Name: 通过肽浓缩和质谱检测蛋白质泛化位点检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学习通过肽浓缩和质谱技术检测蛋白质泛素化位点的方法，利用diGly肽段富集和Orbitrap高级碎裂设置实现深度泛素组学分析。该技术可显著提高泛素化蛋白鉴定覆盖率和实验可重复性。

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本工作属于项目&#34;Proteins at Work&#34;的一部分，该项目由荷兰蛋白质组学中心（Netherlands Proteomics Centre）承担，由荷兰科学研究组织（NWO）资助，属于国家大型研究设施路线图项目（项目编号 184.032.201）。

本文所述所有方法均已获得伊拉斯姆斯医学中心机构动物护理和使用委员会（EDC）的批准。
1. 样品制备
<ol>
	<li>培养的细胞
	<ol>
		<li>选择感兴趣的细胞系（例如 HeLa 或骨肉瘤 [U2OS] 细胞），在添加了 10% 热灭活胎牛血清（FBS）和 100 单位/毫升青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养细胞。</li>
		<li>进行定量蛋白质组学实验时，在缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM培养基中培养细胞。培养基需添加10%透析胎牛血清（FBS）、100单位/毫升青霉素-链霉素和丙氨酰-谷氨酰胺。通过分别添加普通赖氨酸和精氨酸（“轻”培养基）或赖氨酸-8（Lys-8）与精氨酸-10（Arg-10），配制两种类型的培养基。13C6;15N2）和精氨酸-10（13C6;15N4）（“重”培养基）。</li>
		<li>在扩增和处理前，分别使用轻培养基（即未标记）和重培养基（即标记，SILAC）培养细胞，至少传代六次，以确保重培养基中的所有蛋白质均被含重稳定同位素的氨基酸完全标记。</li>
		<li>用10 µM蛋白酶体抑制剂bortezomib处理细胞8小时，或加入等体积的DMSO作为模拟处理。用PBS洗涤细胞，使用1%胰蛋白酶/EDTA消化细胞并离心收集细胞沉淀。</li>
		<li>从一个150 cm²培养皿中收集的细胞沉淀进行裂解2 每种实验条件下，将培养板中的样品加入2 mL预冷的50 mM Tris-HCl（pH = 8.2）缓冲液（含0.5%脱氧胆酸钠（DOC）），在95 °C下煮沸裂解液5分钟，随后进行超声处理10分钟（设定参数 &#34;H&#34; 对于文中所列的超声波破碎仪 材料表4 °C下。不建议使用去泛素化酶抑制剂（如N-乙基马来酰亚胺，NEM），因为这可能会引入非预期的蛋白质修饰，从而增加肽段鉴定的复杂性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体小鼠脑组织
	<ol>
		<li>使用体内组织时，将组织置于含有 100 mM Tris-HCl（pH = 8.5）、12 mM 氯化钠脱氧胆酸盐（sodium DOC）和 12 mM 月桂酰肌氨酸钠（sodium N-lauroylsarcosinate）的冰浴缓冲液中裂解17. 将裂解液超声处理10分钟（设定参数 &#34;H&#34; 对于所列的超声波破碎仪 材料表在 4 °C 下孵育，并将裂解液在 95 °C 下煮沸 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用比色法BCA蛋白检测试剂盒定量总蛋白含量。为确保二甘氨酰肽免疫沉淀（IP）实验成功，总蛋白量应至少达到数毫克。对于SILAC实验，根据总蛋白量将轻标和重标蛋白按1:1比例混合。</li>
	<li>使用5 mM 1,4-二硫苏糖醇在50 °C下还原所有蛋白质30分钟，随后在避光条件下用10 mM碘乙酰胺烷基化15分钟。以Lys-C（酶与底物比例为1:200）消化蛋白质4小时，随后在30 °C或室温（RT）下用胰蛋白酶（酶与底物比例为1:50）过夜消化。</li>
	<li>向消化后的样品中加入三氟乙酸（TFA），使其终浓度为 0.5%，然后在 10,000 x g 条件下离心样品 g 孵育10分钟，以沉淀并去除所有去污剂。收集含有肽段的上清液，用于后续分级分离。</li>
</ol>
2. 肽段的离线分离
<ol>
	<li>使用高pH反相（RP）C18色谱柱，固定相为聚合物材料（300 Å，50 µM；参见材料表），装填至空柱管中，用于分离胰蛋白酶消化后的肽段。固定相填料的用量需根据待分离蛋白质消化产物的量进行调整。准备一个6 mL空柱管（参见材料表），装入0.5 g固定相材料，适用于约10 mg蛋白质消化产物。蛋白质消化产物与固定相的质量比应约为1:50（w/w）。</li>
	<li>将肽段上样至预装柱中，用约10倍柱体积的0.1%三氟乙酸（TFA）洗涤柱子，随后用约10倍柱体积的H2O冲洗。</li>
	<li>用含7%、13.5%和50%乙腈（AcN）的10 mM甲酸铵溶液（pH = 10）分别以10倍柱体积洗脱，将肽段分为三个组分。将所有组分完全冻干。</li>
	<li>使用与蛋白A琼脂糖微珠偶联的泛素残基基序（K-ε-GG）抗体，对二甘氨酸修饰肽段（diGly肽段）进行免疫富集。由于每批微珠所含抗体的确切量属于制造商的专有信息且未公开，建议采用与制造商相同的“一批”定义，以避免混淆。用PBS洗涤一批微珠两次，并将微珠悬液均分为六等份。详细实验方案见图1。</li>
	<li>将步骤2.3中收集的三个肽段组分溶解于1.4 mL缓冲液中，缓冲液组成为50 mM MOPS、10 mM磷酸钠和50 mM NaCl（pH = 7.2），离心去除不溶物。</li>
	<li>将各组分的上清液加入diGly抗体微珠中，在4 °C下旋转孵育2小时。离心收集微珠后，将上清液转移至另一批新鲜抗体微珠中，再次在4 °C下孵育2小时。</li>
	<li>将上清液保存，用于后续全蛋白质组（GP）分析。</li>
	<li>将各组分中的微珠转移至装有GF/F滤芯的200 µL移液枪头中以保留微珠。将装有微珠的枪头插入配有离心柱适配器的1.5 mL微量离心管中。每次用200 µL冰浴IAP缓冲液洗涤微珠3次，随后再用200 µL冰浴milliQ H2O洗涤3次。每次洗涤前以200 × g离心2分钟，注意避免柱子干涸。使用两轮各50 µL的0.15% TFA溶液洗脱肽段。</li>
	<li>使用C18固相萃取小柱（本质上为装有两个C18圆盘的200 µL移液枪头）对肽段进行脱盐，并通过真空离心完全干燥。</li>
</ol>
3. 纳流液相色谱-质谱/质谱
<ol>
	<li>在与纳米流液相色谱系统联用的高灵敏度质谱仪上进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）实验。</li>
	<li>使用自制的50 cm反相色谱柱（内径75 µm），填充CSH130树脂（3.5 µm，130 Å），以2−28%乙腈（含0.1%甲酸）梯度在120分钟内以300 nL/min流速洗脱肽段。或者，可使用具有类似性能的市售液相色谱柱。使用柱温箱将色谱柱温度保持在50 °C（例如（见 材料表).</li>
	<li>进行质谱分析。
	<ol>
		<li>质谱仪必须以数据依赖性采集（DDA）模式运行。MS1质谱应以高分辨率（例如120,000）采集，对于Orbitrap质谱仪，自动增益控制（AGC）目标值设为4E5，最大注入时间设为50 ms。</li>
		<li>进行质谱分析 &#34;强度优先级最高&#34; 首先采用最高强度模式，利用总循环时间为3秒的高速方法，依次选择强度最高的离子进行碎裂，然后选择第二高的离子，依此类推。随后，进行第二轮DDA MS分析 &#34;最低强度优先&#34; 模式下，首先选择强度最低的离子，然后是第二低的离子，依此类推。该策略可确保对丰度极低的肽段实现最佳检测。</li>
		<li>根据前体离子的电荷态（2-7电荷）和单一同位素峰指派对前体离子进行筛选。动态排除已检测过的前体离子，排除时间为60秒。使用四极杆质量过滤器（设定宽度为1.6 Th）对肽段前体离子进行分离。</li>
		<li>在离子阱中以 7E3 的自动增益控制（AGC）值、最大注入时间 50 ms 和 30% 的 HCD 碰撞能量采集 MS2 谱图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用合适的搜索引擎（例如基于Andromeda搜索算法的免费MaxQuant软件套件）分析质谱原始数据文件18,19。在MaxQuant中，采用默认设置，并根据以下说明进行若干调整：将酶切特异性设为胰蛋白酶，最大漏切位点数设为3；将赖氨酸上的二甘氨酸残留物（+114.04 Da）、甲硫氨酸氧化和N端乙酰化设为可变修饰，将半胱氨酸的羧甲基化设为固定修饰。</li>
	<li>使用包含从Uniprot数据库（例如<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">https://www.uniprot.org/downloads</a>）下载的蛋白质序列的FASTA文件，结合MaxQuant自动提供的反向数据库（decoy）和标准常见污染物数据库进行数据库搜索。设定错误发现率（FDR）为1%，修饰肽段（diGly）的最低得分设为40（默认值）。排除含有C端二甘氨酸化赖氨酸残基的肽段，不再进行后续分析。</li>
	<li>对于SILAC实验文件的定量分析，将多重性（multiplicity）设为&#34;2&#34;，并重复步骤4.2。</li>
	<li>使用MaxQuant软件套件中的Perseus模块20进行所有下游分析（例如统计分析、基因本体论分析）。</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
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<li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li>
<li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li>
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<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
<li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li>
<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
<li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方案已应用于多种生物来源的样品，如培养细胞和体内组织。在所有情况下，只要总蛋白投入量至少为1 mg，我们均能鉴定出数千种diGly肽段。使用特异性抗体进行富集的效率非常高，因为若不对泛素化蛋白或diGly肽段进行任何富集处理，从全细胞裂解液中仅能鉴定出最多100–150种丰度极低的diGly肽段。显然，高灵敏度的质谱分析是获得大量diGly鉴定结果的前提条件。尽管我们已成功使用多种不同的质谱仪，但发现Orbitrap Tribrid Lumos的灵敏度最高，可获得最多的鉴定产量。
在进行免疫沉淀（IP）之前，应先测试高pH洗脱的离线反相色谱。为了获得最佳实验效果，各组分在肽段鉴定方面的重叠应尽可能低。完成免疫沉淀后，其中一个组分应包含泛素自身K48修饰的胰蛋白酶双甘氨酸（diGly）肽段LIFAGK(GG)QLEDGR（m/z 730.39）。这是免疫沉淀组分中丰度最高的肽段，在120分钟梯度洗脱条件下，其液相色谱图中50–55分钟区间呈现出强烈而宽泛的峰（图1B）。如果色谱图中缺...

泛素与蛋白质的共价连接可标记其被蛋白酶体降解，是蛋白质稳态中的关键过程。泛素的C端羧基与靶蛋白赖氨酸的ε-氨基形成异肽键1,2。此外，泛素还可连接至其他泛素模块，从而形成同型（如K48或K11连接）或分支型（即异型或混合型）的多聚泛素结构1,3。泛素最广为人知的功能是通过K48连接的多聚泛素介导蛋白酶体降解。然而，现已明确单泛素化和多泛素化也参与多种不依赖蛋白酶体降解的生物学过程。例如，K63连接的泛素链在细胞内运输、溶酶体降解、激酶信号传导以及DNA损伤应答中发挥非降解性功能4,5。其余六种连接类型相对稀少，其功能在很大程度上仍不明确，但随着新型特异性检测工具的开发，关于它们在细胞中作用的初步线索正逐渐浮现6,7。
质谱技术已成为蛋白质组分析不可或缺的工具，如今在单次实验中即可鉴定出几乎任何生物来源的数千种不同蛋白质。蛋白质的翻译后修饰（PTMs）（例如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化）为研究增加了额外的复杂性，这些修饰能够调节蛋白质的活性。随着质谱技术的发展，大规模鉴定携带翻译后修饰的蛋白质已成为可能。由于携带翻译后修饰的肽段与其未修饰形式相比化学计量比相对较低，这构成了技术上的挑战，因此在质谱分析之前通常需要进行生物化学富集步骤。在过去的二十年中，已开发出多种不同的特异性富集方法用于翻译后修饰的分析。
由于蛋白质泛素化在细胞中具有多种功能，因此迫切需要开发用于检测蛋白质上泛素化位点的分析方法8。质谱技术的应用使得在果蝇、小鼠、人类和酵母蛋白质中鉴定出的泛素化位点数量迅速增加9,10,11,12,13,14。其中一个重要进展是开发出基于免疫沉淀的肽段富集策略，利用特异性识别K-ε-GG残基基序（也称为“二甘氨酸”或“diGly”）的抗体进行富集。这些diGly肽段是在使用胰蛋白酶作为蛋白酶消化泛素化蛋白质后产生的15,16。
本文介绍了一种通过免疫富集结合Orbitrap质谱检测来富集二甘氨酸化（diGly）肽段的优化工作流程。通过整合现有流程的多项改进，特别是在样品制备和质谱分析阶段的优化，我们能够常规地从经蛋白酶体抑制剂处理的单个HeLa细胞样品中鉴定出超过23,000种diGly肽段，从未处理的HeLa细胞中鉴定出约10,000种。该方案已成功应用于未标记和使用细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）的HeLa细胞裂解液，以及脑组织等内源性样品。
该工作流程为泛素化位点分析工具库提供了一个有价值的补充，有助于揭示深层次的泛素化蛋白质组。以下方案详细描述了该工作流程的各个步骤。

<table><tbody><tr><td>1,4-二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 十八烷基圆盘</td><td>Supelco</td><td>66883-U</td><td>Supelco 已停产该产品；CDS Analytical 为新制造商（https://www.cdsanalytical.com/empore）</td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>硼替佐米</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130 树脂，3.5 &amp;mu;m，130 &amp;Aring;</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF/F 滤膜插头</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>赖氨酸，精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赖氨酸-8（&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;；&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;），精氨酸-10（&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;；&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赖氨酰内肽酶（LysC）</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr><td>纳升液相色谱柱温箱</td><td>MPI design, MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>月桂酰肌氨酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S（300 &amp;Aring;，50 &amp;micro;m）聚合物反相填料</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan 泛素化残基基序（K-&amp;epsilon;-GG）试剂盒</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 cc 真空小柱</td><td>Waters</td><td>WAT036790</td><td>在用 PLRP-S 填料填充小柱前，需先将 tC18 材料从小柱中移除</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，TPCK 处理</td><td>ThermoFisher</td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

蛋白质通过小分子蛋白泛素进行翻译后修饰，参与多种细胞活动。在泛素化蛋白质经胰蛋白酶消化后，可产生带有二甘氨酸残基共价连接至赖氨酸ε-氨基的肽段（“K-ε-二甘氨酸”或简称为“diGly”），可用于追溯原始修饰位点。通过高效的diGly肽段免疫富集结合质谱高灵敏度检测，迄今已鉴定的泛素化位点数量大幅增加。我们对该实验流程进行了多项优化，包括在富集步骤前对肽段进行离线高pH反相分级分离，以及在离子导向多极装置中采用更先进的肽段碎裂参数设置。此外，使用基于滤膜的微柱对样本进行更高效的纯化，有助于保留抗体磁珠，从而提高对diGly肽段的富集特异性。这些改进使得在蛋白酶体抑制条件下，从人宫颈癌细胞（HeLa）裂解液中常规检测到超过23,000个diGly肽段。我们展示了该策略在多种不同类型细胞以及脑组织等体内样本泛素化修饰谱深度分析中的有效性。本研究为蛋白质泛素化分析工具箱提供了新的方法，有助于深入揭示细胞内复杂的泛素化修饰图谱。

蛋白质经胰蛋白酶消化后，泛素化蛋白会在靶向赖氨酸残基上留下114.04 Da的二甘氨酸（diglycine）残留基团。质谱实验中可利用该基团引起的质量差异，明确识别泛素化位点。本文所述策略是一种前沿方法，用于通过纳米液相色谱-串联质谱（nanoflow LC-MS/MS）对二甘氨酸肽（diGly peptides）进行富集及后续鉴定（图1A）。本研究中使用了培养细胞和体内样本作为蛋白质的生物来源，但本方案适用于任何蛋白质来源。按照本方案操作，从2-20 mg输入蛋白中可直接鉴定出10,000-25,000个二甘氨酸肽。为提高细胞中蛋白质泛素化程度，可在收获细胞前数小时加入蛋白酶体抑制剂（如bortezomib或MG132）。若未使用蛋白酶体抑制剂，所鉴定出的二甘氨酸肽数量通常显著降低（减少30-40%）。
我们对现有方案进行了多项改进。首先，基于反相色谱并结合...

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。

蛋白质经由小分子蛋白泛素进行的翻译后修饰参与多种细胞活动。在胰蛋白酶消化后……

蛋白质通过小分子蛋白泛素进行翻译后修饰，参与细胞内的多种生命活动。本研究为蛋白质泛素化分析工具箱提供了一种原创性的补充方法。我们采用富集技术结合质谱分析，以揭示深度泛素化修饰组。我们对源自泛素化蛋白的diGly肽段分析进行了多项改进，包括在富集前进行粗肽分离，以及在Orbitrap中采用更先进的肽段碎裂设置。这些改进共同实现了对泛素化修饰组更全面的覆盖。该方案的多个方面难以用文字描述。对某些关键步骤进行可视化展示，对于不同实验室的不同操作人员重复这些分析至关重要。本实验程序将由我实验室的高级技术员 Karel Bezstarosti 进行演示。首先为实验准备培养的细胞或小鼠脑组织。若使用细胞，将一个150平方厘米培养皿中的细胞沉淀在2毫升冰上预冷的、含0.5%脱氧胆酸钠的50毫摩尔Tris HCl中裂解。将裂解液在95摄氏度下煮沸5分钟。然后在4°C条件下超声处理10分钟。若使用小鼠体内脑组织，需在冰浴缓冲液中进行裂解，缓冲液含有100 mmol/L Tris HCl、12 mmol/L 脱氧胆酸钠和12 mmol/L N-月桂酰肌氨酸钠。将裂解液在4°C条件下超声处理10分钟。然后在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟。接下来，使用比色法吸光度 BCA 蛋白检测试剂盒定量总蛋白量，该蛋白量应至少达到几毫克，以确保泛素化二甘氨酸肽免疫沉淀实验成功。对于 SILAC 实验，根据总蛋白量将轻标和重标蛋白按 1:1 的比例混合。在50摄氏度下，用5毫摩尔DTT还原所有蛋白质30分钟。随后在避光条件下，用10毫摩尔碘乙酰胺烷基化15分钟。然后用Lys-C进行蛋白质消化，持续4小时。30摄氏度下过夜或室温条件下进行胰蛋白酶消化。次日，将样品分装至两个2毫升的Eppendorf管中，并向消化后的样品中加入三氟乙酸（TFA），使其终浓度为0.5%。在10,000 × g离心10分钟，以沉淀并去除所有去垢剂。收集含有肽段的上清液，用于后续的分级分离。采用高pH反相C18色谱法对胰蛋白酶消化后的肽段进行分级分离。准备一个空的6毫升柱 cartridge，装填约0.5克固定相材料，适用于约10毫克蛋白质消化产物。将肽段上样至预装柱中，先用约10倍柱体积的0.1% TFA冲洗，再用10倍柱体积的水洗涤。使用10个柱体积的10毫摩尔每升甲酸铵溶液，分别含7%、13.5%和50%乙腈，将肽段洗脱为三个组分。随后，对所有组分进行裂解。将一批与蛋白A琼脂糖珠悬液偶联的泛素残基基序抗体均分为六个相等的部分。根据手稿说明溶解三种肽组分，并离心去除残渣。将三种组分的上清液加入珠子悬液中，同时将另外三种组分置于冰上。然后在4°C条件下，于旋转仪上孵育两小时。然后，离心沉淀珠子。将上清液转移至新的一批珠子中，并用剩余的三份珠子悬液重复孵育步骤。将上清液保存用于后续的全蛋白质组分析。将磁珠转移至装有GFF滤芯插头的200微升移液枪头中。将枪头放入配有离心尖端适配器的1.5毫升离心管中，用200微升冰预冷的IAP缓冲液洗涤磁珠三次，随后用冰预冷的纯化水再洗涤三次。每次洗涤之间，以200 × g离心2分钟，注意不要让柱子干涸。最后一次洗涤后，用50 µL 0.15% TFA分两次洗脱肽段。使用C18固相萃取小柱对肽段进行脱盐，并通过真空离心干燥。在配备纳米流液相色谱系统的高灵敏度质谱仪上进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）实验。色谱柱按照文稿中的说明进行安装，并保持在50摄氏度。质谱仪采用数据依赖性采集模式运行。以高分辨率采集MS1质谱数据，自动增益控制目标值设为4E5，最大注入时间设为50毫秒。采用最强烈度优先模式进行质谱分析，使用最高速度方法，总循环时间为3秒。随后在最低强度优先模式下进行第二轮DDA MS分析，以确保对低丰度肽段实现最佳检测。根据前体离子的电荷态和单一同位素峰指认结果对前体离子进行筛选，并在60秒内动态排除已检测过的前体离子。使用四极杆质量过滤器将肽段前体离子分离，质量过滤器的宽度设置为1.6 Thomson。然后在离子阱中采集MS2谱图，自动增益控制设为7E3，最大注入时间设为50毫秒，HCD碰撞能量设为30%。使用合适的搜索引擎分析质谱原始数据文件，例如基于Andromeda搜索引擎的免费MaxQuant软件套件。打开MaxQuant，选择相应的原始数据文件，设置处理器数量，然后点击“组别特定参数”选项卡。选择消化方式，并允许三个漏切位点。然后选择修饰，在可变修饰中添加 diGly。选择全局参数选项卡，并添加正确的蛋白质序列数据库。保留其他设置为默认值，然后点击“开始”以执行数据库搜索。对于 SILAC 实验文件的定量分析，将多重性设置为 2，并选择重链氨基酸标记。搜索完成后，将文本文件导入 Perseus。本方案通过纳米流液相色谱-串联质谱法（nanoflow LC-MS/MS）检测二甘氨酸（diGly）肽段，用于鉴定培养细胞及体内样品中蛋白质的泛素化位点。相较于现有方案，本方法进行了多项改进，显著提高了检测到的diGly肽段数量。在免疫沉淀之前，对样品进行了粗分级分离，分为三个组分。其中一个组分含有泛素自身K48修饰的胰蛋白酶二甘氨酸肽（diGly肽），其在液相色谱图中表现为一个宽峰。此外，在数据分析过程中，调整了肽段碎裂模式，将最高丰度优先和最低丰度优先的碎裂模式结合进行LC-MS运行，从而额外鉴定出超过4,000个独特的二甘氨酸肽。从一份经蛋白酶体抑制剂处理的HeLa细胞样品中，通常可鉴定出超过23,000个二甘氨酸肽。在三次生物学重复实验中鉴定出的所有diGly肽段中，超过9,000种在全部三次重复中均被检测到，而超过17,000种在三次重复中的至少两次中被检测到。肽段的鉴定数量在很大程度上取决于输入样品的量。根据起始材料的不同，可大致预估鉴定出的diGly肽段数量，但这些数值仅为估计值，还会受到所用质谱仪类型的影响。在执行本方案时，若具备基于质谱的蛋白质组学方法经验，以及处理和分析微量样品的经验，将具有明显优势。MaxQuant 软件可用任何其他数据库搜索算法替代。此外，也可使用其他类型的质谱仪。在肽段鉴定方面的结果可能略有差异，但这是基于质谱的蛋白质组学检测中的常见现象。泛素在介导蛋白质降解过程中具有重要作用，同时也参与细胞内的许多其他生物学过程。深入理解泛素作为一种翻译后修饰的特性，对于更好地阐明其功能至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过肽浓缩和质谱检测蛋白质泛化位点检测

泛素化是一种由三种酶共同完成的关键翻译后修饰过程。参与该修饰过程的基因突变与多种人类疾病相关。本文中，我们描述了在培养细胞中进行体内（in vivo）以及在试管中进行体外（in...

蛋白质泛素化检测

稳定同位素标准与抗肽抗体富集技术（SISCAPA）将肽段的亲和富集与稳定同位素稀释质谱法（MRM-MS）相结合，可对肽段进行定量检测，从而间接反映其对应蛋白质的含量。本文描述了使用磁性微粒并在部分自动化条件下进行该实验的操作流程。...

使用肽免疫亲和富集联合质谱法进行蛋白质定量

在本视频中，我们演示了从肽段混合物中使用抗体进行磷酸化肽段的免疫沉淀。富集后的磷酸化肽段经真空浓缩并保存，用于后续分析。...

磷酸化肽富集：一种基于抗体的免疫沉淀技术，用于从复杂的肽混合物中分离特异性的磷酸化肽

本视频介绍了一种从复杂的肽混合物中提取并纯化含有甘氨酸残基二肽片段的泛素化肽的方法。该方法有助于鉴定蛋白质中原始的泛素化位点。...

基于免疫亲和的泛素化肽段提取：一种从纯化肽段组分中选择性提取泛素标记肽段的技术

本方案描述了一种从前列腺癌细胞系或组织中提取并富集磷酸化肽段以进行磷酸化蛋白质组分析的实验方法 通过...

磷酸化肽段富集联合非标记定量质谱法研究前列腺癌磷酸化蛋白质组

本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。...

泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

该方法描述了泛素链拓扑结构全局变化的评估。该评估通过基于质谱的靶向蛋白质组学方法来实现。...

泛素链的平行反应监测分析

通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A（EYFP-CENP-A）的泛素化修饰

我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。...

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

本方案描述了一种从哺乳动物细胞中纯化泛素化蛋白的逐步方法，并以p53肿瘤抑制蛋白为例。在严格的非变性与变性条件下，从细胞中纯化出泛素化的p53蛋白。...

从哺乳动物细胞中纯化泛素化p53蛋白

泛素化是细胞内蛋白质功能的关键调控机制。本文介绍了两种用于检测哺乳动物细胞中底物蛋白泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在HEK293T细胞中诱导蛋白过表达，并通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。...

以SMAD2/SMURF2为模型在哺乳动物细胞裂解液中检测泛素化的比较策略

学习通过肽浓缩和质谱技术检测蛋白质泛素化位点的方法，利用diGly肽段富集和Orbitrap高级碎裂设置实现深度泛素组学分析。该技术可显著提高泛素化蛋白鉴定覆盖率和实验可重复性。

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

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