使用自动活单元成像仪的简单迁移/入侵工作流
2019年2月2日
目前的协议描述了一种实时研究癌症细胞迁移和入侵的综合方法, 为研究细胞迁移和形态提供了一个易于重现和省时的选择。
癌细胞流动性是转移启动的关键。因此，对肿瘤细胞细胞运动和侵入性能力的调查具有极大的关注性。这种用于实时在单个平台上调查癌细胞迁移和入侵的综合方法，为研究细胞移动性和病理学提供了一个易于重现且具有时效率的选项。
该方法可以通过细胞外基质提供对癌细胞入侵的洞察，并可应用于其他细胞类型。为了达到最佳的划痕时间，确保种子密度得到优化，并且一旦细胞单层达到100%的汇合，就不要延长孵育期。要确定迁移测定的种子细胞的最佳数量，请将细胞在 96 壁板中三分之一密度范围内放置。
将板放入实时单元格成像器中，然后从成像器软件中的任务列表中选择计划扫描。在抽屉设置窗格中，确定板的位置，然后单击"添加容器"以选择板类型。在扫描设置窗格中，根据实验板设置选择或编辑扫描模式，并设置扫描类型为标准。
右键单击时间线，然后选择设置间隔。然后设置添加扫描每'到两个小时 24 小时，然后单击应用。24 小时后，打开抽屉设置以选择实验板，然后单击移除容器。
选择三到六个代表性图像，并将它们放在新的图像集合中。要确定正确的处理定义，请使用分段调整、清理和滤镜来应用适当的汇合蒙版，并使用预览电流 all'查看蒙版的准确性。启动分析工作，并确定优化的细胞密度，根据大约 100% 的汇合时间，在 6 到 18 小时内，具体取决于迁移测定何时开始。
然后，将汇合处理分析工具应用于自动收集的高清相位对比度图像，以生成与时间相对的细胞增殖曲线。在开始检测之前，用50微升的细胞外基质凝胶在冰冷的细胞培养基中稀释，以每毫升浓度100微克涂覆为入侵测定板。然后，将盘子放在细胞培养孵化器中过夜。
第二天下午，轻轻吸吸多余的介质，以优化密度将细胞以三分之一分型板入细胞外基质涂层板的适当孔中，并放入一个额外的未涂覆的96孔板中。然后，将板放在细胞培养培养箱中过夜。第二天早上，将未涂覆的迁移检测板放入刮擦工具的底板支架中，并使用导向型销板小心地将支架的顶部放在底座上。
按住黑色操纵杆，小心地抬起销块，以划伤。每一个井的划痕应该用肉眼和显微镜可见。然后，用预热培养培养器清洗盘子一两次，以去除任何分离的细胞或细胞片。
对于入侵测定，划伤涂层板，正如刚刚证明的。取出任何分离的电池和板材后，使用预冷冷盒在四摄氏度下平衡板五分钟，然后小心吸气冷介质。接下来，将50微升稀释的细胞外基质凝胶加入适当的孔中，并将板放入细胞培养箱30分钟。
使用细胞外基质凝胶时，气泡很常见，但可以通过吸出 70% 的乙醇来消除气泡。然后添加100微升的新鲜、温暖的介质，带或不带试验化合物，加入迁移或入侵检测板的适当孔中，并将该板放入活细胞成像平台。要清洁刮擦工具，请将顶部销块放在单独的 45 毫升洗涤船上，其中含有 5% 的洗涤剂 1、1% 洗涤剂 2、无菌蒸馏水或 70% 乙醇，每次洗涤时间为 5 分钟，然后将刮擦工具放回底板上，以储存在无尘环境中。
对于伤口的成像分析，在允许板平衡五分钟后，选择容器类型"作为图像日志平面，并设置扫描类型为划痕伤口。根据实验板设置选择或编辑扫描模式，并安排 24 小时重复扫描，每 1 到 2 小时扫描 72 小时，或直到伤口愈合，如证明。当所有伤口愈合后，停止扫描，并选择三到六个代表性的图像，跨越一系列声音百分比，包括伤口制作后的图像，伤口闭合率为 10% 和 50%。
要确定正确的处理定义，请应用适当的划痕蒙版和所演示的汇合蒙版，并使用预览电流 all'查看蒙版的准确性。然后，启动分析作业。在迁移测定中，伤口宽度是伤口旁边的细胞片之间的平均距离。
伤口汇合是伤员区内的汇合。理想的初始伤口汇合应接近百分之零。相对伤口密度和伤口汇合表明占据划痕伤口区域的细胞的速度。
这些数据几乎重叠在这两个代表性的单元格行。不同的细胞系表现出非常不同的伤口愈合能力，表明细胞系之间的不同迁移能力。例如，在迁移开始时，在迁移前的这个乳腺癌细胞系中观察到拉梅利波迪亚，而这种产生粘液1的乳腺癌细胞系在同一时间点没有细胞迁移的迹象。
此外，乳腺癌线的相对伤口密度在50小时后饱和，而产生乳酸的乳酸1产生乳腺癌细胞系的相对伤口密度没有随着时间的推移而变化，突出了腺癌细胞的侵入性高表型和粘液1产生乳腺癌细胞的非侵入性。腺癌细胞在通过细胞外基质凝胶入侵时也表现不同，显示出具有前向突起的拉长形态，在迁移测定中，在迁移前看到一个出血。电镀时，请记住，如果种子的细胞太少，划痕将不能正常形成，如果种子细胞太多，就会出现过度拥挤。
按照此过程，可以添加跟踪处理，从而可以适应高通量轨道筛选。这种方法允许研究人员在单一平台上进行这些检测，这是高通量，并允许研究人员实时监测他们的细胞，而不是在实验终点。用于消毒刮擦工具的消毒剂可能很危险。
确保根据相关的 MSDS 和设施的常规触发线收集和处置解决方案。
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概述
本协议描述了一种用于实时研究癌细胞迁移和侵袭的综合方法。它提供了一种可重复且高效的方法来研究细胞迁移性和形态。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 癌症研究
- 细胞迁移
背景
- 癌细胞的迁移性对于转移至关重要。
- 了解肿瘤细胞的运动对开发治疗方法至关重要。
- 这种方法可以应用于各种细胞类型。
- 提供了通过细胞外基质进行癌细胞侵袭的见解。
研究目的
- 研究癌细胞迁移和侵袭。
- 提供一种高效的方法来研究细胞迁移性。
- 优化迁移测定的条件。
使用的方法
- 实时观察的综合方法。
- 划痕测定的种植密度优化。
- 使用96孔板进行细胞密度试验。
- 监测细胞融合度以确定最佳孵化时间。
主要结果
- 关于癌细胞迁移和侵袭的实时数据。
- 建立测定的最佳条件。
- 在受控环境中了解肿瘤细胞的行为。
- 对于癌细胞之外的其他细胞类型的潜在应用。
结论
- 该方法对于研究细胞迁移性是可重复和高效的。
- 它提供了关于癌细胞行为的宝贵见解。
- 进一步的应用可能增强对各种细胞类型的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative migration and invasion assays are critical for de-risking oncology targets and evaluating metastatic potential in preclinical models. Automated live-cell imaging platforms enable reproducible, high-throughput assessment of cell motility, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Integrating real-time analysis streamlines decision-making at key inflection points in oncology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of metastasis-related targets by quantifying cell movement and invasion.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing invasive from non-invasive phenotypes in disease-relevant systems.
- Facilitates portfolio triage by providing comparative data across cell lines and treatment conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible migration and invasion assays for downstream compound screening.
- Standardizes assay conditions and quantitative outputs using automated imaging and analysis modules.
- Enables high-throughput screening readiness and platform scalability for diverse oncology programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro invasion data with disease-relevant metastatic processes for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by correlating cell behavior with preclinical efficacy endpoints.
- Provides mechanistic insights into compound effects on cell motility and invasion through extracellular matrix.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by delivering standardized, quantitative migration and invasion data. Automated imaging and analysis modules ensure reproducibility and comparability across studies.
- Discovery Biology: Quantifies cell motility and invasion to test metastatic hypotheses and clarify target function.
- Screening: Delivers reproducible, high-content readouts for compound evaluation and assay optimization.
- Analytics: Provides real-time, quantitative metrics such as wound width, confluence, and relative wound density.
- Translational Research: Connects in vitro invasion phenotypes to in vivo metastatic potential when supported by model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, single-platform workflow adaptable to multiple cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in metastasis studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput with automated imaging and analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets based on functional invasion data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, assay setup, and live-cell imaging instrumentation.
- Needs access to automated imaging platforms and compatible analysis software modules.
- Demands cross-team standardization of seeding density, incubation timing, and image analysis parameters.
- Adaptable to various cell lines and matrix compositions with protocol optimization.
- Careful handling and disposal of disinfectants and reagents per facility safety guidelines is necessary.
