基于光片显微镜的变应性炎症体内模型中肺呼名人淋巴细胞的高级成像

我们的技术允许在体内炎症条件下精确成像肺积累的人类免疫细胞，为T细胞肺活化过程提供令人兴奋的见解。该协议支持T细胞肺的转化研究，从而可能有助于确定炎症或过敏性肺疾病的优化治疗的新靶点。特别是，考虑疾病特异性免疫细胞特性、肺组织组织和炎症环境对T细胞肺结基的影响的能力使这种方法非常有利。

总的来说，我们的技术对于慢性炎症性肺病领域的免疫学研究具有很高的价值，而慢性炎症性肺病通常由活化免疫细胞的压倒性组织积累所驱动。在确认在至少16克、6周大、麻醉的C57黑色6J小鼠中对头趾捏没有反应后，使用微管将10微升新鲜准备好的木瓜溶液连续三天每天一次送到小鼠的鼻孔中。在上次给药的第二天，从健康志愿者的人类外周血液中，10毫升的Fifioll介质以PBS的1比2的比例预先稀释，通过离心进行密度梯度分离。

将外周单核血细胞或PBMC相间层转移到一个新的50毫升管中，通过离心收集细胞。接下来，根据制造商的协议对CD4阳性细胞进行磁性微珠分离。每至少500微升PBS浓度，以高达十倍至第七T细胞的珠分离CD4阳性T细胞重新悬浮。

在37摄氏度下，用适当的红光兴奋细胞增殖染料标记细胞10分钟。在孵化结束时，用五卷RPMI介质和10%FBS补充，在冰上5分钟，随后在介质中洗三次，以标签反应。用于将人类CD4阳性T细胞移植到受木瓜暴露的接受小鼠中， 将荧光标记的T细胞重新悬浮到PBS中每毫升浓度10至7个细胞，将100微升细胞装入一个1毫升注射器，每个接受者动物装有30针，然后将一个注射器的整个细胞量注入尾静脉，一种经过木瓜治疗的动物在静脉内保持针尖，以补充细胞分娩后五秒钟，以防止细胞悬浮放电。

收养细胞转移三小时后，用连接到导管的21个量表导管刺穿每只安乐死小鼠的右心室，并在左心室进行切口。慢慢地用20毫升的冰冷PBS补充5毫升EDTA，然后用2毫升的冰冷4%半甲醛补充肺部。当所有的固定剂都通过组织冲洗时，取出唾液腺并切割胸肌，让钳子滑下气管以暴露气管组织。

使用 30 量针对暴露的气管进行初始穿刺，然后用钝 30 量导管更换针头，以防止对组织造成进一步损害。使用针架密封插入导管和气管之间的交汇点，并小心地将气道填充约 37 摄氏度 0.75% 的气道，直到肺完全展开。导管和气管之间的紧密交汇点对于将肺扩展到其生理大小和维持组织结构进行成像至关重要。

当气糖完全凝固后，取出导管，小心地将肺转移到一个变暗的两毫升管中，管内充满4%的半面折。接下来，连续使用乙醇孵育组织脱水，以每分钟31次旋转和4摄氏度的速度连续旋转，每孵育4小时。完全脱水后，将样品转移到乙基辛纳马，在室温下进行过夜孵育，直到组织半透明。

对于光片荧光显微镜，使用一小滴有机溶剂稳定胶水将肺粘在显微镜的样品支架上，并直立将肺叶放在支架上。将样品支架放入其腔室，并在仪器软件中选择适当的激光器进行实验。接下来，使用"光学"下的滑块设置一个纸张宽度，该宽度表示数字光圈，以均匀地显示整个器官或特定感兴趣的部分。

使用滑块在每个选定的激光激光传输控制下设置激光强度，然后单击"应用"。使用高级测量设置合并左右光片，以创建均匀的照明图像。定义要在扫描范围内测量的 Z 堆栈的开始和结束位置，将步长设置为五微米，然后选择自动保存以自动保存文件并开始测量以捕获图像。

获取所有图像后，激活 3D 成像后分析软件中的 Surpass 按钮，从一个 Z 堆栈加载第一个图像，以启动所选 Z 堆栈的所有其他图像的打开和自动 3D 重建，然后在"显示调整"下调整每个通道的强度、黑色水平和对比度。要比较不同样本中肺组织内人体细胞的积累，请选择"编辑"和"裁剪 3D"以定义具有特定体积的肺立方体。要量化定义的肺立方体中标记的单元格，请在工具栏中打开"添加新点"，单击"跳过自动创建"，手动编辑并选择 640 纳米通道。

将半径比例设置为 10.00 微米，单击"选择"，并在"编辑"下使用鼠标左键单击"Shift"，用点单独标记每个荧光细胞。计数单元格的总数将显示在统计信息中。若要捕获图像，请使用快照工具，或使用动画工具捕获视频。

微珠基细胞富集和随后的荧光标记，如证明通常导致CD4阳性纯度至少95%，并成功标记这些细胞由流细胞学确定。基于乙基辛纳马泰的组织清除实现了高水平的器官透明度，表明成功的折射率匹配。肺组织的自动荧光信号提供了一个有用的工具，通过光片显微镜来成像肺的解剖结构，可以显示为平均强度投影或表面模式。

与传统显微镜相比，光片显微镜具有全器官成像和随后的三立重建优势，可识别和可视化整个器官环境中的增殖染料标记、转移的人类T细胞，此外，转移的人类T细胞在受托动物的肠道粘膜中选择性地积累在木瓜暴露动物的肺组织内，这一事实得到了进一步的支持，即人类CD4阳性T细胞无法从受援动物的肠道粘膜中检索。对于不同条件下人类CD4阳性T细胞肺积累的定量和比较，标记的细胞也可以计算在定义体积的几个肺立方体中，如所证明的。仔细的组织准备，包括肺灌注、通货膨胀和组织清除对于优化生成高分辨率光片显微图像非常重要。

为了进一步确认转移的人类淋巴细胞的成功诊断，此协议可以很容易地与人类淋巴细胞在穆林支气管熔岩内的流细胞测量定量相结合。监测体内单个患者产生的免疫细胞的能力支持识别特定疾病或治疗所压印的免疫细胞的功能变化。