应用先进的体外培养技术研究人类肠道微生物群

本实验方案的目的是在体外培养肠道微生物群，从而能够在不考虑现代组分影响的情况下研究微生物群的动态变化。利用这种多阶段体外系统，可同时启动并计数结肠多个区域的管腔内及黏膜相关微生物群落的发育情况。

由于该体外系统的复杂性，对该方法进行可视化演示非常有帮助。首先，向升结肠中加入 500 毫升的定义培养基，向横结肠中加入 800 毫升的定义培养基，向降结肠中加入 600 毫升的定义培养基。根据反应器体积按比例向结肠各区域添加黏蛋白微载体，并使用取样管和注射器从每个反应器中移除多余的定义培养基。

使用 pH 探针调节每个反应器中的 pH 值，并开启氮气冲洗 20 分钟。接下来，按照制造商的说明解冻粪便匀浆，然后用粪便匀浆样品装填一支 60 毫升的注射器。

然后，通过取样口向每个结肠反应器接种相当于反应器体积5%的匀浆液，进行过夜培养，并控制pH。次日早晨，用酒精清洁每个生物反应器取样口的鲁尔锁接口。待接口干燥后，将已排尽空气的30毫升注射器连接至其中一个取样口。

将活塞抽拉三到五次，以确保充分混合反应器中的组分，然后从生物反应器中吸取15毫升培养上清液。随后将管腔样本转移至无菌Falcon管中，并置于冰上。进行DNA分析时，使用5毫升注射器收集1至3毫升管腔液体。

以相同方式收集其他生物反应器中的上清液。为保留样品用于短链脂肪酸分析，取15毫升目标肠腔样品，离心后用注射器通过0.2微米孔径滤膜过滤上清液，并于-80摄氏度保存。为保留样品用于DNA分析，离心1毫升肠腔液体，并将沉淀物于-80摄氏度保存。

进行黏膜样本采集时，从4°C保存环境中取出制备好的黏蛋白载体，并开启氮气冲洗。迅速打开反应器盖子，将每个反应器中50%的载体更换为新的载体。当所有载体更换完毕后，迅速重新密封盖子，并继续维持氮气冲洗20分钟。

然后将0.25至0.5克黏蛋白载体琼脂分装至各个2毫升离心管中，于-80摄氏度保存，直至进行DNA提取。该系统每天自动循环三次。每次循环开始时，将140毫升定义培养基转移至胃生物反应器中，随后在pH控制条件下孵育1小时。

孵育结束后，将胃中的内容物连同60毫升胰液一起转移至小肠。在小肠生物反应器中，pH值自动调节至6.7至6.9，内容物继续孵育90分钟。在此孵育期间，每个系统的氮气冲洗开启，总时长为10分钟。

孵育结束时，小肠中的内容物被转移至升结肠，再从升结肠转移至横结肠，从横结肠转移至降结肠，最后从降结肠进入废弃物。在此具有代表性的主坐标分析中，菌群在第1天至第7天之间发生了显著变化。然而，自接种后第11天直至实验结束，基于操作分类单元的存在/缺失及丰度所计算的样本间距离得分显示，各样本在主坐标分析空间中占据了一个较小且稳定的区域。

对三种主要短链脂肪酸的测定结果显示，丙酸、丁酸和乙酸的含量从实验开始至接种后第15天持续波动。第15天之后，各结肠区域产生的这些酸的量保持稳定，直至实验结束仅有微小变化。对每个结肠区域腔内相和黏膜相稳定菌群的分析表明，在体外系统中各个结肠区域形成的菌群与粪便接种物的组成相似。

体外系统的α多样性比较显示，除升结肠区腔内样本外，其余各区域的多样性水平均与接种物相似。这表明该体外培养系统在群落组成和多样性方面均能产生与粪便接种物相当的微生物群落。采用本方案构建稳定的肠道微生物群落时，关键在于确保溶液配制准确，并在整个实验过程中维持厌氧条件和pH参数。

通过此步骤，可利用下一代DNA测序结合生物信息学分析检测样品的群落组成，并利用代谢组学分析其功能特性。