微电极穿刺法记录灌流中脑动脉的膜电位

本方案可用于测量正常和病变血管的膜电位，并评估调节膜电位、血管张力和血流的药理学试剂。该技术测得的膜电位接近生理范围，因为血管内的血管平滑肌处于合胞体状态。在开始实验前，将双通道差分式电生理放大器放置在靠近血管浴槽的所需位置。

使用 BNC-BNC 电缆将放大器通道 A 或 B 的输出端连接到数字化仪的通道输入端。将探头安装在显微操作器上，并将显微操作器移向放置在无振动台上的显微镜和肌动图仪。根据说明书中的描述，将放大器前面板上的旋钮和开关置于适合实验的相应位置。

然后使用适当的电极将浴槽接地端连接到放大器的电路接地端，并确保屏蔽笼已接地至放大器的机壳。制备硼硅酸盐玻璃微电极时，使用标准拉制仪拉制出短而平缓、长度为8至10毫米、末端直径小于1微米的锥形结构，若需获得更高的电阻和更小的尖端，可进行两次拉制。使用微纤维注射器将3摩尔氯化钾溶液注入微电极中，在注射过程中缓慢回撤活塞，以留出空间使液体充分填充，并防止微电极内部产生气泡。

将完全装填好的微电极放置到微电极夹持器上，通过钻孔小心而牢固地将电极柄推入夹持器中。用实验用纸巾去除多余的液体，并将电极夹持器组件连接至放大器探头。进行电极测试以测量电极电阻。

然后打开记录软件，为文件命名，并保存文件以供后续分析。接着，用蒸馏水冲洗肌动描记室数次，然后向室内加入五毫升正常生理盐溶液（PSS）。使用5毫升或10毫升注射器，将过滤后的正常PSS充满两个玻璃套管及相连的管路，避免引入气泡，并使用钝头镊子将两根10-0单丝尼龙缝线打成半结。

然后，在解剖显微镜下使用解剖镊子，将部分闭合的缝合结放置在两根套管上，位置略远离套管尖端。进行大脑中动脉分离时，使用弹簧剪刀和镊子识别并游离出大鼠脑部一段无分支的大脑中动脉，其内径为 100 至 200 微米。用精细镊子将大脑中动脉套入玻璃套管上，并收紧缝线以将血管固定在套管上。

封闭远端套管，使动脉内无液体流动，并将流入端移液管连接至生理盐水溶液（PSS）储液器。使用安装在倒置显微镜上的电荷耦合器件相机及成像软件观察套管插入的中脑动脉。调整大脑中动脉的轴向长度至适当长度，使其外观既不僵硬也不松弛。

在37摄氏度下，用95%氧气和5%二氧化碳平衡浴液。将放大器的接地端浸入肌动图仪的PSS中。照亮血管腔室，并通过显微镜在浴液中观察微电极的尖端。

使用显微操作器将微电极尖端移至血管外壁附近，并开始记录。缓慢将微电极尖端向血管方向移动，目标为血管中心。当电极尖端接近血管时，迅速向前推进电极，以刺穿肌细胞膜。

一旦膜被穿透，即可观察到膜电位的变化。膜被刺入后，切勿触碰显微操作器。记录完膜电位变化后，使用操作器迅速将微电极一次性移出，并在保存数据文件前停止记录。

当电位迅速偏转至负值、膜电位稳定至少30秒，并且在移除电极时电压迅速回到零毫伏时，视为穿刺成功。在成功穿刺并稳定膜电位后，可将感兴趣的药物灌流至浴液中，并记录膜电位的变化。在此代表性实验中，氯化钾灌流使膜电位去极化约6毫伏，而灌流大电导钙激活钾通道的钙依赖性激活剂则使膜电位超极化近4毫伏。

最重要的是要拉制出具有高电阻、短而平缓锥形且直径小于一微米的微电极。