小鼠经颅光生物调节治疗方案

以下实验方案的总体目标是利用低强度红光激光在小鼠中进行经颅光生物调节治疗。该过程通过将激光探头直接接触小鼠头部来实现。第一步，为了评估激光光的透射情况，需小心地将脑组织从颅骨中分离出来。

然后测量透过颅骨、头皮以及一毫米厚脑组织切片后的透射光功率。在治疗部分，将激光探头的尖端直接接触颅顶（bregma）处的头皮。这些空间学习和记忆功能通过巴恩斯迷宫实验进行评估。

随后，采用分光光度法测定海马组织中的ATP水平。激光透射数据显示，头皮表面约有1%的入射光可到达皮层表面下1毫米的深度。巴恩斯迷宫实验的结果显示，经过两周经颅红光激光治疗后，老龄小鼠的空间记忆能力得到改善。

此外，结果表明经激光处理的衰老小鼠海马体中的ATP水平有所升高。经颅光生物调节是一种非侵入性治疗手段，可用于治疗多种神经和精神疾病，并改善健康大脑功能。事实上，人们认为光生物调节疗法可促使线粒体中细胞色素c氧化酶上的硝酸氧化物发生光解离。

这些过程进而增强线粒体电子传递，最终导致ATP生成增加。该方法是一种安全且经济有效的光递送技术，通过使用外部光源（包括激光和发光二极管）照射头部来实现。几乎所有经颅光生物调节治疗均采用波长为600至1100纳米的红光至近红外光，功率范围为1至500毫瓦，能量密度范围为1至20焦耳每平方厘米。

在深度麻醉的小鼠中，小心地将脑组织从颅骨中解剖出来。首先，将完整的脑组织固定在琼脂糖凝胶上，并准备好所有所需材料，包括氯化钠和胶水。然后，在振动切片机安装块的表面涂上一层薄薄的胶水。

小心地安装琼脂糖块并调整其位置。将振动切片机刀片轻轻与琼脂糖块的上表面齐平，记录计数器数值。用冰冷的生理盐水溶液填充振动切片机的槽。

调节振动切片机的速度和振动频率，并将计数器调整至合适的数值，以获得一毫米厚度的切片。打开振动切片机，按下启动按钮，将脑组织横向切割成厚度为一毫米的切片。首先，在光学玻璃表面滴加一滴水。

然后，将脑片置于玻片上，滴加一滴水，再小心地盖上第二块光学玻片。注意应在样品和玻片的边缘处添加一滴水，以防止组织干燥以及粗糙表面引起的光散射。

将样品转移至光学实验室。安装光学设备并打开功率计。在开始操作激光设备前，请佩戴护目镜。

打开激光器，使光束聚焦在用于将光束引导至光电二极管有效区域的反射镜上。首先，将两片空白光学玻璃放置在功率计表面，从显示屏读取透射光功率。移除空白玻璃，轻轻将脑组织样本放置在功率计表面，并将光束聚焦在组织的相应区域，读取透射功率。

此次，将一块空白光学玻璃放置在功率计表面，读取透射光功率。然后取下空白玻璃，轻轻将一块带有新鲜颅骨和去毛皮组织的光学玻璃放置在功率计表面。将光束聚焦于前囟点，并读取透射功率。

最后，关闭激光设备和功率计。本实验方案的治疗部分涉及使用3B类激光仪器，因此需要经过适当的培训并遵守安全操作规范。为了使动物适应新环境，应在开始治疗前约20分钟将小鼠从其饲养笼转移到治疗室。

首先，将激光设备的插头插入电源保护器中。用透明的尼龙膜覆盖激光探头的尖端，以防止探头表面被划伤。小心地将激光探头连接至设备的通道。

操作激光设备前请佩戴护目镜。开启激光设备并等待数秒使其预热。观察到设备面板上显示“激光就绪”指示后，调节治疗参数，包括照射时间和工作模式。

开始治疗前，通过将探头尖端接触设备上功率计的活性区域来确定激光的平均功率。在本方案中，激光探头放置于前囟区域，该区域位于两耳前缘基部连线前方约三毫米处。为避免激光直接照射动物眼睛，应先将激光探头尖端放置在动物头部，然后开启激光，并在照射完成前稳定保持探头位置。

然后，关闭激光设备并将探头从设备上断开。操作结束后，使用适当的光学清洁剂清洁激光探头。空间学习与记忆任务在巴恩斯迷宫中进行。

首先，在任务房间门外放置“禁止进入”标识。将视觉空间线索附着在周围墙壁上。在迷宫平台上方放置一个视频摄像机。

使用70%乙醇清洁迷宫平台表面，以去除不必要的嗅觉线索。在逃生箱中加入少量动物原饲养笼中的垫料，作为嗅觉线索。开始实验任务前，将每只小鼠放入新笼子中，并将笼子转移至巴恩斯迷宫房间。

为进行适应性训练，将动物置于实验室内静置30分钟后再开始实验任务。随后，将小鼠从其笼中取出，轻柔地放入逃避箱中，让其在箱内停留1分钟。1分钟后，小心地将小鼠从逃避箱中取出，将其放置于旷场中央，并将起始 chamber 罩在小鼠上方。

十秒后，移开起始室，让动物在场地中自由探索三分钟。然后安静地走到计算机区域，戴上耳罩，触发由高强度白噪声组成的负面听觉刺激。随后开始录像，并通过计算机显示器观察动物的行为。

请注意，测试白色小鼠时应使用黑色迷宫。此外，如果要使用视频追踪系统软件，应在迷宫下方放置一块黑色垫子。设置好视频追踪软件程序，并从录制的视频中提取感兴趣的参数。

进行生化评估时，分离海马组织，将其在样品缓冲液中匀浆，离心后，采用分光光度法测定其ATP水平。660纳米激光穿过老龄小鼠颅骨加头皮的透射率约为16%。此外，测得激光穿过一毫米厚老龄脑组织切片的透射率约为10%。在开放场实验中，所有实验组之间的运动活动对数值均无统计学显著差异。

来自Barnes迷宫实验的数据表明，在训练阶段的第三天和第四天，老年对照组动物的潜伏时间明显长于年轻对照组动物。然而，红光激光处理在第四天显著缩短了潜伏时间。在探针试验阶段，老年对照组动物在目标象限停留的时间显著短于年轻对照组动物。

然而，与老龄对照组小鼠相比，接受激光处理的老龄小鼠在目标象限中停留的时间显著更长。海马区生物能量学数据显示，老龄对照组动物的ATP水平下降。另一方面，红光激光处理显著提高了老龄小鼠海马区的平均ATP含量。

我们描述了在小鼠中进行经颅光生物调节治疗的实验方案。该方案可适用于转化神经科学领域常用的其他实验动物，如兔、犬、猴等。根据我们的研究，低强度红光可通过促进ATP生成，恢复老龄大脑中海马的功能障碍，从而改善空间记忆功能。

该方法根据病理影响的脑区，需要对多个物理和治疗参数（包括照射时间、治疗间隔、施加的辐照度和能量密度）进行最佳调整，以获得更好的效果。经颅光生物调节疗法被认为是一种有望改善脑代谢和增强认知功能的方法，可能成为应对与年龄相关的认知衰退及神经退行性疾病的一种潜在策略。