Name: rad51 介导的 dna 链交换反应的实时观测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 了解利用荧光共振能量转移技术实时观测Rad51介导的DNA链交换反应的方法。该技术可在不干扰反应的情况下检测反应中间体并分析酶动力学，为研究DNA修复机制提供定量数据。

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本研究由日本学术振兴会（JSPS）资助，资助项目包括对HI的科学研究费助成项目（A类）（18H03985）和新学术领域项目（15H05974），对BA的青年学者研究B类项目（17K15061），以及对HT的科学研究费助成B类项目（18H02371）。

1. 蛋白质和DNA底物的制备
<ol>
	<li>按照先前报道的方法13,21，将裂殖酵母（S. pombe）Rad51 和 Swi5-Sfr1 蛋白纯化至均一（通过考马斯亮蓝染色判断）。</li>
	<li>制备 表118 中列出的寡核苷酸DNA底物。 
	注：寡核苷酸购自供应商（见材料表），并以HPLC级合成。对于DNA链配对反应，需要寡核苷酸16FA(-)、16A(-)_40bp 和 16AR(+)_40bp。对于DNA置换实验，需要寡核苷酸16A(-)、16FA(-)_40bp 和 16AR(+)_40bp（图1 和 表1）。本方案中所有DNA浓度均指片段浓度，而非核苷酸浓度。</li>
	<li>为形成供体双链DNA（dsDNA），在薄壁PCR管中将等摩尔量的互补链与退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl2）混合，确保总体积超过20 µL。此操作应在冰上预冷的金属架中进行（温度介于2 °C至4 °C之间）。 
	注：配对实验所用的寡核苷酸组合为16A(-)_40bp 和 16AR(+)_40bp。置换实验则需退火寡核苷酸16FA(-)_40bp 和 16AR(+)_40bp。</li>
	<li>将退火混合物在90 °C加热5分钟，然后使用PCR仪在3小时内缓慢冷却至30 °C。退火后的DNA储存于-20 °C。</li>
</ol>
2. DNA链配对与置换实验
<ol>
	<li>进行DNA链配对实验。
	<ol>
		<li>在2.0 mL微量离心塑料管（聚丙烯）中，制备1.6 mL含有36 nM 16FA(-)的反应缓冲液A（30 mM HEPES-KOH pH 7.5，1 mM二硫苏糖醇[DTT]，15 mM MgCl2，0.25 mM ATP，0.1 mg/mL牛血清白蛋白[BSA]，以及0.0075%聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯），并在37 °C预孵育5分钟。</li>
		<li>为形成Rad51-ssDNA丝状结构，将Rad51蛋白加入预孵育的反应缓冲液中，使其终浓度为1.5 µM，并在37 °C孵育5分钟。</li>
		<li>向混合物中加入Swi5-Sfr1蛋白，使其终浓度为0.15 µM，并在37 °C继续孵育5分钟。</li>
		<li>取1.5 mL上述混合物转移至含有磁力搅拌子的1.0 x 1.0 cm石英比色皿中，并将比色皿放入荧光分光光度计中。将仪器的帕尔贴温控系统设定为37 °C，并将磁力搅拌器转速设为450 rpm，以确保注入样品能迅速混合。</li>
		<li>开始在493 nm激发（带宽：1 nm）下检测FAM在525 nm处的荧光发射（带宽：20 nm），每秒采集一次数据。</li>
		<li>启动测量100秒后，使用注射器将ROX标记的供体dsDNA注入混合物中，使其终浓度为36 nM，并继续以每秒1次的频率测量荧光发射变化，持续30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行DNA链置换实验。
	<ol>
		<li>在2.0 mL微量离心塑料管中，制备1.6 mL含有36 nM 16A(-)的反应缓冲液A，并在37 °C预孵育5分钟。</li>
		<li>在Swi5-Sfr1存在条件下，于37 °C形成Rad51-ssDNA丝状结构，操作步骤如2.1.2和2.1.3所述。</li>
		<li>取1.5 mL上述混合物转移至含有磁力搅拌子的石英比色皿中，并将比色皿放入荧光分光光度计中，操作如步骤2.1.4所述。</li>
		<li>开始测量荧光发射，100秒后，按照步骤2.1.6所述方法注入FAM和ROX标记的供体dsDNA。继续以每秒1次的频率测量荧光发射变化，持续30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分析配对与置换实验的数据
<ol>
	<li>估算最大FRET效率。
	<ol>
		<li>使用步骤1.3和1.4中所述的相同方法，制备16FA(-)与16AR(+)_40bp退火产物，以及16FA(-)_40bp与16AR(+)_40bp退火产物。</li>
		<li>在0.2 × 1.0 cm石英比色皿中，制备130 μL含有以下任一种成分的反应缓冲液A：36 nM的16FA(-)、16FA(-)与16AR(+)_40bp退火产物、16FA(-)_40bp与16AR(+)_40bp退火产物，或16FA(-)_40bp。</li>
		<li>将比色皿放入荧光分光光度计中，在37 °C孵育5分钟。</li>
		<li>在493 nm激发下，测量500至600 nm范围内的荧光光谱。</li>
		<li>为测试Rad51对FAM发射及ROX对FAM淬灭的影响，向混合物中加入Rad51至终浓度为1.5 μM，并在37 °C孵育5分钟。</li>
		<li>在493 nm激发下，再次测量500至600 nm范围内的荧光光谱。</li>
		<li>使用下述公式计算最大FRET效率（Emaximum）： 
		Emaximum = （同时标记FAM和ROX的双链DNA在525 nm处的荧光强度）/（FAM标记的单链DNA在525 nm处的荧光强度）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析置换实验的数据。
	<ol>
		<li>为将置换实验中观察到的荧光变化转换为终产物量的变化，使用下述公式对本实验获得的原始实验数据进行归一化处理，其中Fraw为原始数据中的荧光强度，Fnormalized为通过以下公式计算得到的荧光变化量。 
		Fnormalized = ([x时刻的Fraw] - [0时刻的Fraw]) / (([0时刻的Fraw] / Emaximum) - [0时刻的Fraw]) 
		&#8203;0时刻的Fraw是指在死区时间（i.e.，注入试剂进入比色皿后混合所需的时间）结束后最初5秒内监测到的平均荧光强度。</li>
		<li>为排除光漂白和自发置换的影响，用样品的Fnormalized减去无蛋白条件下的Fnormalized，得到FD，即本实验中终产物量的变化。 
		FD = [样品的Fnormalized] - [无蛋白条件下的Fnormalized]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析配对实验的数据。
	<ol>
		<li>使用下述公式对配对实验获得的原始实验数据进行归一化处理，其中Fraw为原始数据中的荧光强度，Fnormalized为通过以下公式计算得到的荧光变化量。 
		Fnormalized = (x时刻的Fraw) / (0时刻的Fraw) 
		&#8203;0时刻的Fraw是指在通过注入双链DNA底物启动反应前最后20秒内监测到的平均荧光强度。</li>
		<li>为将荧光变化转换为底物量的变化，并排除光漂白和自发配对的影响，使用下述公式对样品的Fnormalized进行归一化处理，其中FP为本实验中底物量的变化。 
		&#8203;FP = 1 - (([无蛋白条件下的Fnormalized] - [样品的Fnormalized]) / [1-Emaximum])</li>
		<li>为研究DNA链交换反应的动力学，使用分析程序23（见材料表）对配对反应进行非线性最小二乘回归分析。
		<ol>
			<li>准备一个.txt格式的文件，其中包含FP的时间进程数据。</li>
			<li>启动程序，并将补充代码文件中的脚本粘贴到程序窗口中：</li>
			<li>开始非线性最小二乘回归分析。分析结果将在同一窗口中显示。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文详细描述了一种利用荧光共振能量转移（FRET）实时检测 Rad51 介导的 DNA 链交换反应的实验方案。重要的是，该方法可用于测定反应动力学参数。尽管上述描述已足以重复我们已发表的结果，但本节将阐述若干关键注意事项。此外，还将讨论基于 FRET 的方法在研究 DNA 链交换过程中的优缺点，以及此类技术在研究 DNA 代谢其他方面的应用。
与所有生化重建实验一样，确保所有反应底物具有高纯度至关重要。仅根据考马斯亮蓝染色判断蛋白质制备物的表观纯度，就假定其不含污染性活性，这种做法是不严谨的。特别是痕量核酸酶或解旋酶的存在，可能对配对和置换实验的结果产生显著影响。因此，我们强烈建议每次纯化新批次的蛋白质时，均应检测此类活性。此外，应通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测合成DNA底物的纯度。尽管许多公司承诺寡核苷酸的纯度，但我们通过自身检测发现，合成DNA的纯度在不同批次之间常存在差异。
使用石英比色皿进行实验时，需考虑以下两点。首先，某些蛋白质容易非特异性地结合到石英比色皿上。为避免这一问题，反应缓冲液中应添加牛血清白蛋白（BSA）和聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯。其次，温度对反应速度和荧光强度有显著影响。为尽量减少这种影响，使用前应将石英比色皿在37 °C下预孵育。
尽管传统的生化检测方法在研究DNA链交换方面具有重要价值，但其存在若干局限性。在典型的动力学实验中，反应在特定温度下孵育，并在预定的时间点取出等分试样，通过添加去污剂和蛋白酶进行去蛋白处理以终止反应。完成时间进程后，样品需进行电泳，以分离DNA底物与产物。本文所述方法的主要优势在于，可在不干扰反应的情况下实现对反应的实时观测。反应过程中的任意时间点均可进行检测，而无需中断反应本身，也无需对样品进行去蛋白处理或施加可能破坏性的电泳作用。这一点在监测不稳定的DNA结构时尤为重要。
尽管该方法相较于传统检测具有上述优势，但此处描述的方法仍存在一些缺点。虽然使用寡核苷酸DNA底物进行链交换可简化结果的解读，但需注意的是，此类底物并不类似于细胞同源重组（HR）过程中实际涉及的DNA底物。一些传统检测采用质粒大小的DNA底物，更能反映实际发生交换的碱基对数量 体内此外，在部分传统检测中使用拓扑结构受限的环状双链DNA底物，至少可在一定程度上重现生理状态下DNA的张力。
本文所述方法的应用已开始揭示 Rad51 驱动的 DNA 链交换的分子机制。然而，仍有许多有趣的问题有待解答。已有明确证据表明，减数分裂过程中的同源重组（HR）需要 Rad51 和 Dmc1 共同参与，其中 Dmc1 是真核生物中减数分裂特异性的 RecA 型重组酶24。然而，这两种重组酶之间缺乏显著的生化差异，这一现象多年来一直困扰着该领域的研究人员。此外，多种不同类别的重组辅助因子所发挥的作用，一直是同源重组研究领域的重点课题。除了阐明 Rad51 与 Dmc1 之间的生化差异外，我们还计划在近期深入研究并比较不同重组辅助因子对 DNA 链交换动力学的影响。最后，需要强调的是，本文基于 FRET 的方法不仅限于 DNA 链交换的研究。通过相对较小的改进，我们预计该技术还可广泛应用于研究参与 DNA 代谢的多种功能不同的蛋白质25,26,27,28。我们希望本文所述的技术进展能为来自众多不同学科领域的研究人员提供更多的研究选择。

同源重组（HR）可促进两个不同DNA分子之间的遗传信息交换。HR对于两种基本的生物学现象至关重要：在配子形成过程中产生遗传多样性1，以及在有丝分裂期间修复DNA双链断裂（DSBs）2。DSBs是最严重的DNA损伤形式，表现为染色体的断裂。DSBs的错误修复可导致广泛的染色体重排和基因组不稳定，这两者均为癌症的典型特征3。
DNA链交换反应是同源重组（HR）的核心阶段。Rad51蛋白属于高度保守的RecA型重组酶家族，是在真核生物中催化该反应的关键蛋白4,5。在此反应中，Rad51结合于由DSB末端经核酸酶加工产生的单链DNA（ssDNA），并形成一种螺旋状的核蛋白复合物，称为突触前丝。该复合物非特异性地捕获完整的双链DNA（dsDNA），以寻找同源序列。当复合物识别到同源序列时，会形成包含三链DNA的反应中间体，Rad51丝状结构在此结构中介导链交换过程6,7,8。为了高效完成这一反应，Rad51需要多种辅助蛋白的参与，例如乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的产物9,10。
了解辅助因子如何调控 Rad51 是揭示肿瘤发生过程中基因组不稳定性成因的关键步骤。尽管已有大量研究关注这些因子对突触前丝状结构形成与稳定性的影响11,12,13,14,15,16，但这些因子在三链中间体的形成及其向最终产物转化过程中的作用仍不明确。通过传统的生化实验观察这些反应步骤极为困难，因为三链中间体本身不稳定，且容易在常见的实验操作（如样品去蛋白化或电泳）过程中发生解体。
为解决这一问题，我们改进了两种先前开发的基于荧光共振能量转移（FRET）技术的DNA链交换反应实时观测系统：DNA链配对实验和DNA链置换实验17,18（图1）。在DNA链配对实验中，Rad51与荧光素酰胺（FAM）标记的单链DNA（ssDNA）形成前置突触丝，随后加入同源的羧基-X-罗丹明（ROX）标记的双链DNA（dsDNA）以启动链交换反应。当前置突触丝捕获ROX标记的dsDNA并形成三链中间体时，两种荧光基团彼此靠近，FAM的荧光发射被ROX淬灭（图1A）。在DNA链置换实验中，以前置突触丝与未标记的ssDNA结合后，加入同时标记FAM和ROX的dsDNA进行孵育。当链交换完成，FAM标记的ssDNA从三链中间体中释放后，由于FAM不再与ROX紧密相邻，其荧光发射增强（图1B）。这些实验方法使我们能够在不干扰反应过程的前提下，实时观察三链中间体的形成及其向最终产物的转化过程。
利用该实时观测系统，我们发现由 Rad51 介导的 DNA 链交换反应分为三个步骤：首先形成第一个反应中间体（C1），随后第一个中间体转变为第二个中间体（C2），最后从 C2 释放单链 DNA19。我们还发现，裂殖酵母（S. pombe）中的 Swi5-Sfr1（一种在进化上保守的 Rad51 辅助蛋白复合物13,16,20,21,22）能够以依赖于 Rad51 ATP 水解的方式促进 C1 向 C2 的转变以及单链 DNA 从 C2 的释放19。
这些发现是否在进化上保守仍有待明确。本方案的提供旨在希望同源重组（HR）领域的研究人员，特别是那些研究裂殖酵母（S. pombe）以外生物体蛋白的研究者，能够应用这些技术来确定Rad51驱动的链交换分子机制在多大程度上是保守的。此外，这些技术已被证明在确定裂殖酵母（S. pombe）Swi5-Sfr1蛋白功能方面非常成功。因此，可以合理预测，这些技术将在揭示其他同源重组辅助因子的精确功能方面发挥不可估量的作用。

<table><tbody><tr><td>0.2 x 1.0 cm 石英比色皿</td><td>Hellma Analytics</td><td>105-250-15-40</td><td></td></tr><tr><td>1.0 x 1.0 cm 石英比色皿</td><td>Hellma Analytics</td><td>101-10-40</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷（ATP）</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>DynaFit</td><td>BioKin, Ldt.</td><td></td><td>DynaFit 是一种用于分析生化反应动力学的程序。</td></tr><tr><td>荧光标记与非标记寡核苷酸</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>寡核苷酸序列列于表1中。</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Aisis (日本)</td><td>CM1609</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>TAKARA (日本)</td><td>TP600</td><td>TAKARA PCR Thermal Cycler Dice</td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>JASCO</td><td>FP8300</td><td>配有帕尔贴温度控制器和磁力搅拌系统</td></tr><tr><td>注射器</td><td>HAMILTON</td><td>1702RN 25ul SYR (22s/2&quot;/2)</td><td></td></tr></tbody></table>

实时观察 rad51 介导的 dna 链交换反应

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Rad51介导的DNA链交换反应是同源重组过程中的关键步骤。在该反应中，Rad51在单链DNA（ssDNA）上形成核蛋白丝，并非特异性地捕获双链DNA（dsDNA），以搜寻其中的同源序列。在识别到同源区域后，Rad51催化DNA链交换，介导ssDNA与dsDNA互补链之间的配对。该反应受到多种辅助蛋白的严格调控。 体内尽管传统的生化实验已成功用于研究此类辅助蛋白的作用 体外，由于反应中间体具有不稳定和瞬态的特性，对其形成及其向终产物转化过程的动力学分析一直具有挑战性。为了在溶液中直接观察这些反应步骤，已建立了基于荧光共振能量转移（FRET）的实时观测系统。对实时观测数据的动力学分析表明，Rad51介导的DNA链交换反应遵循一个三步反应模型，包括三链DNA中间体的形成、该中间体的成熟，以及单链DNA从成熟中间体中的释放。Swi5-Sfr1复合物是一种在真核生物中保守的辅助蛋白，能够显著促进该反应的第二和第三步。本文所介绍的基于FRET的检测方法使我们能够揭示辅助蛋白如何在分子水平上促进Rad51的DNA链交换活性。本实验方案的主要目标是拓展同源重组领域研究人员可用的技术手段，特别是为研究非模式物种来源蛋白的研究者提供支持 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe），以确定本文所述发现的进化保守性。

为了有效分析配对和置换实验中的实验数据，必须明确FAM荧光发射的变化如何对应于DNA底物向产物的转化。为此，需要确定相关的荧光强度范围。在配对实验中，将对应于单链DNA底物的16FA(-)的荧光发射与16FA(-)与16AR(+)_40bp退火后形成的产物（即该反应的最终产物）的荧光发射进行比较（图2A）。这对应于最大FRET效率，即当所有单链DNA底物完全转化为双链DNA产物时，预期达到的最大荧光强度降低。在置换实验中，将对应于底物的16FA(-)_40bp与16AR(+)_40bp退火复合物的荧光发射与对应于最终产物的16FA(-)_40bp的荧光发射进行比较（图2B）。在此情况下，FAM荧光强度的最大增加表示所有双链DNA底物均转化为单链DNA产物的情形。S. pombe Rad51在两种实验中均未影响FAM的荧光发射或ROX对FAM的淬灭效率（图2）。每次新制备寡核苷酸时，都应重新测定最大FRET效率，因其依赖于寡核苷酸的标记效率。
DNA链配对和置换反应的代表性数据如图3所示。在两种检测中，底物DNA之间的自发反应以及光漂白的影响均较小，这由未加入Rad51时FAM荧光发射信号的微小变化所证实，而加入Rad51后则观察到显著变化（图3A和图3B）。根据图3A或图3B所示数据，分别利用步骤3.2.2或3.3.2中描述的公式，将荧光信号的变化转换为底物（FP）或终产物（FD）含量的变化（图3C和图3D）。
使用顺序三步反应模型模拟了配对反应，该模型包括形成第一个三链中间体（C1）、第一个中间体转变为第二个中间体（C1 转化为 C2），以及从第二个中间体释放单链 DNA 形成两种产物（D + E）（图 3E）。为了检验使用顺序三步反应模型的模拟是否与实验数据相符，计算了DNA链配对实验的实验数据与模拟所得理论曲线之间的残差（图 3F）。此外，还计算了配对反应与使用顺序两步反应模型生成的理论曲线之间的残差（图 3G）。配对反应与两步模型之间的残差在反应初期表现出系统性偏差，而配对反应与三步模型之间的残差则未显示此类偏差。这表明三步模型比两步模型更适用于模拟配对反应。
为了检验三步模型是否与检测DNA链交换后期步骤的置换反应相一致，我们利用配对反应模拟所获得的动力学参数，生成了置换反应的理论曲线。 图3C 并与所示置换反应的实验数据进行了比较 图3D (图 3H）。理论曲线与置换实验的数据吻合。根据这些结果，我们得出结论：利用三步模型进行模拟能够合理地评估Rad51介导的DNA链交换反应。
Rad51 与 Rad51 的辅助蛋白 Swi5-Sfr1 复合物参与的 DNA 链配对反应的代表性数据如图所示 图 4ASwi5-Sfr1复合物显著增强了Rad51的配对活性。无论是否存在Swi5-Sfr1，配对反应均更符合三步模型而非两步模型。图 4B）。通过使用三步模型模拟反应过程，计算了有或无Swi5-Sfr1存在时各反应步骤的反应平衡常数。反应平衡常数表明，Swi5-Sfr1复合物并不促进第一个反应步骤（图4C, 图A），其中形成三链中间体，但强烈促进 C1-C2 转变（图4C, 图 b）以及单链DNA从C2中间体的释放（图4C, 图c).
<img alt="显示引物结合的DNA复制示意图；16FA(-)、16A(-)与16AR(+)引物的组装。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59073/59073fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：DNA链配对与置换实验的设计。 DNA链配对（A）和置换（B）实验的示意图。黄色圆圈代表Rad51单体。含有“F”的绿色圆圈和含有“R”的红色圆圈分别代表荧光素酰胺（FAM）和羧基-X-罗丹明（ROX）。黑色DNA链序列相同，且与蓝色DNA链互补。带箭头的细黑线指向各寡核苷酸的名称，如表1所示。本图改编自Ito et al.19，并进行了修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59073/59073fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光发射光谱；DNA杂交图谱；相对强度与波长关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59073/59073fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：配对与置换实验中最大FRET效率的测量结果。（A）配对实验中单链DNA底物16FA(-)与双链DNA产物16FA(-)与16AR(+)_40bp配对后的荧光光谱比较。蓝色和红色线条分别表示无Rad51和有Rad51存在时底物的荧光光谱。绿色和紫色线条分别表示无Rad51和有Rad51存在时最终产物的荧光光谱。（B）置换实验中双链DNA底物16FA(-)_40bp与16AR(+)_40bp配对后与单链DNA产物16FA(-)_40bp的荧光光谱比较。蓝色和红色线条分别表示无Rad51和有Rad51存在时最终产物的荧光光谱。绿色和紫色线条分别表示无Rad51和有Rad51存在时底物的荧光光谱。本图改编自Ito et al.19，经修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59073/59073fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="DNA-Rad51 相互作用动力学；光谱学研究中的图谱、模型与残差分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59073/59073fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：由Rad51介导的DNA链配对与置换反应。 (ARad51存在与否对配对反应中归一化荧光强度的时间进程影响。B归一化荧光随时间变化曲线，显示有或无 Rad51 时的置换反应进程。CRad51配对反应中底物量随时间的变化过程。DRad51介导的置换反应中底物量随时间的变化过程。E) 顺序三步反应模型的示意图。A 和 B 分别代表突触前丝状结构和供体双链 DNA。C1 代表第一个（未成熟）三链中间体。C2 代表第二个（成熟）三链中间体。D 和 E 分别代表从 C2 产生的异源双链 DNA 和释放的单链 DNA。F 和 G) DNA链配对实验数据与通过三步模型模拟获得的理论曲线之间的残差F）或两步法（G）模型。H红色圆点表示图 D 中 Rad51 参与的置换反应的实验数据。蓝色线条表示终产物的理论曲线。该理论曲线是通过模拟图 D 配对实验获得的反应速率常数生成的。 C. 该图改编自 Ito 等19 并进行了修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59073/59073fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结合动力学；Rad51 与 Rad51+SSS1；比较图；两步模型与三步模型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59073/59073fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：Swi5-Sfr1 促进 DNA 链交换反应的第二步和第三步。（A）在有或无 Swi5-Sfr1（S5S1）条件下，配对反应中底物量随时间变化的过程。（B）Swi5-Sfr1 存在下的 DNA 链配对实验数据与使用两步模型（蓝线）或三步模型（红线）模拟得到的理论曲线之间的残差。（C）使用三步模型及分析程序23（见材料表）对图 4A所示的配对反应进行模拟。每一步反应的平衡常数 K1（a）、K2（b）和 K3（c）由模拟获得。本图改编自 Ito et al.19，经修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59073/59073fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">DNA链配对实验用寡核苷酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16FA(-)</td>
			<td colspan="4">5’-[FAM]-AAATGAACATAAAGTAAATAAGTATAAGGATAATACA 
			AAATAAGTAAATGAATAAACATAGAAAATAAAGTAAAGGATAT AAA -3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16A(-)_40bp</td>
			<td colspan="4">5’-AAATGAACATAAAGTAAATAAGTATAAGGATAATACAAAA-3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16AR(+)_40bp</td>
			<td colspan="4">5’-TTTTGTATTATCCTTATACTTATTTACTTTATGTTCATTT-[ROX]-3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">DNA链置换实验用寡核苷酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16A(-)</td>
			<td colspan="4">5’-AAATGAACATAAAGTAAATAAGTATAAGGATAATACAAAATA 
			AGTAAATGAATAAACATAGAAAATAAAGTAAAGGATAT AAA -3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16FA(-)_40bp</td>
			<td colspan="4">5’-[FAM]-AAATGAACATAAAGTAAATAAGTATAAGGATAATACAAAA-3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16AR(+)_40bp</td>
			<td colspan="4">5’-TTTTGTATTATCCTTATACTTATTTACTTTATGTTCATTT-[ROX]-3’</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：DNA链配对与置换实验中所用寡核苷酸列表。 如适用，荧光基团（荧光素酰胺，FAM；羧基-X-罗丹明，ROX）的位置以方括号标示。

开发了基于荧光共振能量转移的DNA链交换反应实时观测系统，该反应由Rad51介导。利用本文所述的实验方案，我们能够检测反应中间产物的形成及其向终产物的转化过程，同时分析该反应的酶促动力学特征。

实时观察 Rad51 介导的 DNA 链交换反应

Rad51介导的DNA链交换反应是同源重组的关键步骤。在此反应中，Rad51形成核蛋白丝...

该方法有助于解析DNA链交换过程中的各个步骤，并揭示在修复过程中协同作用的不同蛋白质的分子功能。利用该技术，我们可以在不干扰反应的情况下实时监测DNA链交换，并通过反应动力学分析确定每一步反应的动力学参数。经过一些小幅调整，该技术还可用于研究来自其他物种（如哺乳动物和植物）的纯化重组蛋白的活性。本实验操作将由我实验室的博士后 Kentaro Ito 演示。首先，根据文本方案配制反应缓冲液 A。接着，向缓冲液中加入 36 纳摩尔的 16FA-寡核苷酸，用于 DNA 配对实验。将混合物在37摄氏度下孵育5分钟。向混合物中加入RAD-51蛋白，终浓度为1.5微摩尔，并在37摄氏度下继续孵育5分钟。再向混合物中加入SWI5-SFR1蛋白，终浓度为0.15微摩尔，并在37摄氏度下额外孵育5分钟。将1.5毫升混合物转移至含有磁力搅拌子的1.0 × 1.0 cm石英比色皿中。将比色皿插入荧光分光光度计，调节温度控制器和磁力搅拌器。在493纳米激发波长下，以每秒一次的频率记录525纳米处FAM荧光发射在100秒内的变化。最后，用注射器将ROX标记的双链DNA注入比色皿中，终浓度为36纳摩尔。以每秒一次的间隔记录30分钟内的荧光发射变化。为了比较底物与最终产物之间的荧光光谱，将含有16种FA-寡核苷酸并加入或不加入RAD-51的各个比色皿插入荧光分光光度计中，在37摄氏度下孵育5分钟。然后，在493纳米激发波长下，记录500至600纳米范围内的FAM荧光发射。为检测RAD-51对荧光光谱的影响，加入RAD-51至终浓度为1.5 µmol，并将混合物在37 °C孵育5分钟。最后，在493纳米激发波长下记录500至600纳米范围内的荧光光谱。通过在配对实验中测量单链DNA底物完全转化为双链DNA时荧光强度的最大降低值，或通过在置换实验中测量双链DNA底物完全转化为单链DNA时荧光强度的最大增加值，获得最大FRET效率。在这两种检测中，加入 RAD-51 蛋白对 FAM 的荧光发射或其被 rocks 淬灭的效率均无影响。底物 DNA 与后续光漂白之间的自发反应影响较小。如图所示，在未加入 RAD-51 时 FAM 发射信号的变化可忽略不计，而加入 RAD-51 后则观察到显著变化。加入SWI5-SFR1复合物可显著增强RAD-51的配对活性。该配对反应采用三步模型进行模拟，包括形成第一个三链中间体、转变为第二个中间体，以及单链DNA的释放和异源双链的形成。将三步模型与两步模型进行比较表明，无论是否存在SWI5-SFR1复合物，三步模型在模拟DNA配对反应时均具有更优的拟合效果。计算每个反应步骤在有或无SWI5-SFR1存在下的平衡常数表明，SWI5-SFR1复合物并不促进前三个链中间体的形成，但显著促进两个三链中间体之间的转换以及单链DNA的释放。必须验证每批纯化的蛋白质均无核酸酶和解旋酶污染。

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科研

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