Name: 应用先进的体外培养技术研究人肠道微生物群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学习使用多阶段体外生物反应器系统培养人肠道微生物群，模拟结肠各区域的生理环境。该方法可在受控条件下研究微生物群动态变化，为肠道健康与疾病机制研究提供可靠平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Audrey Thomas-Gahring 女士在气相色谱-质谱联用（GC/MS）方面的工作。我们还要感谢 Massimo Marzorati 对手稿的编辑。

1. 材料与准备
注意：该化学成分明确的培养基以粉末形式购买（参见材料表）。每升培养基的成分为：阿拉伯半乳聚糖（1.2 g）、果胶（2.0 g）、木聚糖（0.5 g）、葡萄糖（0.4 g）、酵母提取物（3.0 g）、特殊蛋白胨（1.0 g）、黏蛋白（2.0 g）、盐酸半胱氨酸（0.2 g）。
<ol>
	<li>配制限定培养基
	<ol>
		<li>取一个 4 L 的烧瓶，加入 2 L 双蒸去离子水。</li>
		<li>向水中加入 29.2 g 限定培养基粉末，搅拌至完全均一。</li>
		<li>放入磁力搅拌子，并将瓶盖轻轻拧上，不要拧紧。</li>
		<li>在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。</li>
		<li>冷却后，将配制好的限定培养基置于 4 °C 冰箱中，并持续搅拌（使用磁力搅拌器）保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制胰液
	<ol>
		<li>在装有搅拌子的 5 L 容器中加入 2 L 蒸馏去离子水，在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。</li>
		<li>灭菌后，让水冷却至室温。</li>
		<li>加入 12.5 g NaHCO3、6 g 胆汁和 0.9 g 胰酶，置于磁力搅拌器上混合。 
		注意：胰液应每 2–3 天新鲜配制一次，配制后需在冰箱中持续搅拌保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磷酸盐缓冲液
	<ol>
		<li>将装有磁力搅拌子的 1 L 烧瓶置于磁力搅拌器上，加入 0.5 L 蒸馏去离子水，并开启搅拌。</li>
		<li>随后加入 6.8 g KH2PO4、8.8 g K2HPO4 和 0.1 g 硫代乙醇酸钠，加水定容至 1 L。</li>
		<li>待各组分完全溶解后，用 NaOH 调节 pH 至 7.0。</li>
		<li>将缓冲液倒入带螺口盖的 2 L 容器中，在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。注意瓶盖应轻轻拧上，不可完全密封。</li>
		<li>从高压灭菌器中取出后，让溶液冷却至室温。缓冲液可在室温下保存最多 2 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备黏蛋白琼脂载体
	<ol>
		<li>将塑料黏蛋白载体（见材料表）、镊子、塑料网（管状）和扎带在 131 °C 下高压灭菌 30 分钟。</li>
		<li>将 300 mL 双蒸去离子水在 131 °C 下高压灭菌 30 分钟，灭菌后于室温保存备用。</li>
		<li>在具有层流的生物安全柜中，使用无菌镊子将无菌培养皿中放入塑料黏蛋白载体。 
		注意：黏蛋白载体为中空塑料圆环，内部填充黏蛋白琼脂。填充后可盖上盖子，暂存备用。</li>
		<li>配制黏蛋白琼脂时，向 300 mL 灭菌水中加入 3 g 细菌琼脂和 15 g 猪黏蛋白。</li>
		<li>在通风橱中将该溶液煮沸，随后移离热源并冷却 1 分钟。重复煮沸和冷却过程共 3 次。</li>
		<li>当盛有黏蛋白琼脂溶液的玻璃容器冷却至可触碰时，将其转移至具有层流的生物安全柜中。</li>
		<li>在具有层流的生物安全柜中，将液态黏蛋白琼脂倒入已放置塑料黏蛋白载体的培养皿中，确保所有载体均被完全填充。</li>
		<li>将培养皿盖重新盖上，在层流条件下冷却。</li>
		<li>组装黏蛋白载体时，取已灭菌的塑料网，用无菌镊子将培养皿中已凝固的黏蛋白琼脂载体插入网中。</li>
		<li>使用扎带封闭网的两端。这样网袋可将填充了黏蛋白琼脂的载体固定其中。4 °C 保存至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 系统的设置、接种与运行
<ol>
	<li>培养系统的建立 
	注意： 本研究采用了人类肠道微生物生态系统双模拟器。
	<ol>
		<li>将10个含有搅拌子的生物反应器置于磁力搅拌器上，并开启搅拌。 
		注意： 每个单元包含5个生物反应器，因此2个单元需要10个生物反应器。</li>
		<li>使用硅胶管通过蠕动泵将5个生物反应器依次串联连接图1）。使用泵将流体内容物从一个生物反应器转移至下一个生物反应器。</li>
		<li>将生物反应器按以下顺序标记：胃、小肠、升结肠、横结肠、降结肠，以代表胃肠道的顺序。 
		注意： 生物反应器可以完全相同，或者胃和小肠生物反应器相较于结肠生物反应器更小，因为其容纳的体积较小。以这种方式设置生物反应器意味着升结肠区域从小肠获得营养物质，横结肠区域从升结肠区域获得营养物质，降结肠区域从横结肠区域获得营养物质。通过这种方式，该系统模拟了营养物质在胃肠道中的顺序性移动。</li>
		<li>将限定培养基和胰液置于4 °C冰箱中，并使用磁力搅拌器持续搅拌。使用硅胶管，通过蠕动泵将限定培养基连接至胃生物反应器，同时通过蠕动泵将胰液连接至小肠。</li>
		<li>向尿液引流袋中加入固化剂。通过蠕动泵将降结肠与尿液引流袋连接。实验过程中将固化的物质作为生物废弃物处理。</li>
		<li>使用硅胶管依次连接每个容器的水套，并将两端连接至循环水浴。向循环水浴中加入蒸馏水（加水量因所用循环水浴的类型而异），并设置温度为 37 °C。</li>
		<li>使用硅胶管，通过蠕动泵将酸液和碱液分别连接到每个容器的盖子上。推荐的浓度为 0.5 M HCl 和 0.5 M NaOH。</li>
		<li>将pH探针通过瓶盖上指定的孔口插入每个容器中。该孔口用于固定pH探针，并可旋紧在瓶盖上图1）。各区域pH设置如下：胃部，pH = 2；小肠，pH = 6.7–6.9；升结肠，pH = 5.6–5.9；横结肠，pH = 6.15–6.4；降结肠，pH = 6.6–6.9。 
		注意： 在初始阶段，群落将根据区域pH值的差异进行分化。然而，一旦开始喂养循环，群落将依据营养物质输入的差异进一步成熟。</li>
		<li>使用硅胶管将氮气管路连接至各容器盖上的指定接口。氮气管路的流向应按以下顺序：胃、小肠、升结肠、横结肠、降结肠。确保每个单元具有独立的冲洗系统，以避免交叉污染。 
		注意： 使用氮气去除系统中的氧气，并在实验过程中维持厌氧环境。</li>
		<li>通过每个生物反应器盖子上的指定端口插入金属取样管。该金属管向下延伸至生物反应器内部，用于采集液体样品。</li>
		<li>在样品管的顶端连接一小段硅胶管，并接上鲁尔锁接头，以便采样时使用注射器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>系统的接种
	<ol>
		<li>使用以下体积的定义培养基填充结肠各段：升结肠500 mL，横结肠800 mL，降结肠600 mL。</li>
		<li>将黏蛋白琼脂载体按反应器体积比例添加至结肠区域。本实验中，每个反应器使用60个载体。</li>
		<li>使用样品管和注射器移除多余的限定培养基，因为添加载体后会升高生物反应器中的液位。</li>
		<li>打开 pH 探头，通过计算机调节每个反应器中的 pH 值。</li>
		<li>打开氮气冲洗，持续20分钟。 
		注意： 用于接种的粪便匀浆购自10%粪便在10%甘油溶液中匀浆的产品（参见 材料表粪便样本从符合以下标准的供体池中随机选取：年龄在21至45岁之间、过去至少一年内未使用抗生素、体重指数（BMI）正常（18.5–24.9）、摄入典型西方饮食（非纯素食或素食）的美国人。本实验方案仅使用单一供体，但可根据实验设计进行调整。</li>
		<li>接种前，按照生产商的说明解冻粪便匀浆。</li>
		<li>通过取样口，使用60 mL注射器（升结肠25 mL，横结肠40 mL，降结肠30 mL）将粪便匀浆按反应器体积的5%加入，对每个结肠反应器进行接种。</li>
		<li>在生物反应器中过夜培养，同时控制pH值。</li>
		<li>过夜培养后，按照下文第3节所述，采集各结肠区域的管腔液体样本。采样完成后，启动计算机程序开始喂养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每日喂养周期 
	注意： 每日喂食周期由计算机自动控制。
	<ol>
		<li>每天三次，向胃生物反应器中泵入 140 mL 定义培养基，并孵育 1 小时。</li>
		<li>孵育1小时后，将胃内容物泵入小肠。同时，将60 mL胰液泵入小肠。</li>
		<li>在小肠中，调节pH至6.7–6.9，使混合物孵育90分钟。孵育期间，对每个系统开启氮气冲洗，每次共10分钟。</li>
		<li>90分钟孵育后，同时启动从小肠到升结肠、升结肠到横结肠、横结肠到降结肠以及降结肠到废液端的泵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验时间线 
	注意： 这 此处使用的体外系统以连续方式运行，持续时间约为8周。以下为推荐的实验时间表，但可根据实验的具体需求和目标进行调整。
	<ol>
		<li>按照步骤2.1中列出的步骤建立系统。</li>
		<li>根据以下方案收集过夜培养的样品。按照上述方案，开始每日三次的传代培养周期。</li>
		<li>进行实验，总共持续2周，以使细菌达到稳定状态。 
		注意： 运行系统意味着维持pH值，每日进行三次喂养循环，并每周更换黏膜载体2-3次。</li>
		<li>稳定后，以对照期进行为期2周的实验。</li>
		<li>对照期结束后，使用该系统测试不同组分或变量，此阶段称为处理期。</li>
		<li>处理期结束后，停止添加任何组分或变量，并将条件恢复至正常状态。此阶段称为洗脱期，用于判断对群落造成的变化是否具有持久性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从系统中采集样本
注意：在实验过程中，可根据以下指南，在任何时间点从任一区域的管腔相或黏膜相中采集样本。
<ol>
	<li>采集管腔样本
	<ol>
		<li>通过延伸至培养液中部的取样口采集管腔液体样本。首先使用70%乙醇或小型酒精棉片清洁取样口的鲁尔锁接口，并静置使其自然干燥。</li>
		<li>确保30 mL注射器内无空气后，将其连接至取样口。反复抽吸3–5次，以充分混匀反应器内的组分。随后，抽取总共30 mL的培养液。</li>
		<li>根据需要将管腔样本分装至无菌离心管中，并置于冰上保存。取样完成后，立即将样本转移至-80 °C超低温冰箱中保存。</li>
		<li>用于短链脂肪酸（SCFA）分析时，取15 mL管腔样本在4 °C、5,000 × g 条件下离心10分钟。使用PES材质的0.2 μm滤膜对上清液进行注射器过滤。将滤过的上清液于-80 °C保存。
		<ol>
			<li>用于DNA分析时，取1 mL管腔液体在4 °C、5,000 × g 条件下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀物于-80 °C保存。</li>
			<li>作为备份，大多数实验建议额外保存10 mL管腔液体于-80 °C。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集黏膜样本 
	注意：每2–3天更换一次黏膜载体。
	<ol>
		<li>从冰箱中取出预先准备好的黏蛋白载体。</li>
		<li>开启氮气冲洗，并迅速打开反应器盖子。取出50%的黏蛋白载体，并替换为新的载体。</li>
		<li>迅速密封盖子，并持续通入氮气冲洗20分钟。</li>
		<li>用于DNA提取时，将0.25–0.5 g琼脂分装至2 mL离心管中，保存于-80 °C直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. DNA 提取、测序与分析
注意：采用CTAB DNA提取法并在通风橱中进行物理匀浆来提取DNA29。提取后，使用分光光度计测定每个样本中DNA的含量。
<ol>
	<li>配制CTAB缓冲液
	<ol>
		<li>将4.2 g K2HPO4 和4.09 g NaCl 溶解于200 mL去离子蒸馏水中，然后在121 °C下高压灭菌30分钟。</li>
		<li>让溶液冷却至室温。</li>
		<li>加入10 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），在60 °C下加热并搅拌。</li>
		<li>待CTAB完全溶解后，将溶液从热源移开，并冷却至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制PEG-6000溶液
	<ol>
		<li>将300 g聚乙二醇6000和93.5 g NaCl溶解于1 L去离子蒸馏水中。</li>
		<li>待所有颗粒完全溶解后，在121 °C下高压灭菌30分钟。</li>
		<li>灭菌后，将溶液冷却至室温后再使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行DNA提取
	<ol>
		<li>向2 mL样品管中加入500 μL CTAB缓冲液和500 μL苯酚-氯仿-异戊醇，涡旋混匀。</li>
		<li>将样品管中的全部内容物转移至0.1 mm物理匀浆管中（见材料表）。</li>
		<li>使用物理匀浆器在最高转速下匀浆20秒，重复两次，中间间隔20秒（见材料表）。</li>
		<li>将匀浆后的管子在3,000 x g下离心5分钟。</li>
		<li>将300 μL上清液转移至一个新的1.7 mL洁净离心管中，并向原管中加入500 μL CTAB缓冲液。</li>
		<li>按照步骤4.3.2–4.3.3的方法再次匀浆该管，并在3,000 x g下离心5分钟。</li>
		<li>离心后，再将300 μL上清液转移至已含有600 μL液体的新管中。</li>
		<li>向含有600 μL上清液的管中加入总共600 μL氯仿-异戊醇。</li>
		<li>颠倒混匀管子，短暂离心，然后将500 μL上层相转移至一个新的1.7 mL洁净离心管中。确保仅吸取上层相。</li>
		<li>接着，向管中加入1000 μL PEG-6000溶液，颠倒混匀，然后在室温下孵育2小时。</li>
		<li>孵育结束后，在18,200 x g、4 °C条件下离心10分钟。</li>
		<li>弃去上清液，并用预冷的70%乙醇清洗沉淀。</li>
		<li>再次在18,200 x g、4 °C条件下离心10分钟，弃去上清液，将沉淀置于生物安全柜的层流条件下干燥。</li>
		<li>沉淀干燥后，向每管中加入75 μL无RNA酶、无DNA酶、无菌的水。</li>
		<li>使用分光光度计对重悬的DNA进行定量，随后送样进行16S rRNA基因测序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 短链脂肪酸（SCFA）检测与分析
<ol>
	<li>将冷冻样品在40°C下解冻30分钟，并使用乙醚以2:1（v:v）的比例提取短链脂肪酸。</li>
	<li>将有机相转移至配备色谱柱（30 m，0.25 mm内径，0.25 µm，参见材料表）的气相色谱-质谱联用仪（GC/MS，参见材料表），进样量为10 µL。</li>
	<li>设置进样口温度和初始柱温分别为260 °C和125 °C。保持初始温度1分钟，随后在11.5分钟内升至250 °C，柱流速为1 mL/min。 
	注意：质谱离子源温度为220°C，接口温度为250°C。</li>
	<li>使用标准曲线并以2-甲基己酸作为内标物，定量各短链脂肪酸（SCFA）的含量。</li>
</ol>

<ol><li>Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+mucus+layers+of+colon+are+organized+by+the+MUC2+mucin%2C+whereas+the+outer+layer+is+a+legislator+of+host-microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).</li>
<li>Xu, J., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honor+thy+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Honor thy symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).</li>
<li>Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+normal+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of the normal gut microbiota.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).</li>
<li>Macfarlane, G., Macfarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+intestinal+fermentation%3A+association+between+food+components%2C+delivery+systems%2C+bioavailability+and+functional+interactions+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).</li>
<li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulating+distal+gut+mucosal+and+luminal+communities+using+packed-column+biofilm+reactors+and+an+in+vitro+chemostat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabinoxylans%2C+inulin+and+Lactobacillus+reuteri+1063+repress+the+adherent-invasive+Escherichia+coli+from+mucus+in+a+mucosa-comprising+gut+model%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+and+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016(2016).</li>
<li>Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+selects+mucosal+and+luminal+associations+of+coevolved+gut+microorganisms%3A+a+novel+concept%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+a+mucosal+environment+in+a+dynamic+gut+model+results+in+a+more+representative+colonization+by+lactobacilli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli.</a> Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).</li>
<li>Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome-host+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome-host interactions in health and disease.</a> Genome Medicine. 3 (3), 14(2011).</li>
<li>Wissenbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+metabolomics+of+defined+in+vitro+gut+microbial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems.</a> International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).</li>
<li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microbial+community+reproducibility%2C+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li>
<li>Venema, K., van den Abbeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+and+Research.+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Experimental models of the gut microbiome.</a> Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).</li>
<li>Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+functions+of+gut+microbiota+metabolism+impacting+host+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).</li>
<li>Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anxiety%2C+Depression%2C+and+the+Microbiome%3A+A+Role+for+Gut+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides.</a> Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).</li>
<li>Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Axenic+Larvae+Colonization+with+Human+Intestinal+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota.</a> Zebrafish. 00 (00), (2017).</li>
<li>Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaped+fecal+gut+microbiota+composition+by+the+intake+of+high+molecular+weight+persimmon+tannin+in+normal+and+high-cholesterol+diet-fed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Function%22%5BJournal%5D)">Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats.</a> Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).</li>
<li>Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Hale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+Versus+Phylogeny%3A+a+Comparison+of+Gut+Microbiota+in+Captive+Colobine+Monkey+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species.</a> Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+contributes+to+longitudinal+diversity+of+fecal+microbiota+in+swine+selected+for+lean+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth.</a> Microbiome. 6 (1), 4(2018).</li>
<li>Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+in+vitro+human+gut+fermentation+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling.</a> Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).</li>
<li>Muegge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+drives+convergence+in+gut+microbiome+functions+across+mammalian+phylogeny+and+within+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans.</a> Science. 332 (6032), 970-974 (2011).</li>
<li>Santiago-Rodriguez, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemostat+culture+systems+support+diverse+bacteriophage+communities+from+human+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces.</a> Microbiome. 9 (3), 58(2015).</li>
<li>Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastrointestinal+microbiota+as+a+site+for+the+biotransformation+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).</li>
<li>Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combined+LC-MS+Metabolomics-+and+16S+rRNA+Sequencing+Platform+to+Assess+Interactions+between+Herbal+Medicinal+Products+and+Human+Gut+Bacteria+in+Vitro%3A+a+Pilot+Study+on+Willow+Bark+Extract%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract.</a> Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).</li>
<li>Cueva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fermentation+of+grape+seed+flavan-3-ol+fractions+by+human+faecal+microbiota%3A+changes+in+microbial+groups+and+phenolic+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites.</a> FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).</li>
<li>Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+5-step+multi-chamber+reactor+as+a+simulation+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apigenin+Impacts+the+Growth+of+the+Gut+Microbiota+and+Alters+the+Gene+Expression+of+Enterococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus.</a> Molecules. 22 (8), (2017).</li>
<li>Caporaso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li>
<li>Cole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+Database+Project%3A+data+and+tools+for+high+throughput+rRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).</li>
<li>Liu, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+mucosal+gut+microbial+community+in+vitro+using+an+artificial+simulator%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator.</a> PLoS ONE. 13 (7), e0197692(2018).</li>
<li>Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+de+Wiele%2C+T+%22The+Impact+of+Food+Bio-Actives+on+Gut+Health%22">The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer Link. (2015).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate-producing+Clostridium+cluster+XIVa+species+specifically+colonize+mucins+in+an+in+vitro+gut+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model.</a> The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).</li>
<li>Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-DGGE-based+quantification+of+stability+of+the+microbial+community+in+a+simulator+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem.</a> FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).</li>
<li>Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of short-chain fatty acids in health and disease.</a> Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).</li>
<li>Yang, J., Kweon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota%3A+a+key+regulator+of+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases.</a> BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).</li>
<li>Sonnenburg, J., Bäckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-microbiota+interactions+as+moderators+of+human+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism.</a> Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).</li>
</ol>

作者不存在竞争性经济利益。本出版物中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部是一个提供平等机会的供应商和雇主。

已开发出体外培养系统用于研究大肠的肠道微生物群。这些系统采用专门设计的装置，模拟胃肠道的生理条件，促进结肠各区域成熟肠道微生物群落的生长33。尽管这一概念合乎逻辑且易于理解，但实际运行用于研究肠道微生物群的体外培养系统需要精确操作，并充分了解获得可靠结果所必需的条件和预期要求。
体外肠道微生物群实验所需满足的条件是：接种后微生物群落必须达到稳定状态，并且必须维持粪便接种物中的微生物多样性。如果实验操作得当，这两个必要条件能够被快速且可重复地实现。实验方案中影响系统稳定性和多样性的关键步骤包括：定义培养基和胰液的配制必须准确，且这些底物的供给需保持一致；实验过程中必须维持厌氧条件；各肠段的pH值必须在时间进程中精确控制。实验期间若上述三个参数发生改变，可能导致微生物种群波动以及代谢产物生成的不一致。
使用此类多阶段体外系统具有多种优势。值得注意的是，它们能够模拟结肠的不同区域。此外，这些系统还可被设计用于模拟食物在上消化道中的体外消化过程，包括来自唾液的酶组分，以及胰酶和胆汁的添加...

肠道微生物群是定植于人体胃肠道（GIT）中的一群微生物。&#160; 该微生物群在结肠中的浓度最高，估计含有 1013-1014 个细菌，来自 500 至 1,000 个物种，与结肠微环境处于共生状态1,2。肠道微生物群的组成和功能在胃肠道内沿空间分布发生变化，形成具有区域特异性的微生物群落，其中远端区域的多样性最高2,3,4,5。在每个解剖区域，管腔内和黏膜层上分别存在独立的微生物群落6。管腔中的微生物群可更直接地获取随管腔内容物移动的营养物质作为底物7。尽管如此，部分细菌优先定植于黏液层，利用结肠细胞产生的黏蛋白作为能量来源1,5,8。管腔相与黏膜相之间微环境的差异导致了微生物群落的分化，并促进了相特异性群落的形成。这些微生物群落共同发挥代谢功能，如营养物质代谢和维生素合成，以及免疫功能，例如抑制人类病原体的定植1,3,9。肠道微生物群在功能上还与人体结肠细胞协同作用3。
作为人体胃肠道（GIT）的重要组成部分，肠道微生物群对宿主的健康和疾病状态具有影响也就不足为奇了3,9,10,11,12。肠道微生物群落的变化已与多种人类疾病相关，包括肠易激综合征（IBD）和肠易激综合征（IBS）等胃肠道疾病，也包括肥胖、循环系统疾病和自闭症等其他疾病3,9,10,11,12。&#160; 肠道微生物群产生的代谢物具有全身性影响，可作用于远离肠道的部位12,13。例如，肠-脑轴与焦虑和抑郁等精神障碍相关14。因此，研究肠道微生物群对多个研究领域都具有重要意义，并可应用于许多疾病，甚至包括那些通常被认为与胃肠道无关的疾病。
尽管研究肠道微生物群的重要性已被广泛认可，但这一研究领域十分复杂。目前可选用多种动物模型，从小型动物如斑马鱼、大鼠和小鼠，到大型动物如猴子和猪15-19。然而，将这些动物模型应用于人类肠道微生物群的研究并不直接可行，因为这些动物拥有基于其环境和饮食演化而来的独特细菌群落，且在解剖结构上与人类存在差异20,21。使用人类受试者虽可消除相关性问题，却带来了另一系列挑战。人类研究成本高昂、耗时较长，并受到伦理限制11。此外，人类研究中存在多种混杂因素会影响肠道微生物群，包括年龄或发育阶段、环境、饮食、药物使用以及遗传因素等2,4,22。&#160; 此外，对于可在人体中进行的实验内容、可采集的样本类型以及采样时间点也存在诸多限制4。&#160;
使用该方法的一个关键缺点是 体内 研究肠道微生物群的一个系统性问题是哺乳动物成分的存在。肠道微生物群与人类细胞之间相互作用，且在这一过程中 体内 在该条件下，无法区分两者。肠道微生物群产生的代谢物会被结肠细胞吸收，因此无法精确计算其含量。因此，任何机制性研究都只能局限于终点测量。11体内研究的另一个主要缺点是无法纵向采集胃肠道不同区域的样本23这无法评估结肠微环境随时间可能发生的变化12.&#160; 许多 体内 研究（包括人体研究）依赖于粪便样本的分析，以检测肠道微生物群的变化12虽然这一方法具有一定的信息量，但它无法提供整个胃肠道中肠道微生物群的数据，也无法区分管腔内微生物群落与黏膜相关微生物群落。5,6,7,8.
对于肠道微生物群，需要采用体外方法来研究细菌群落的动态变化，从而避免哺乳动物成分的干扰。使用体外方法可严格控制环境条件10，同时测试多个参数，并能够进行纵向且大体积的取样11。由于体外方法依赖机械装置而非宿主，因此无需考虑年龄、环境、饮食或遗传背景等因素。这些系统可用于测试完整的肠道微生物群落、特定选定的微生物，甚至单一菌株。重要的是，体外实验结果具有可重复性，同时仍保持与体内研究相当的多样性水平11,22。
根据所研究的假设和期望的结果，i体外 研究可以通过多种方式进行。&#160; 它们可以采用单容器系统和简单方法，例如将样品与粪便匀浆液共同孵育。24 或在24-48小时内进行单批次培养25也可以使用单容器系统和更复杂的方法来实现，例如利用恒化器系统建立稳定的肠道微生物群落11然而，使用单一反应器可能会过度简化微生物群落12 因为它仅代表结肠的一个部分，尽管结肠由升结肠、横结肠和降结肠组成。
为了研究结肠不同区域（升结肠、横结肠和降结肠）中形成的肠道微生物群落，可采用一种复杂的多阶段系统。在这些系统中，设置多个反应器以模拟结肠的不同区域，从而分别独立培养升结肠、横结肠和降结肠的肠道微生物群。这些反应器通过泵连接，使底物依次从升结肠区域流向横结肠区域，再流向降结肠区域，模拟营养物质在胃肠道中的流动过程。
本研究的目的是展示如何利用五阶段体外培养系统（见材料表）来培养肠道微生物群落，并展示该群落在稳定性和组成方面的群落动态。在该系统中，一个反应器代表胃，另一个代表小肠。结肠被分为三个区域（升结肠、横结肠、降结肠），每个区域由一个独立的反应器表示26。在本实验设计中，两个完整的系统并行运行，其中1号单元含有黏蛋白载体以模拟黏膜表面，2号单元则不含黏蛋白载体。通过16S rRNA基因测序和短链脂肪酸（SCFA）分析，比较了各区域腔内相和黏膜相中形成的微生物群落随时间的变化，并与粪便接种物进行对比。所呈现的结果展示了此类体外系统能够产生的微生物群落类型，包括其组成和功能特性。

<table><tbody><tr><td>TWINSHIME</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>定义培养基（含淀粉的成人M-SHIME生长培养基）</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 软管</td><td>cole Parmer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>尿液引流袋</td><td>Bard</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Labsorb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>粪便样本</td><td>Openbiome</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Becton Dickson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>定义培养基</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>牛胆盐（Oxgall Bile）</td><td>Becton Dickson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>胰酶（Pancreatin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>玻璃器皿</td><td>Ace Glass</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>猪黏蛋白（Porcine mucin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>灭菌袋</td><td>VWR</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>BeadBug</td><td>Benchmark Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Triple-Pure 高强度氧化锆珠击打管，0.1 mm</td><td>Benchmark Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>无RNA酶、无DNA酶、无菌水</td><td>Roche</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>岛津 QP2010 Ultra 气相色谱-质谱联用仪</td><td>Shimadzu</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stabilwax-DA 色谱柱，30 m，0.25 mm 内径，0.25 &amp;micro;m</td><td>Restek</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>塑料黏蛋白载体</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

应用先进的体外培养技术研究人类肠道微生物群

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

人类肠道微生物群在健康与疾病中均发挥着至关重要的作用。由于其结构复杂，且与哺乳动物各组分存在广泛关联，使用体内模型研究肠道微生物群具有较大难度。本实验方案的目标是在体外培养肠道微生物群，从而可在无需考虑哺乳动物微环境影响的前提下，研究肠道微生物群的动态变化。通过采用体外培养技术，可模拟胃肠道的生理条件，包括pH、温度、厌氧环境以及转运时间等参数。通过添加黏蛋白包被的载体以模拟结肠的肠黏膜表面，形成黏膜相，从而增加模型的复杂性。通过接种人粪便样本引入肠道微生物群。在接种这一复杂的细菌混合物后，特定微生物会在体外模型的不同纵向（升结肠、横结肠和降结肠）及横向（管腔相和黏膜相）环境中被选择性富集。关键步骤是使系统达到稳态，即微生物群落及其代谢产物保持稳定。本文的实验结果展示了接种后的肠道微生物群如何随时间逐步发展为稳定的群落结构。一旦达到稳态，该系统可用于分析细菌间的相互作用与群落功能，或用于检测各类添加剂（如食物、食物成分或药物）对肠道微生物群的影响。

上述方案描述了用于研究结肠肠道微生物群的五级体外系统的建立、接种与运行流程。为生成下文所示数据，在完成 DNA 提取后，采用高通量测序技术对 V1V2 区进行了 16S rRNA 标记基因 DNA 测序。, MiSeq Illumina 平台）由费城儿童医院微生物组中心完成27QIIME（微生物生态学定量分析）1.9版28 使用该软件处理测序数据，并在R统计计算环境中进行统计分析。29分类学归属的确定使用了 Greengenes 16S 参考数据库。30,31OTU相对丰度值通过将OTU读数除以样本总读数计算得出。短链脂肪酸水平采用所述方案进行定量。
体外</s...

本文介绍了一种在体外培养结肠肠道微生物群的实验方案, 使用一系列生物反应器模拟胃肠道的生理条件。

人类肠道微生物群在人体健康与疾病中发挥着至关重要的作用。由于其复杂性，利用体内模型研究肠道微生物群十分困难。

本实验方案的目的是在体外培养肠道微生物群，从而能够在不考虑现代组分影响的情况下研究微生物群的动态变化。利用这种多阶段体外系统，可同时启动并计数结肠多个区域的管腔内及黏膜相关微生物群落的发育情况。由于该体外系统的复杂性，对该方法进行可视化演示非常有帮助。首先，向升结肠中加入 500 毫升的定义培养基，向横结肠中加入 800 毫升的定义培养基，向降结肠中加入 600 毫升的定义培养基。根据反应器体积按比例向结肠各区域添加黏蛋白微载体，并使用取样管和注射器从每个反应器中移除多余的定义培养基。使用 pH 探针调节每个反应器中的 pH 值，并开启氮气冲洗 20 分钟。接下来，按照制造商的说明解冻粪便匀浆，然后用粪便匀浆样品装填一支 60 毫升的注射器。然后，通过取样口向每个结肠反应器接种相当于反应器体积5%的匀浆液，进行过夜培养，并控制pH。次日早晨，用酒精清洁每个生物反应器取样口的鲁尔锁接口。待接口干燥后，将已排尽空气的30毫升注射器连接至其中一个取样口。将活塞抽拉三到五次，以确保充分混合反应器中的组分，然后从生物反应器中吸取15毫升培养上清液。随后将管腔样本转移至无菌Falcon管中，并置于冰上。进行DNA分析时，使用5毫升注射器收集1至3毫升管腔液体。以相同方式收集其他生物反应器中的上清液。为保留样品用于短链脂肪酸分析，取15毫升目标肠腔样品，离心后用注射器通过0.2微米孔径滤膜过滤上清液，并于-80摄氏度保存。为保留样品用于DNA分析，离心1毫升肠腔液体，并将沉淀物于-80摄氏度保存。进行黏膜样本采集时，从4°C保存环境中取出制备好的黏蛋白载体，并开启氮气冲洗。迅速打开反应器盖子，将每个反应器中50%的载体更换为新的载体。当所有载体更换完毕后，迅速重新密封盖子，并继续维持氮气冲洗20分钟。然后将0.25至0.5克黏蛋白载体琼脂分装至各个2毫升离心管中，于-80摄氏度保存，直至进行DNA提取。该系统每天自动循环三次。每次循环开始时，将140毫升定义培养基转移至胃生物反应器中，随后在pH控制条件下孵育1小时。孵育结束后，将胃中的内容物连同60毫升胰液一起转移至小肠。在小肠生物反应器中，pH值自动调节至6.7至6.9，内容物继续孵育90分钟。在此孵育期间，每个系统的氮气冲洗开启，总时长为10分钟。孵育结束时，小肠中的内容物被转移至升结肠，再从升结肠转移至横结肠，从横结肠转移至降结肠，最后从降结肠进入废弃物。在此具有代表性的主坐标分析中，菌群在第1天至第7天之间发生了显著变化。然而，自接种后第11天直至实验结束，基于操作分类单元的存在/缺失及丰度所计算的样本间距离得分显示，各样本在主坐标分析空间中占据了一个较小且稳定的区域。对三种主要短链脂肪酸的测定结果显示，丙酸、丁酸和乙酸的含量从实验开始至接种后第15天持续波动。第15天之后，各结肠区域产生的这些酸的量保持稳定，直至实验结束仅有微小变化。对每个结肠区域腔内相和黏膜相稳定菌群的分析表明，在体外系统中各个结肠区域形成的菌群与粪便接种物的组成相似。体外系统的α多样性比较显示，除升结肠区腔内样本外，其余各区域的多样性水平均与接种物相似。这表明该体外培养系统在群落组成和多样性方面均能产生与粪便接种物相当的微生物群落。采用本方案构建稳定的肠道微生物群落时，关键在于确保溶液配制准确，并在整个实验过程中维持厌氧条件和pH参数。通过此步骤，可利用下一代DNA测序结合生物信息学分析检测样品的群落组成，并利用代谢组学分析其功能特性。

applying-advanced-vitro-culturing-technology-to-study-human-gut

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

应用先进的体外培养技术研究人肠道微生物群

来源：Ahmadi, S.，等。一种用于评估干预方案对人类粪便微生物群影响的体外批次培养模型。J. Vis. Exp.

体外 批式培养模型模拟人肠道菌群的结肠发酵

在本视频中，我们介绍了建立一个 离体 用于研究小鼠肠组织片段与特定肠道细菌相互作用的肠道器官培养系统。该装置包含两对进出液端口，第一对连接肠组织管腔并将其与特定细菌悬液相连，第二对持续向装置的孔中供给培养基以维持 离体...

一种用于研究宿主-微生物群相互作用的离体肠道器官培养系统

我们介绍了一种从手术组织和活检样本中获取的小肠隐窝和结肠隐窝建立人类肠类器官和结肠类器官的方法。在这篇方法学文章中，我们介绍了成功培养和维持人类肠类器官与结肠类器官所必需的培养模式。...

从完整组织和活检样本建立人上皮类肠体和类结肠体

本文描述了一种从小鼠小肠类器官中收获、维持并用病原体相关分子模式（PAMPs）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

该 离体 小鼠肠道类器官的培养与模式识别受体刺激

在肠道芯片微流控装置中将活性微生物组与微工程化人肠绒毛共培养

16S rRNA扩增子测序法表征粪便微生物的标准化操作流程

采用一种新颖的方法评估肠道宿主-微生物相互作用，该方法结合了合成口腔菌群、体外胃肠道消化以及小肠上皮模型。本文介绍了一种可灵活应用于评估病原体细胞侵袭、多物种生物膜形成，甚至益生菌制剂存活能力的方法。...

评估合成细菌群落在其上的存活能力 体外 肠道宿主-微生物界面

本方案描述了一种体外批次培养发酵系统，用于研究人类粪便微生物群。通过使用菊粉（一种广为人知的益生元，也是研究最广泛的微生物群调节剂之一），展示该系统在评估特定干预措施对粪便微生物群组成及代谢活性影响中的应用。...

一种体外批次培养模型用于评估干预方案对人类粪便菌群的影响

本文描述了一种利用体外批次发酵系统研究内源性物质与人类肠道微生物群相互作用的实验方案。...

利用体外批次发酵系统分析内源性代谢物与人体肠道微生物群的相互作用

本文介绍了一种利用新型肠道器官培养系统分析宿主-微生物组相互作用的独特方法 离体 实验。...

一种用于分析宿主-微生物群相互作用的肠道类器官培养系统

本方案详细介绍了用于在厌氧条件下进行复杂粪便菌群连续流培养的微型生物反应器阵列的组装方法。我们还讨论了反应器的组装、接种以及取样方法，以便后续分析。...

复杂粪便菌群连续培养的生物反应器组装

学习使用多阶段体外生物反应器系统培养人肠道微生物群，模拟结肠各区域的生理环境。该方法可在受控条件下研究微生物群动态变化，为肠道健康与疾病机制研究提供可靠平台。

应用先进的体外培养技术研究人类肠道微生物群

探索更多视频