Name: 基于光片显微镜的变应性炎症体内模型中肺呼名人淋巴细胞的高级成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 了解光片荧光显微镜技术在小鼠过敏性炎症模型中成像和定量肺归巢人淋巴细胞的先进方法。该技术可精确观察T细胞在体内的肺归巢过程，为研究慢性肺部炎症疾病和开发新的治疗靶点提供重要支持。

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作者们衷心感谢德国研究基金会（DFG）合作研究中心SFB 1181和TRR 241提供的经费支持。感谢埃尔兰根光学成像中心（OICE），特别是Ralf Palmisano、Philipp Tripal和Tina Fraaß（DFG CRC 1181项目Z2）在光片荧光显微成像方面提供的专业技术支持。

涉及动物的实验均依照德国埃尔兰根当地相关主管部门（下弗兰肯行政区，维尔茨堡）批准的方案进行。小鼠饲养于特定病原体阴性环境中。人血样本的采集经埃尔兰根-纽伦堡大学当地伦理委员会及机构审查委员会批准，每位患者均签署书面知情同意书。
1. 在小鼠中诱导过敏性肺部炎症
注意：如先前研究27所述，以下实验步骤可用于在小鼠中诱导过敏性气道炎症，从而引发先天性和适应性免疫细胞在支气管肺泡灌洗液（BAL）中的聚集。本方案已在C57BL/6J小鼠中建立，但也可适用于其他标准近交品系。
参见图1A以了解体内实验流程的概要。
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉小鼠。 
	注意： 仅使用6周龄以上、体重至少为16&#160;g的C57BL/6J小鼠。
	<ol>
		<li>在PBS中配制氯胺酮/赛拉嗪溶液（氯胺酮12&#160;mg/mL；赛拉嗪1.6&#160;mg/mL），并准确测定小鼠的体重。</li>
		<li>按8 µL/g体重剂量向第一只小鼠腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪溶液，并在进行步骤1.3前通过足垫夹捏反射消失确认深度麻醉状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在PBS中新鲜配制5&#160;mg/mL的木瓜蛋白酶溶液。缓慢将10 µL（50 µg）木瓜蛋白酶溶液滴入小鼠鼻孔。密切监测小鼠直至其苏醒。</li>
	<li>对实验中包含的所有小鼠重复步骤1.1和1.2。在连续三天内执行步骤1.1–1.3。</li>
</ol>
2. 纯化并荧光标记人外周血CD4+ T细胞
注意：在无菌条件下处理细胞。
<ol>
	<li>从外周静脉采集 18&#160;mL 全血。通过 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）组分。 
	注意：采集和分析人源初级材料必须获得当地伦理审查机构的批准。仅具备适当医学资质的人员方可进行外周静脉采血。
	<ol>
		<li>将血液采集至含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管（每毫升血液含 1.6&#160;mg EDTA）中，以防止凝固。 
		可选：可使用富含白细胞的血液捐献副产品——血沉棕黄层（buffy coat）代替完整的静脉血。</li>
		<li>将血液转移至 50&#160;mL 锥形管中，并用磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:2 比例稀释。在稀释后的血液下方小心加入 10&#160;mL Ficoll 介质（密度为 1.077&#160;g/mL）作为底层。离心样品（800 ×g，室温下 15&#160;分钟，不启用刹车）。</li>
		<li>小心将离心管从离心机中取出，将含有 PBMC 的中间层转移至新的 50&#160;mL 锥形管中。弃去上层和底层液体。向含有 PBMC 的管中加入 PBS 至满，离心（300 ×g，4 °C 下 10&#160;分钟）。弃去上清液。 
		注意：如有需要，可选择性地裂解残留的红细胞。将 3&#160;mL 氯化铵-氯化钾（ACP）裂解缓冲液（155&#160;mM 氯化铵；19&#160;mM 碳酸氢钾和 0.68&#160;mM EDTA；pH 7.27）小心加入重悬的细胞沉淀中，并涡旋混匀。轻轻振荡试管 3&#160;分钟。为去除 ACP 裂解缓冲液，加入 40&#160;mL PBS 并离心（300 ×g，4 °C 下 10&#160;分钟）。弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用 CD4 微珠纯化 CD4+ T 细胞。 
	注意：通常有多个供应商提供用于人源 CD4+ 细胞纯化的磁性微珠产品，其细胞纯度应具有可比性。产品选择应基于个人偏好。本方案后续步骤（2.2.2–2.2.7）已针对特定 CD4 微珠产品及相应分离柱进行优化，具体信息见材料表。若选用其他 CD4 微珠产品，可能需对方案进行部分调整。
	<ol>
		<li>将 PBMC 沉淀重悬于至少 80 µL 含 0.5% 胎牛血清（FBS）和 2&#160;mM EDTA 的 PBS 缓冲液（PBS/FBS/EDTA 缓冲液）中，每 107 个 PBMC 使用此体积。起始细胞数量约为 30&#160;×&#160;106 个 PBMC，以获得约 3&#160;×&#160;106 至 6&#160;×&#160;106 个纯化的人源 CD4+ T 细胞。</li>
		<li>每 107 个 PBMC 加入 20 µL CD4 微珠，轻柔混匀，在 4 °C 下孵育 20&#160;分钟。用预冷至 4 °C 的 PBS/FBS/EDTA 缓冲液补满离心管，离心（300&#160;×g，4 °C 下 10&#160;分钟）。弃去上清液。</li>
		<li>将分离柱置于磁场中。用 3&#160;mL PBS/FBS/EDTA 缓冲液（预冷至 4 °C）冲洗分离柱。将细胞沉淀重悬于 500 µL PBS/FBS/EDTA 缓冲液（预冷至 4 °C）中，并将细胞悬液转移至置于磁场中的已冲洗分离柱上。</li>
		<li>用 3&#160;mL PBS/FBS/EDTA 缓冲液（预冷至 4 °C）冲洗分离柱三次，弃去流出液。</li>
		<li>将分离柱从磁场中取出，放入 15&#160;mL 离心管中。使用推杆将 CD4+ 细胞组分以 5&#160;mL PBS/FBS/EDTA 缓冲液洗脱。</li>
		<li>向离心管中加入 PBS 至满，离心（300&#160;×g，4 °C 下 10&#160;分钟）。弃去上清液。重复此洗涤步骤两次。</li>
		<li>采用标准方法（如血球计数板）测定所得细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用荧光细胞增殖染料标记 CD4+ T 细胞。
	<ol>
		<li>将 CD4+ T 细胞重悬于 PBS 中（浓度不超过 107 个细胞/mL；PBS 体积不少于 500 µL）。</li>
		<li>在 PBS 中配制 6 µM 的红光激发型细胞增殖染料溶液（参见材料表，PBS 预热至室温）。将该溶液与前述细胞悬液按 1:2 比例混合，并充分涡旋（终浓度为 3 µM）。</li>
		<li>在 37 °C 下避光孵育 10&#160;分钟。随后加入五倍体积含 10% FBS 的 RPMI 培养基，在冰上继续避光孵育 5&#160;分钟。</li>
		<li>用含 10% FBS 的 RPMI 培养基洗涤标记后的细胞三次（300&#160;×g，4 °C 下 10&#160;分钟）。将标记后的细胞重悬于 PBS 中，置于冰上并避光保存，直至使用。 
		注意：细胞长期储存（&#62;60&#160;分钟）可能对细胞存活产生不利影响。 
		可选：可通过流式细胞术检测 CD4+ 细胞组分的纯度及标记效率。取 0.5&#160;×&#160;106 至 1&#160;×&#160;106 个 CD4+ 细胞，重悬于 100 µL 缓冲液（含 1% FBS 和 2&#160;mM EDTA 的 PBS）中，加入偶联有合适荧光染料的抗人 CD4 抗体。4 °C 下孵育 30&#160;分钟。加入 1&#160;mL 缓冲液，离心（300&#160;×g，4 °C 下 10&#160;分钟）。弃去上清液。进行样品的流式细胞术检测（代表性结果见图 1B,C）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将人CD4+ T细胞过继转移至木瓜蛋白酶暴露的受体小鼠
注意：有关体内实验操作流程的概要，请参见图1A。在最后一次经鼻给予木瓜蛋白酶后一天进行细胞转移。
<ol>
	<li>将荧光标记的人CD4+ T细胞悬液（步骤2.3.4）用PBS调整至浓度为1&#160;×&#160;107 个细胞/mL。取100 µL细胞悬液加入1&#160;mL/30&#160;G注射器中。</li>
	<li>将第一只经木瓜蛋白酶处理的C57BL/6J小鼠（步骤1.1–1.3）小心放入尾静脉注射用固定装置中。使用已准备好的注射器（步骤3.1）穿刺尾静脉，缓慢注入含1&#160;×&#160;106个标记人CD4+细胞的100 µL细胞悬液。注射后不要立即拔出针头，应额外等待5秒，以防止细胞悬液外溢。</li>
	<li>将小鼠从固定装置中取出，并对下一只动物进行操作。至少保留一只经木瓜蛋白酶处理但未接受荧光标记细胞移植的小鼠，作为光片荧光显微镜检测的阴性对照。</li>
</ol>
4. 为光片荧光显微镜准备肺组织
注意：以下步骤在荧光标记的人源细胞转移后 3 小时进行（步骤 3.2）。所述实验操作，包括肺组织的收获、固定以及基于溶剂的组织透明化处理，均改编自现有文献报道的方案24,28。
<ol>
	<li>通过吸入二氧化碳（C02）处死小鼠。</li>
	<li>用含有 5&#160;mM EDTA 的 PBS 原位灌注肺脏。
	<ol>
		<li>沿胸骨剪开胸腔以暴露心脏，使用连接导管的 21 G 套管针穿刺右心室。</li>
		<li>剪开左心室以使血液和灌注液流出，通过导管缓慢灌注 20&#160;mL 冰冷的含 5&#160;mM EDTA 的 PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为实现肺组织的原位固定，暂不拔除右心室中的导管，通过导管缓慢灌注 2&#160;mL 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液，随后拔除导管和套管。 
	注意：基于 PFA 的肺组织原位固定是一种成熟的技术，用于制备适用于后续显微分析的小鼠肺组织29,30。 
	注意：PFA 具有毒性，操作时需在通风橱中小心处理。</li>
	<li>原位灌注 0.75% 琼脂糖填充肺脏。
	<ol>
		<li>将 0.75% 琼脂糖溶于 PBS 中，使用前在 50 °C 恒温振荡器中保持固态。去除小鼠的唾液腺，剪断胸骨舌骨肌，并用镊子从下方滑入以暴露气管。</li>
		<li>用 30 G 针头穿刺暴露的气管，随后更换为钝头 30 G 导管，以避免进一步损伤气管导致琼脂糖意外泄漏。使用持针器密封插入导管与气管之间的连接处。 
		可选：可将本方案与支气管肺泡灌洗液（BAL）采集相结合，以分析 BAL 中浸润的人源细胞，具体方法详见近期研究31（代表性结果见 图 2E）。</li>
		<li>通过导管将已冷却至体温的 0.75% 琼脂糖小心灌入气道，直至肺完全展开；等待琼脂糖完全凝固。拔除导管，并小心将肺组织取出，置于装有 4% PFA 的避光 2&#160;mL 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进一步固定，将样本置于 PBS 配制的 4% PFA 中，在 4 °C 下持续旋转孵育 2&#160;h（31&#160;rpm）。</li>
	<li>在 4 °C 下持续旋转（31&#160;rpm），依次将样本置于 50% 乙醇（pH 9）、70% 乙醇（pH 9）和 100% 乙醇中进行脱水处理，每步至少 4&#160;h。最后，用新鲜的 100% 乙醇再次孵育 4&#160;h。</li>
	<li>使用肉桂酸乙酯（ECi）进行基于溶剂的组织透明化处理。将样本转移至 ECi 中，在室温下避光持续旋转孵育过夜，直至组织呈现半透明状态（代表性图像见 图 1D）。 
	注意：样本在室温下保存于 ECi 中（避光）可稳定数周至数月。</li>
</ol>
5. 对完整小鼠肺叶进行光片荧光显微成像
注意：有关本步骤所基于的光片荧光显微镜及其配套软件的详细信息，请参见材料表。然而，其他厂商的类似系统也可使用，但需根据具体设备对本方案进行相应调整。在开始之前，请熟悉显微镜专用的操作手册，并遵循现场负责人员提供的技术指导。
<ol>
	<li>设置光片显微镜。
	<ol>
		<li>打开光片显微镜，并在计算机上启动相应的成像软件。用经过滤的 ECi（100 µm 滤膜）填充样品室，并将其放置在激光束之间的指定位置。</li>
		<li>使用少量耐有机溶剂的胶水将肺组织粘附在样品支架上。为尽可能减小光片所需的穿透深度，应将肺叶直立放置。随后，将样品支架放入样品室中。</li>
		<li>当使用 ECi 作为透明化试剂时，将物镜的折射率设置为 3.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整光片显微镜的设置，以在完整器官背景下检测人源细胞。
	<ol>
		<li>在控制软件中选择所需的激光器（测量滤光片 &#62; 勾选所需激光器的复选框），并选择适当的激光强度（激光透射控制 &#62; 拖动滑块设置 激光强度 &#62; 应用）。使用 488&#160;nm 激发波长（525/50 滤光片）检测自体荧光的肺组织，使用 640&#160;nm（680/30 滤光片）激发标记了红光发射荧光染料的人源细胞。</li>
		<li>先对 488&#160;nm 激发的样品进行对焦，然后在 640&#160;nm 激发波长下通过“色差校正”工具调整焦点（拖动滑块设置色差校正 &#62; 应用）。</li>
		<li>选择合适的缩放倍数；使用低倍率概览（例如 6.3x）确定标记细胞在整个肺组织中的分布情况，使用高倍率图像（例如 32x）进行精确定位。</li>
		<li>选择能够均匀照亮整个器官或特定感兴趣区域的光片宽度（光学设置 &#62; 拖动滑块设置光片宽度；通常在 20–40% 之间）。通过数值孔径（NA）设置控制图像锐度，较高的 NA 可产生更清晰的图像（光学设置 &#62; 拖动滑块设置光片 NA；对于扩张至生理尺寸的小鼠肺叶，通常可使用 0.025% 的 NA）。</li>
		<li>在“高级测量设置”中选择使用的光片数量。若采用双向照明，合并左右两侧光片以生成均匀照明的图像（高级设置 &#62; 合并光片 &#62; 选择混合模式 &#62; 使用滑块定义两个光片之间的重叠区域）。 
		注意：建议对样品采用三光片双向照明方式以获得更佳效果。 
		可选：为进一步提高图像质量，可启用动态对焦功能。该功能可在图像采集过程中沿 x 方向移动焦点。</li>
		<li>定义待采集 z 轴堆栈的起始和终止位置，并将步长设为 5 µm（xyz 台 Z &#62; 扫描范围）。 
		注意：z 轴堆栈的起始和终止位置取决于肺叶在样品室内的大小和位置。通常单个肺叶需采集约 300 至 800 层图像（步长 5 µm）。</li>
		<li>使用“自动保存设置”保存文件并开始成像。数据采集完成后，用流动水清洗被 ECi 污染的样品支架和样品室。 
		注意：若需对多个肺叶进行后续比较，应使用相同的成像参数进行图像采集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 肺部积聚的人源细胞的图像后处理与定量分析
注意：有关用于3D分析的成像后软件的详细信息，请参见材料表，以下步骤基于该软件。但也可使用其他成像后软件。
<ol>
	<li>加载 z 轴堆栈的第一幅图像（激活超越按钮，文件 &#62; 开放 &#62; 选择图像以启动所选z轴层叠图像中所有其他图像的打开及其自动3D重建。</li>
	<li>为确保正确显示 x、y 和 z 维度，请检查体素尺寸，并在必要时进行调整（编辑 &#62; 图像属性 &#62; 手动输入体素尺寸）。对于 z 方向的体素尺寸，输入两幅图像之间的选定步长（此处为 5 µm）。</li>
	<li>将每个通道以不同的颜色显示（编辑 &#62; 显示显示设置调整）。依次点击每个通道，以定义所需的颜色（在 图2A, B, C, D 自发荧光信号以灰色显示，并标记人CD4+ 红色显示的细胞。</li>
	<li>调节每个通道的强度、黑平和对比度（编辑 &#62; 显示显示设置调整使用通道栏中的三角形或在通道设置中输入精确数值进行调节。调节亮度时使用右侧三角形，调节黑平限时使用左侧三角形，调节对比度时使用中间三角形。 
	注意： 使用未进行细胞转移的对照小鼠的肺组织（步骤 3.3）来区分特异性的人源细胞信号与非特异性的背景信号。</li>
	<li>为了定量肺组织中标记的细胞，使用“添加新点”功能&#160; 工具栏并选择“跳过自动创建，手动编辑”以进行手动细胞计数。 
	注意： 或者，可使用“spots”下的自动细胞计数工具。然而，手动计数&#160; 能够更精确地区分特异性信号与非特异性信号。
	<ol>
		<li>为比较不同样本中人类细胞的累积情况，定义一个肺立方体&#160; 使用3D切割工具，以特定体积编辑 &#62; 裁剪 3D）（此处为 813 μm × 813 μm × 1,000 μm）。</li>
		<li>选择640 nm通道，设置“半径标尺”为10 µm，以计数累积的细胞。然后点击“编辑’,&#160; 检查‘选择在指针菜单中选择“’”，然后按住 Shift 键并用鼠标左键单击每个细胞以标记圆点。在统计结果中查看所计数细胞的总数。 
		注意： &#160;强烈建议对每个肺叶的多个立方体样本（此处为五个）进行计数，以确保&#160; 结果的可靠性，并弥补因科研人员主观选择计数肺容积（量化策略及代表性结果如图所示）所导致的偏差 图&#160;二维).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用“快照”工具捕获图像和/或使用“动画”工具录制视频。将调整后的文件保存为 .ims 文件文件 &#62; 输出). 
	注意： 出于代表性目的，可通过选中或取消工具栏中的框架来显示或隐藏该框架。此外，可将图像显示为最大强度投影（MIP）工具栏 &#62; 体积 &#62; 模式 &#62; 检查 MIP）或使用“表面模式”（工具栏 &#62; 添加新表面）。每种通道需单独激活“表面模式”，以突出显示组织结构和/或细胞体（代表性图像如下所示 图2C).</li>
</ol>

M.F. Neurath 曾担任 Pentax、Giuliani、MSD、Abbvie、Janssen、Takeda 和 Boehringer 的顾问。其余作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的实验设置提供了在体内炎症条件下监测原代人免疫细胞肺部归巢能力的机会，从而显著补充了传统体外黏附和趋化实验。为充分考虑肺部特有的解剖学器官特征、免疫细胞归巢的关键环节（包括趋化作用及细胞在靶器官内的分布）、以及所获数据的临床相关性和可转化性，我们采用了三项关键技术特征：（1）在活体小鼠体内分析原代人免疫细胞；（2）通过木瓜蛋白酶诱导肺部炎症；（3）对透明化肺组织进行光片荧光显微成像。
尽管由于人与小鼠之间受体-配体相互作用可能存在显著的不兼容性，导致在活体小鼠体内对过继转移的人免疫细胞进行功能研究在某些方面受到一定限制，但人源化小鼠模型这一总体概念在过去几十年中已成功建立，成为转化医学领域重要的实验工具24,32,33,34,<sup cla...

肺部经典的炎症性疾病，如过敏性哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD），已知主要由活化的淋巴细胞向肺组织异常募集所驱动1,2。淋巴细胞释放的细胞因子（例如 IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IFN-γ 和 TNF-α）可进一步促进先天性和适应性免疫细胞的趋化作用，诱导气道纤维化重塑，或直接损伤肺实质2。迄今为止，导致淋巴细胞在肺组织中病理性积聚的潜在机制尚未完全阐明。类似于肠道和皮肤归巢中所描述的组织特异性T细胞印记现象，肺树突状细胞（DCs）显然能够启动外周T细胞，使其优先浸润肺组织，至少部分通过诱导淋巴细胞表面表达CCR4实现3。除CCR4外，浸润气道的T细胞与外周血中的T细胞相比，还表现出CCR5和CXCR3趋化因子受体的显著上调1,4,5。总体而言，现有数据支持这一观点：在生理或炎症条件下，T淋巴细胞向肺组织归巢涉及多种不同的趋化因子受体及其相应配体，因而高度依赖于先天性与适应性免疫细胞之间精密协调的协作1。尤其在病原体或过敏原暴露的初始阶段，先天免疫系统细胞会响应TLR刺激或IgE介导的交联，迅速释放多种趋化因子，如LTB4、CCL1、CCL17、CCL22、CCL20、CXCL10和PGD21,6,7。其中典型的例子是PGD2与其趋化因子受体CRTh2之间的相互作用，该通路对Th2细胞的趋化具有特别重要的意义，因此被视为哮喘临床治疗中一个颇具前景的治疗靶点。事实上，与安慰剂组相比，中度哮喘患者在接受选择性CRTh2拮抗剂治疗后，症状得到改善，且第一秒用力呼气容积（FEV1）显著提高8,9。在炎症反应进展更明显的阶段，已募集的T细胞可通过释放IL-4和IL-13作为强效刺激信号，进一步放大肺部淋巴细胞的积聚。随后，这些髓系来源的先天免疫细胞以STAT6依赖的方式上调CCL17和CCL22的表达1,10,11。&#160; 尽管上述过程的复杂性仍阻碍着人们对T细胞肺归巢机制的全面理解，但它为炎症性或过敏性肺部疾病的潜在优化治疗提供了大量分子靶点。因此，迫切需要创新的实验技术，以进一步深化和补充我们在T细胞趋化和肺归巢领域的知识。
由于人体内淋巴细胞向肺部归巢的过程受到多种细胞、体液和物理参数的影响1，大多数现有的实验方法均无法完全模拟这一免疫学过程的全部复杂性。因此，许多用于分析肺部归巢的标准实验方案往往仅选择性地关注淋巴细胞趋化、黏附、迁移和滞留级联反应中的某一特定环节。除了对循环或肺部浸润性淋巴细胞表面整合素和趋化因子受体的mRNA或蛋白表达模式进行纯描述性测定，以及对血液、支气管肺泡灌洗液（BAL）或肺组织中相应趋化因子水平进行互补性检测外12,13,14,15，已建立的体外细胞培养实验也可在明确的实验条件下对淋巴细胞的黏附或趋化功能进行功能学表征16,17,18。原则上，静态体外黏附实验用于检测培养的淋巴细胞与内皮单层细胞或包被有重组内皮黏附分子（如MAdCAM-1、VCAM-1）的玻片之间的结合能力，而标准的体外趋化实验通常采用transwell系统，以定量评估淋巴细胞沿趋化因子梯度迁移的能力19。这两种体外实验体系均允许对实验条件进行可控调节和干预，但另一方面却忽略了已知对体内淋巴细胞趋化和黏附具有关键影响的重要变量。尤其是静态细胞培养实验未考虑持续血流所产生的剪切力19，并可能忽略体内环境中存在的免疫微环境及与其他非淋巴免疫细胞的相互作用。为克服这些局限性，静态体外趋化或黏附实验所得结果的解释需进一步通过在流动条件下进行的动态黏附实验20,21以及在炎症性器官病理的体内模型中加以验证19。事实上，已有动物研究通过在特定肺部疾病模型中分析基因修饰小鼠，得出了关于炎症或过敏条件下T细胞肺部归巢调控机制的重要结论3,22,23。通过定量比较野生型小鼠与特定目的基因缺陷小鼠肺部浸润性淋巴细胞的差异，已成为定义特定细胞通路或受体对疾病驱动型T细胞分布模式影响的成熟且广泛应用的工具。然而，与前述体外细胞培养实验相比，基于经典动物模型的研究设计无法直接分析和监测来自炎症性肺病患者血液或支气管肺泡灌洗液中的原代人源T细胞。因此，仍难以在功能上验证某种经临床诊断明确的肺部疾病是否能够赋予人源淋巴细胞优先向肺部归巢的趋向性，以及临床参数在多大程度上可能影响这一过程。最近，在炎症性肠病（IBD）研究中引入了一种极为精巧的体内方法，成功克服了上述大多数局限性，为深入研究肠道淋巴细胞归巢开辟了新的转化研究路径24。该方法利用基于溶剂的组织透明化技术，结合横断面光片荧光显微镜作为强大的成像工具，成功实现了对结肠炎免疫缺陷小鼠肠道内过继转移的人源T细胞浸润与分布的可视化24。该实验体系尤其实现了两项主要创新：（1）可在实验定义的体内条件下直接分析原代人源免疫细胞；（2）可对病变器官较大区域（约1.5&#160;cm&#160;x&#160;1.5&#160;cm）进行高分辨率成像，并进一步完成三维重建。此外，多项近期研究已成功将基于溶剂的组织透明化与光片荧光显微镜技术确立为先进肺部成像的重要工具25,26。为在肺部免疫学领域充分利用这一技术进步，我们现将该系统应用于肺部归巢的分析。
本文提供的方案逐步介绍了如何纯化并荧光标记人原代T细胞，以将其转移至诱导肺部炎症的小鼠体内；此外，还详细描述了后续的光片荧光显微成像过程，包括器官制备和图像处理。总体而言，我们希望通过引入一种复杂但切实可行的实验模型，在体内条件下监测人淋巴细胞向肺部的归巢过程，从而推动炎症性或过敏性肺部疾病领域的未来转化研究。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖 NEEO Ultra</td><td>卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor594 抗人 CD45 抗体</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>304060</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>卡尔罗斯特有限责任公司，德国卡尔斯鲁厄</td><td>K2981</td><td></td></tr><tr><td>21 G 套管针</td><td>Becton, Dickinson and Company，美国富兰克林湖</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>细胞增殖染料 eflour670</td><td>eBioscience Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4 微珠，人</td><td>Miltenyi Biotech GmbH，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸）</td><td>卡尔罗斯特有限责任公司，德国卡尔斯鲁厄</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>9 mL 钾-EDTA 血液采集管</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co., N&amp;uuml;德国马尔堡</td><td>21066001</td><td></td></tr><tr><td>肉桂酸乙酯（ECi）</td><td>Sigma-Aldrich，德国斯泰因海姆</td><td>112372-100G</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 &amp;ge; 99.5%（乙醇）</td><td>卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄</td><td>5054.3</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）Good Forte</td><td>PAN-Biotech GmbH，艾登巴赫，德国</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>过滤 100 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>VWR International Germany GmbH，德国达姆施塔特</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 图像分析软件 9.0.2</td><td>Bitplane AG，苏黎世，瑞士</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>ImspectorPro 软件</td><td>Abberior Instruments GmbH, G&amp;ouml;德国蒂宾根</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮&amp;nbsp;</td><td>德国弗赖堡 Inresa Arzneimittel GmbH公司</td><td>3617KET-V</td><td></td></tr><tr><td>LaVision UltraMicroscope II</td><td>LaVision BioTec GmbH，比勒费尔德，德国</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech GmbH，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Multifly 针头 20 G</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co., N&amp;uuml;德国马尔布雷希特</td><td>851638035</td><td></td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>德国黑森州美因茨的B. Braun Melsungen AG公司</td><td>9161502</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>neoLab Migge GmbH，德国海德堡</td><td>C-1003</td><td></td></tr><tr><td>Pattex 胶水</td><td>Henkel AG &amp;amp; Co, D&amp;uuml;德国杜塞尔多夫</td><td>PSK1C</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotech GmbH，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液（密度 1.077 g/mL）</td><td>anprotec</td><td>AC-AF-0018</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>默克</td><td>1,071,440,025</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco（磷酸盐缓冲液）</td><td>Biochrom GmbH，柏林，德国</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 抗人 CD4</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>317428</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 小鼠 IgG2b &amp;kappa; 同型对照</td><td>BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>400337</td><td></td></tr><tr><td>PFA（多聚甲醛）</td><td>卡尔罗斯特有限责任公司，德国卡尔斯鲁厄</td><td>0335.1</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾</td><td>卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co., N&amp;uuml;德国马尔布雷希特</td><td>86.1254.001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>德国黑森州美因河畔美尔松根，B. Braun Melsungen AG</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company，美国富兰克林湖</td><td>260067</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company，美国富兰克林湖</td><td>260069</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co., N&amp;uuml;德国马尔堡</td><td>72,706,400</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 离心管</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co., N&amp;uuml;德国马尔布雷希特</td><td>72.695.400&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 管，棕色</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co., N&amp;uuml;德国马布雷希特</td><td>72,695,001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co., N&amp;uuml;德国马布雷希特</td><td>62.554.502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co., N&amp;uuml;德国马尔布雷希特</td><td>62.547.254&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotech GmbH，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rompun 2%）</td><td>Bayer Vital GmbH，德国勒沃库森</td><td>KPOBD32</td><td></td></tr></tbody></table>

基于光片显微镜的过敏性炎症活体实验模型中肺归巢人淋巴细胞的高级成像

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

高度活化的免疫细胞在组织中大量积聚是多种慢性炎症性疾病的显著特征，也成为临床治疗相关患者时一个极具吸引力的治疗靶点。为了进一步优化旨在调控促炎性免疫细胞病理性失衡组织浸润的治疗策略，深入理解外周淋巴细胞在不同疾病和器官中的特异性归巢特性显得尤为重要。本文所述实验方案可用于监测荧光标记并过继转移的人淋巴细胞在木瓜蛋白酶诱导的肺部炎症模型中向肺组织的积聚情况。与常用于分析免疫细胞迁移和趋化作用的标准体外实验相比，本研究所引入的体内模型能够充分考虑肺组织特有的结构特征以及活体小鼠体内复杂炎症环境的影响。此外，三维断层光片荧光显微成像不仅可提供关于浸润免疫细胞的定量数据，还能清晰展示免疫细胞在炎症肺组织内的空间定位模式。总体而言，我们介绍了一种在慢性炎症性肺疾病免疫学研究领域具有重要价值的创新技术，研究者可依据所提供的分步操作指南轻松实施该方法。

本方案描述了一种实验性小鼠模型，可通过光片荧光显微镜监测并定量过继转移的人源T淋巴细胞在肺组织中的聚集情况。图1A展示了实验流程中体内步骤的示意图。为确保结果可靠，至关重要的是获得高质量的分离后并经荧光标记的人源CD4+ T细胞，这些细胞随后将被转移至小鼠体内。如图1B,C代表性所示，基于微珠的细胞富集及后续荧光标记操作通常可获得流式细胞术检测下CD4+ T细胞纯度＞95%，且所有CD4+ T细胞均实现有效荧光标记。光片荧光显微镜成像的质量和穿透深度在很大程度上依赖于适当的组织透明化程度。如图1D所示，本研究采用的基于ECi的组织透明化方案能够实现较高的器官透明度，表明折射率匹配成功。最后，图2B,C,D</strong...

本文介绍的实验方案可在体内炎症条件下表征人原代淋巴细胞的肺部归巢能力。在过敏性炎症小鼠模型中，通过化学透明化处理肺组织后，利用光片荧光显微镜对过继转移的人免疫细胞在肺部的浸润情况进行成像并定量分析。

高度活化的免疫细胞在组织中大量积聚是多种慢性炎症性疾病的显著特征，并已成为……

我们的技术能够在体内炎症条件下精确定位肺部积聚的人类免疫细胞，为T细胞归巢至肺部的过程提供令人振奋的深入见解。该方案支持T细胞肺部归巢的转化研究，因而有助于发现治疗炎症性或过敏性肺部疾病的优化疗法的新靶点。特别是，该方法能够综合考虑疾病特异性免疫细胞特性、肺组织结构以及炎症微环境对T细胞肺部归巢的影响，因而具有显著优势。总体而言，我们的技术在慢性炎症性肺部疾病的免疫学研究中具有重要价值，这类疾病通常由大量活化的免疫细胞在组织中积聚所驱动。取一只体重至少16克、六周龄、已麻醉的C57 black 6J小鼠，在确认其对脚趾夹捏无反应后，使用微量移液器将10微升新鲜配制的木瓜蛋白酶溶液缓慢滴入小鼠一侧鼻孔，每日一次，连续三天。末次给予木瓜蛋白酶后的第二天，将10毫升Ficoll介质铺在已用PBS以1:2比例预稀释的健康志愿者外周血下方，进行密度梯度离心分离。将外周单个核血细胞或PBMC中间层转移至新的50毫升离心管中，通过离心收集细胞。接下来，根据生产商说明书，使用磁性微珠法分离CD4阳性细胞。将微珠分离得到的CD4阳性T细胞重悬，浓度最高可达每至少500微升PBS中含有1×10⁷个T细胞。在37摄氏度条件下，使用适当的可被红光激发的细胞增殖染料对细胞标记10分钟。孵育结束后，在冰上用五倍体积的添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基处理5分钟以终止标记反应，随后用培养基洗涤三次。为了将人CD4阳性T细胞过继转移至经木瓜蛋白酶处理的受体小鼠，将荧光标记的T细胞重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，调整细胞浓度至每毫升1×10⁷个细胞，每只受体动物使用一支配有30号针头的1毫升注射器吸取100微升细胞悬液，然后将注射器中的全部细胞悬液注入经木瓜蛋白酶处理小鼠的尾静脉，细胞注射完成后保持针尖在静脉内额外停留5秒，以防止细胞悬液外漏。过继性细胞转移3小时后，使用连接导管的21号套管穿刺每只安乐死小鼠的右心室，并在左心室做切口。用20毫升冰冻的磷酸盐缓冲液（含5毫摩尔EDTA）缓慢灌注肺部，随后灌注2毫升冰冻的4%多聚甲醛。当所有固定液完全流经组织后，取出唾液腺并剪断胸骨舌骨肌，以便将镊子插入气管下方，暴露气道组织。在更换为钝头30号导管以防止对组织造成进一步损伤之前，先用30号针头对暴露的气管进行初步穿刺。使用持针器密封插入的导管与气管之间的连接处，并小心地将约37摄氏度的0.75%琼脂糖灌注至气道，直至肺完全展开。导管与气管之间形成紧密连接对于将肺扩张至其生理大小以及维持组织结构以进行成像至关重要。当琼脂糖完全凝固后，移除导管，并小心地将肺组织转移至一个避光的、含有 4% 多聚甲醛的 2 毫升离心管中。接着，在 31 转/分钟持续旋转条件下，于 4 摄氏度下依次用乙醇进行梯度脱水处理，每次孵育 4 小时，具体步骤如前所述。完全脱水后，将样品转移至肉桂酸乙酯中，在室温下孵育过夜，直至组织呈现半透明状。进行光片荧光显微镜观察时，使用少量耐有机溶剂的胶水将肺组织粘附在显微镜的样品 holder 上，并将肺叶以直立方向固定在 holder 上。将样品 holder 放入成像腔室中，并在仪器软件中选择实验所需的适当激光器。接着，使用光学设置下方的滑块调节光片宽度和数值孔径，以均匀地显示整个器官或特定感兴趣区域。在激光透射控制下，使用滑块为每个选定的激光器设置激光强度，然后点击应用。使用高级测量设置将左侧和右侧的光片合并，以生成均匀照明的图像。在扫描范围下定义待测量Z堆栈的起始和结束位置，并将步长设置为5 µm，然后选择自动保存以自动保存文件并开始测量以采集图像。当所有图像采集完成后，在3D后期成像分析软件中激活Surpass按钮，并加载一个Z轴序列中的第一幅图像，以启动所选Z轴序列中所有其他图像的打开及自动3D重建。随后在“显示调整”中，调节每个通道的强度、黑位平和对比度。为了比较不同样本中人源细胞在肺组织内的聚集情况，选择“编辑”和“3D裁剪”功能，定义一个具有特定体积的肺部立方体区域。为了定量分析该限定肺部立方体内标记的细胞，打开工具栏中的“添加新斑点”功能，点击跳过自动创建，手动编辑，并选择640纳米通道。将半径刻度设置为 10.00 微米，点击“选择”，然后在“编辑”菜单下，按住 Shift 键并用鼠标左键单击，以在每个发出荧光的细胞上单独标记一个点。统计结果中将显示计数的细胞总数。要捕获图像，请使用快照工具，或使用动画工具录制视频。基于微珠的细胞富集及后续荧光标记通常可获得至少95%的CD4阳性纯度，并通过流式细胞术确认这些细胞的成功标记。基于肉桂酸乙酯的组织透明化处理可实现器官高度透明，表明折射率匹配成功。肺组织的自发荧光信号为通过光片显微镜成像肺部解剖结构提供了有力工具，该信号可显示为平均强度投影或表面模式。与传统显微镜技术相比，光片显微镜技术具有对整个器官进行成像并实现后续三维重建的优势，从而能够在全器官背景下识别和可视化增殖染料标记的、经转移的人源T细胞。此外，在木瓜蛋白酶处理的动物中，转移的人源T细胞倾向于选择性地在炎症肺组织中富集，这一结论进一步得到以下事实的支持：在受体动物的肠黏膜中无法检测到人源CD4阳性T细胞。为了在不同实验条件下对人源CD4阳性T细胞在肺部的富集情况进行定量与比较，还可如示例所示，在若干个定义体积的肺组织立方体中对标记细胞进行计数。精细的组织制备步骤，包括肺灌注、肺膨胀以及组织透明化处理，对于获得高质量、高分辨率的光片显微图像至关重要。为进一步确认过继转移的人淋巴细胞成功穿出血管，本方案可轻松结合流式细胞术，对小鼠支气管肺泡灌洗液中的人淋巴细胞进行定量分析。在体内条件下监测来自个体患者的免疫细胞，有助于识别特定疾病或治疗所导致的免疫细胞功能改变。

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