微电极镀膜法记录从可吸入性中脑动脉的膜电位
July 2nd, 2019
本文的主要目的是提供如何使用微电极浸渍法记录中脑动脉膜电位(Vm)的详细信息。可加法的中脑动脉得到平衡,以获得造血性音,使用高电阻微电极刺穿血管壁。
该协议可用于测量正常和患病血管的膜电位，并评估调节膜电位、血管色调和血液流动的药理剂。这种技术产生的膜电位接近生理范围，因为血管平滑肌肉在血管中是同步的。在开始该步骤之前，将双通道差分电表放大器放在所需位置的容器室附近。
使用 BNC-BNC 电缆将放大器通道 A 或 B 的输出连接到数字化器的通道输入。将探针安装在微操纵器中，将微操纵器转向无振动桌子上的显微镜和图像仪。如手册所述，将放大器前部的旋钮和开关放在实验的适当位置。
然后用适当的电极将浴场连接到放大器的电路接地，并确保保持架接地到放大器的机箱上。要准备硅酸盐玻璃微电子，请使用标准拉拔器实现直径小于一微米的短、渐进、8 至 10 毫米锥度，循环两次，以实现更高的电阻和较小的尖端。使用超纤维注射器向微电杆填充三摩尔氯化钾，在注射过程中缓慢缩回柱塞，以便让液体充满空间，并防止微电子内形成气泡。
将满载的微电极放在微电极支架上，小心而坚定地通过钻孔将电极柄推入支架。用实验室组织去除多余的液体，然后将电极支架组件连接到放大器探头。执行电极测试以测量电极电阻。
然后打开录制软件，为文件分配名称，然后保存该文件以进行将来分析。接下来，用蒸馏水冲洗图像室几次，然后用五毫升的正常生理盐溶液（PSS）装入室。使用 5 或 10 毫升注射器，用过滤的正常 PSS 填充玻璃罐和附加的管子，而不引入任何气泡，并使用钝钳在两个 10-0 单丝尼龙缝合线中制作半结。
然后，在解剖显微镜下使用解剖钳，将部分封闭的缝合结放在两个牙尖上稍远离尖端。对于中脑动脉隔离，使用弹簧剪刀和钳子来识别和解剖中脑动脉的未支段，内径为100至200微米，大鼠大脑。使用细钳将中脑动脉安装到玻璃罐上，并拧紧缝合线，将动脉固定到动脉上。
关闭端管，使动脉内没有流量，并将流入移液器连接到 PSS 储液罐。使用安装在倒置显微镜和成像软件上的电荷耦合设备摄像机可视化可调中脑动脉。将 MCA 的轴向长度设置为近似长度，使其看起来既不硬，也不松弛。
在 37 摄氏度下，用 95% 的氧气和 5% 的二氧化碳平衡沐浴液。将放大器的地面浸入刻画的 PSS 中。照亮容器室，并通过显微镜在沐浴液中可视化微选择尖端。
使用微操纵器，将微电杆的尖端移近血管外壁，然后开始记录。缓慢地将微电子的尖端向容器移动，瞄准容器的中心。当尖端靠近容器时，以一个快速运动向前推进电极，刺穿肌肉的膜。
一旦膜被穿透，膜电位的变化可能会观察到。膜被刺穿后，不要触摸微操纵器。记录膜电位变化后，使用操纵器在一次快速移动中移除微选择，并在保存数据文件之前停止记录。
当快速偏转至负值时，当膜电位稳定至少 30 秒，并且当移除电极时，电压突然返回为零毫伏时，则计算是成功的。成功浸渍和膜电位稳定后，感兴趣的药物可以注入到浴池中，并记录膜电位的变化。在这个具有代表性的实验中，氯化钾灌注使膜脱极约6毫伏，而用钙依赖的活化剂大量导电钙活性钾通道使膜高极化近4毫伏。
要记住的最重要的事情是拉高耐微电杆，具有短，逐渐锥度小于一微米直径。
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概述
本文详细介绍了使用微电极穿刺法记录中脑动脉膜电位（V m）的协议。该技术可以测量正常和病变血管的膜电位。
关键研究组成部分
科学领域
- 电生理学
- 血管生物学
- 药理学
背景
- 中脑动脉对大脑血流至关重要。
- 了解膜电位对于评估血管张力至关重要。
- 该方法可以评估影响血流的药理学药剂。
- 由于血管平滑肌同源体，膜电位接近生理范围。
研究目的
- 提供详细的测量膜电位的协议。
- 评估药理学药剂对血管张力的影响。
- 增强对健康和疾病状态下血流调节的理解。
使用的方法
- 使用双通道差分电压计放大器。
- 通过BNC-BNC电缆将放大器连接到数字转换器。
- 将探针安装在微操作器中以实现精确定位。
- 根据实验手册调整放大器设置。
主要结果
- 成功测量中脑动脉的膜电位。
- 证明该技术适用于正常和病变血管。
- 验证记录的膜电位的生理相关性。
- 深入了解药理学药剂对血管张力的调节。
结论
- 微电极穿刺法有效用于研究血管生理学。
- 该协议可以帮助评估针对血管疾病的治疗药剂。
- 进一步研究可以扩展膜电位在血管健康中的意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of vascular smooth muscle membrane potential enables mechanistic de-risking of ion channel modulators in preclinical cardiovascular and cerebrovascular programs. This method supports target validation by linking electrophysiological readouts to vascular tone and blood flow regulation, providing predictive confidence for lead optimization. It bridges discovery biology with translational assessment of pharmacological agents affecting cerebral perfusion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on ion channel and electrogenic pump function in vascular smooth muscle.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating membrane potential changes with vascular tone modulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that depolarize or hyperpolarize membrane potential in resistance arteries.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (cannulated middle cerebral artery) for compound screening with stable membrane potential baselines.
- Quantitative Output: Generates reproducible membrane potential measurements in millivolts, enabling dose-response analysis of pharmacological agents.
- Screening Reproducibility: Standardizes impalement technique across vessels to ensure consistent electrophysiological readouts for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to diseased vessel models to assess ion channel dysfunction in hypertension, stroke, or vascular inflammation.
- Translational Continuity: Connects electrophysiological mechanism to functional outcomes like cerebral blood flow regulation.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on membrane potential shifts induced by test compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to functional validation in resistance arteries, supporting lead identification and preclinical efficacy assessment.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses about ion channel contribution to resting membrane potential in vascular smooth muscle.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with stable impalement recordings for compound library screening.
- Analytics: Provides quantitative membrane potential readouts (mV) that enable comparison of compound effects on vascular excitability.
- Translational Research: Links electrophysiological modulation to downstream functional assays of vascular tone and perfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for multiple vascular beds and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular pharmacology by directly measuring electrophysiological consequences of target modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible membrane potential data across laboratories and vascular preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying off-target electrophysiological effects early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of compounds with favorable vascular safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microelectrode preparation, vascular dissection, and electrophysiology recording.
- Depends on low-noise electrometers, digitizers, micromanipulators, and vibration-free imaging setups.
- Necessitates standardization of impalement success criteria (e.g., 30-second stability, return to zero) across users.
- Adaptation to other resistance arteries (e.g., mesenteric, coronary) may require vessel-specific cannulation and tone equilibration.
- Limited by technical success rate of impalement and susceptibility to movement artifacts during recording.
