µL稀释后的细胞外基质凝胶，并将培养板放入细胞培养箱中孵育30分钟。

在使用细胞外基质凝胶时，气泡较为常见，但可通过吸除70%乙醇来消除。随后向迁移或侵袭检测板的相应孔中加入100 µL新鲜的温热培养基，可含或不含待测化合物，并将该板放入活细胞成像平台中。清洗划痕工具时，将顶部针块依次置于盛有5%去污剂一、1%去污剂二、无菌蒸馏水或70%乙醇的45 mL清洗槽中，每个步骤清洗5分钟，之后将划痕工具重新放回底板，在无尘环境中保存。

进行伤口实验成像时，先让培养板平衡五分钟，然后选择“容器类型”作为图像记录平面，并将扫描类型设置为划痕伤口。根据实验用培养板的设置选择或编辑扫描模式，计划在72小时期间每一至两小时重复扫描一次，持续24小时，或直至伤口愈合如示例所示。当所有伤口均已愈合后，停止扫描，并选取三至六张具有代表性的图像，涵盖不同愈合百分比范围，包括刚制造伤口后的图像，以及伤口闭合达10%和50%时的图像。

为了确定合适的处理定义，请应用适当的划痕伤口掩模和融合度掩模（如图所示），并使用“预览当前全部”功能查看掩模的准确性。然后启动分析任务。在细胞迁移实验中，伤口宽度是指伤口两侧细胞层之间的平均距离。

伤口汇合度是指损伤区域内细胞的汇合程度。理想的初始伤口汇合度应接近百分之零。相对伤口密度和伤口汇合度可反映细胞占据划痕损伤区域的速度。

这些数据在这两种代表性细胞系中几乎重叠。不同的细胞系表现出截然不同的伤口愈合能力，表明各细胞系之间的迁移能力存在差异。例如，在迁移开始时，可在该乳腺腺癌细胞系的迁移前沿观察到片状伪足，而与此同时，该黏蛋白1（mucin 1）表达的乳腺癌细胞系则未表现出任何细胞迁移的迹象。

此外，乳腺腺癌细胞系的相对伤口密度在50小时后达到饱和，而黏蛋白1产生型乳腺癌细胞系的相对伤口密度则随时间无明显变化，这凸显了腺癌细胞的高度侵袭性表型以及黏蛋白1产生型乳腺癌细胞的非侵袭性特征。腺癌细胞在穿过细胞外基质凝胶时也表现出不同的行为，呈现出具有前导突起的细长形态；在迁移实验中，迁移前沿可见一个凸起结构。接种细胞时需注意：若接种细胞数量过少，划痕将无法正常形成；若接种细胞数量过多，则会导致细胞过度拥挤。

采用此操作步骤后，可加入轨迹处理，从而使该方法适用于高通量轨迹筛选。该方法使研究人员能够在同一高通量平台上进行这些检测，并能够实时监测细胞，而非仅在实验终点进行观察。用于对划痕工具进行灭菌的消毒剂可能具有危害性。

请确保根据相关的材料安全数据表（MSDS）以及您所在机构的常规处理规定，收集并妥善处置溶液。