Name: 利用 Crispr-ca 在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学习利用CRISPR-Cas9技术在人类细胞系中进行基因敲除和敲入的基因组编辑方法。该方案简单高效，适合初学者快速掌握基因工程核心操作。

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M.H.T. 获得新加坡科技研究局联合理事会办公室基金（1431AFG103）、新加坡国家医学研究委员会基金（OFIRG/0017/2016）、国家研究基金会基金（NRF2013-THE001-046 和 NRF2013-THE001-093）、教育部第一层次基金（RG50/17 (S)）、南洋理工大学启动基金，以及南洋理工大学提供的国际基因工程机器大赛（iGEM）竞赛资金支持。

<ol><li>Epinat, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+engineered+meganuclease+induces+homologous+recombination+in+yeast+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).</li>
<li>Arnould, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+I-CreI+derivatives+cleaving+sequences+from+the+human+XPC+gene+can+induce+highly+efficient+gene+correction+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).</li>
<li>Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganucleases+can+restore+the+reading+frame+of+a+mutated+dystrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin.</a> Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+sequence-specific+TAL+effectors+for+modulating+mammalian+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).</li>
<li>Boch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+code+of+DNA+binding+specificity+of+TAL-type+III+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.</a> Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Cas9+in+complex+with+guide+RNA+and+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA.</a> Cell. 156 (5), 935-949 (2014).</li>
<li>Yamano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+Cpf1+in+Complex+with+Guide+RNA+and+Target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA.</a> Cell. 165 (4), 949-962 (2016).</li>
<li>Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference+directs+strand+specific+spacer+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition.</a> PLoS One. 7 (4), e35888(2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadening+the+targeting+range+of+Staphylococcus+aureus+CRISPR-Cas9+by+modifying+PAM+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition.</a> Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+CRISPR-Cas+systems+reveals+design+principles+for+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells.</a> Genome Biology. 19 (1), 62(2018).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+with+a+small+Cas9+orthologue+derived+from+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni.</a> Nature Communications. 8, 14500(2017).</li>
<li>Edraki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact%2C+High-Accuracy+Cas9+with+a+Dinucleotide+PAM+for+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing.</a> Molecular Cell. , (2018).</li>
<li>Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+PAM+specificity+of+a+highly+similar+SpCas9+ortholog%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+thermophilus+CRISPR-Cas9+Systems+Enable+Specific+Editing+of+the+Human+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Therapy%22%5BJournal%5D)">Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome.</a> Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).</li>
<li>Esvelt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+Cas9+proteins+for+RNA-guided+gene+regulation+and+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing.</a> Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).</li>
<li>Boratyn, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%3A+a+more+efficient+report+with+usability+improvements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">BLAST: a more efficient report with usability improvements.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP%3A+a+CRISPR%2FCas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+DNA+increases+gene+disruption+efficiency+by+altering+DNA+repair+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes.</a> Nature Communications. 7, 12463(2016).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Zhang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+precise+knockin+with+a+double+cut+HDR+donor+after+CRISPR%2FCas9-mediated+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 35(2017).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cpf1+mediates+efficient+homology-directed+repair+and+temperature-controlled+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing.</a> Nature Communications. 8 (1), 2024(2017).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+scarless+human+stem+cell+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimization of scarless human stem cell genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
</ol>

作者不存在竞争性财务利益。

CRISPR-Cas 系统是一种强大且革命性的技术，可用于动植物基因组和转录组的编辑。已发现多种细菌含有 CRISPR-Cas 系统，这些系统可能被改造用于基因组和转录组工程44。尽管来自Streptococcus pyogenes（SpCas9）的 Cas9 核酸酶是首个在人类细胞中成功应用的酶21,22,23,24，但其他细菌来源的酶，包括表1中列出的那些，也已被证明在人类细胞中作为编辑工具具有良好的功能16,26,27,28。...

对任何生物体基因组进行编辑的能力在生物医学和生物技术领域具有广泛的应用，例如校正致病突变、构建用于疾病研究的精确细胞模型，或培育具有优良性状的农作物。自本世纪初以来，已开发出多种用于哺乳动物细胞基因组编辑的技术，包括巨核酸酶1,2,3、锌指核酸酶4,5以及转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）6,7,8,9。然而，这些早期技术要么难以编程，要么构建过程繁琐，从而限制了它们在科研和工业领域的广泛应用。
近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白（Cas）系统已成为一种强大的新型基因组编辑技术10,11。该系统最初是细菌中的一种适应性免疫系统，现已成功应用于包括人类在内的动植物基因组修饰。CRISPR-Cas在短时间内获得广泛关注的主要原因之一在于，引导关键Cas核酸酶（如Cas9或Cas12a，亦称Cpf1）到达基因组特定位置的元件仅是一段简短的嵌合单链向导RNA（sgRNA），其设计简便且合成成本低廉。当Cas酶被招募至靶位点后，其功能类似于一对分子剪刀，利用RuvC、HNH或Nuc结构域切割结合的DNA12,13,14。由此产生的双链断裂（DSB）随后由细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径进行修复。在缺乏修复模板的情况下，DSB通过易出错的NHEJ途径修复，可能在切割位点处引入随机的核苷酸插入或缺失（indels），从而可能导致蛋白质编码基因发生移码突变。然而，若存在包含目标DNA序列改变的供体模板，则DSB将通过高保真的HDR途径进行修复。常见的供体模板类型包括单链寡核苷酸（ssODNs）和质粒。前者通常用于较小的DNA序列改变（例如单个碱基对的替换），而后者则通常用于向目标位点插入较长的DNA序列（例如绿色荧光蛋白或GFP的编码序列）。
Cas蛋白的内切酶活性需要在靶位点存在原间隔序列邻近基序（PAM）15。Cas9的PAM位于原间隔序列的3’端，而Cas12a（也称为Cpf1）的PAM则位于5’端16。如果缺乏PAM，Cas-向导RNA复合物便无法引入双链断裂（DSB）17。因此，PAM限制了特定Cas核酸酶可在基因组中进行切割的位点范围。幸运的是，来自不同细菌物种的Cas核酸酶通常具有不同的PAM识别要求。因此，通过将多种CRISPR-Cas系统整合到我们的基因编辑工具箱中，可以扩大基因组中可靶向的位点范围。此外，天然的Cas酶可通过工程化改造或定向进化以识别不同的PAM序列，从而进一步拓展可操作的基因组靶标范围18,19,20。
尽管存在多种可用于基因组编辑的CRISPR-Cas系统，但大多数技术使用者主要依赖来自Streptococcus pyogenes的Cas9核酸酶（SpCas9），原因有多个。首先，它仅需一个相对简单的NGG PAM序列，而许多其他Cas蛋白只能在更复杂的PAM存在时才能进行切割。其次，SpCas9是首个成功应用于人类细胞的Cas内切酶21,22,23,24。第三，迄今为止，SpCas9是表征最为充分的Cas酶。如果研究人员希望使用其他Cas核酸酶，通常会不清楚如何最优地设计实验，以及这些酶在不同生物学背景下相对于SpCas9的表现如何。
为了明确不同CRISPR-Cas系统之间的相对性能，我们近期对五种Cas核酸内切酶进行了系统性比较——包括SpCas9、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）来源的Cas9酶（SaCas9）、脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）来源的Cas9酶（NmCas9）、嗜酸菌属（Acidaminococcus sp. BV3L6）来源的Cas12a酶（AsCas12a），以及毛螺菌科细菌（Lachnospiraceae bacterium ND2006）来源的Cas12a酶（LbCas12a）25。为实现公平比较，我们采用相同的一组靶位点及其他实验条件对这些Cas核酸酶进行了评估。该研究还明确了每种CRISPR-Cas系统的设计参数，可为技术使用者提供有价值的参考。在此，为了更好地帮助研究人员利用CRISPR-Cas系统，我们提供了一套使用不同Cas9和Cas12a酶进行高效基因组编辑的分步操作方案（见图1）。该方案不仅包含实验操作细节，还涵盖了关键的设计考量因素，以最大程度提高在哺乳动物细胞中实现成功基因组编辑的可能性。
<img alt="CRISPR 基因编辑流程图；sgRNA 设计、克隆、细胞转导、克隆筛选。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：构建基因组编辑人源细胞系的工作流程概览。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59086/59086fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>T4 多核苷酸激酶（PNK）</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>虾碱性磷酸酶（rSAP）</td><td>NEB</td><td>M0371</td><td></td></tr><tr><td>Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液，50X</td><td>1st Base</td><td>BUF-3000-50X4L</td><td>使用前稀释至1X。1X溶液含有40 mM Tris、20 mM乙酸和1 mM EDTA。</td></tr><tr><td>Tris-EDTA（TE）缓冲液，10X</td><td>1st Base</td><td>BUF-3020-10X4L</td><td>使用前稀释至1X。1X溶液含有10 mM Tris（pH 8.0）和1 mM EDTA。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>NEB</td><td>R0580</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>400,000 单位/ml</td></tr><tr><td>快速连接试剂盒</td><td>NEB</td><td>M2200</td><td>T4 DNA连接酶的替代品。</td></tr><tr><td>快速DNA连接试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1423</td><td>T4 DNA连接酶的替代品。</td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>451245</td><td>试剂盒中的TOPO载体附带盐溶液。</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA组装预混液</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>用于Gibson组装的试剂盒。</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 化学感受态大肠杆菌</td><td>Thermo Scientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤（Lennox），粉末</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>用ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O溶解，使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>含琼脂的LB肉汤（Lennox），粉末</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td>用ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O溶解，使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>SOC培养基</td><td>-</td><td>-</td><td>1 L LB肉汤中含有2.5 mM KCl、10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、20 mM葡萄糖</td></tr><tr><td>氨苄青霉素（钠盐），USP级</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301</td><td></td></tr><tr><td>REDiant 2X PCR预混液</td><td>1st Base</td><td>BIO-5185</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>1st Base</td><td>BIO-1000</td><td></td></tr><tr><td>T7核酸内切酶I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td></td></tr><tr><td>质粒DNA提取小量试剂盒</td><td>Favorgen</td><td>FAPDE 300</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），高糖</td><td>Hyclone</td><td>SH30081.01</td><td>含4.5 g/L葡萄糖，不含L-谷氨酰胺、HEPES和丙酮酸钠</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，10,000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA，1X</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SV30160</td><td>FBS在使用前于56 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C加热灭活30分钟</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，1X</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME转染试剂</td><td>Polyplus Transfection</td><td>114-75</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA提取溶液，1.0</td><td>Epicentre</td><td>LUCG-QE09050</td><td></td></tr><tr><td>ISOLATE II 基因组DNA试剂盒</td><td>Bioline</td><td>BIO-52067</td><td>QuickExtract的替代品</td></tr><tr><td>Q5高保真DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA上样染料</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td>含10 mM Tris-HCl（pH 7.6）、0.03%溴酚蓝、0.03%二甲苯青FF、60%甘油、60 mM EDTA</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物，Set3</td><td>Merck</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜，0.2&amp;micro;m</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸-SDS缓冲液，10X</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>使用前稀释至1X。1X溶液含25 mM Tris、192 mM甘氨酸和0.1% SDS。</td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸缓冲液，10X</td><td>1st base</td><td>BUF-2020</td><td>使用前稀释至1X。1X溶液含25 mM Tris和192 mM甘氨酸。</td></tr><tr><td>丽春红S溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>TBS，20X</td><td>1st base</td><td>BUF-3030</td><td>使用前稀释至1X。1X溶液含25 mM Tris-HCl（pH 7.5）和150 mM NaCl。</td></tr><tr><td>吐温20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>免疫检测用脱脂奶粉</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31149-75</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright Sirius-femtogram HRP</td><td>Advansta</td><td>K12043</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;beta;-肌动蛋白（C4）抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td>批号：C0916</td></tr><tr><td>MiSeq系统</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit荧光计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL细胞成像系统</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR质粒：pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>单载体系统：gRNA由同一质粒表达。</td></tr><tr><td>CRISPR质粒：pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA</td><td>Addgene</td><td>61591</td><td>单载体系统：gRNA由同一质粒表达。</td></tr><tr><td>CRISPR质粒：xCas9 3.7</td><td>Addgene</td><td>108379</td><td>双载体系统：gRNA由不同质粒表达。</td></tr><tr><td>CRISPR质粒：pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>单载体系统：gRNA由同一质粒表达。</td></tr><tr><td>CRISPR质粒：hCas9</td><td>Addgene</td><td>41815</td><td>双载体系统：gRNA由不同质粒表达。</td></tr><tr><td>CRISPR质粒：eSpCas9(1.1)</td><td>Addgene</td><td>71814</td><td>单载体系统：gRNA由同一质粒表达。</td></tr><tr><td>CRISPR质粒：VP12 (SpCas9-HF1)</td><td>Addgene</td><td>72247</td><td>双载体系统：gRNA由不同质粒表达。</td></tr></tbody></table>

使用crispr-cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统在细菌的适应性免疫中具有天然功能，但已被成功改造用于多种不同生物体的基因组编辑。最常见的是利用野生型CRISPR相关蛋白9（Cas9）或Cas12a核酸内切酶切割基因组中的特定位点，随后根据是否存在供体模板，通过非同源末端连接（NHEJ）途径或同源定向修复（HDR）途径修复DNA双链断裂。迄今为止，已发现来自不同细菌物种的CRISPR系统均能在哺乳动物细胞中实现基因组编辑。然而，尽管该技术看似简单，仍需考虑多个设计参数，这常常使使用者对如何最优地开展基因组编辑实验感到困惑。本文介绍了一个从实验设计到鉴定携带目标DNA修饰的细胞克隆的完整工作流程，旨在促进在哺乳动物细胞系中成功实施基因组编辑实验。我们强调了用户需注意的关键因素，包括CRISPR系统的选择、间隔序列长度以及单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体模板的设计。我们预期该工作流程将有助于基因敲除研究、疾病建模或报告细胞系的构建。

为了进行基因组编辑实验，需要克隆一种表达靶向目标位点的sgRNA的CRISPR质粒。首先，使用限制性内切酶（通常为IIs型酶）对质粒进行消化以将其线性化。建议将消化产物与未消化的质粒一同在1%琼脂糖凝胶上电泳，以区分完全消化与部分消化。由于未消化的质粒呈超螺旋结构，其迁移速度通常快于线性化的质粒（见图7a）。其次，需将两条sgRNA寡核苷酸退火后连接至切割后的质粒中。为了确认寡核苷酸是否成功克隆到CRISPR质粒骨架中，需进行菌落PCR检测（见图7b）。随后接种阳性克隆，并提取质粒送测Sanger测序。
<img alt="凝胶电泳结果、DNA分离、大小比较、bp标记物、基因分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59086/59086fig7.jpg" data-altupdated...

CRISPR-Cas 是一种用于编辑动植物复杂基因组的强大技术。本文详细介绍了一种利用不同 Cas 核酸酶高效编辑人类基因组的实验方案。我们强调了优化编辑效率所需考虑的关键因素和设计参数。

使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统在细菌适应性免疫中具有天然功能，但已被……

本方案采用 CRISPR-Cas9 技术构建基因敲除或基因敲入细胞系。该技术的主要优势在于操作简便、效率高，尤其适合初学者研究人员。进行细胞传代时，每孔板加入两毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，于 37°C 处理两分钟。当细胞从培养板底部脱落时，加入两毫升细胞培养基以中和酶促反应，并将细胞悬液转移至锥形管中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于五毫升新鲜细胞培养基中进行计数。随后，将1.8 × 10⁵个细胞接种至24孔组织培养板的一个孔中，在37°C和5%二氧化碳条件下过夜培养。进行细胞转染时，根据实验设计和试剂生产商的说明书，将含有适当浓度CRISPR质粒的转染混合物以适当体积加入到相应体积的转染试剂中。在室温下孵育转染混合物推荐的时间后，将溶液逐滴加入细胞中。然后轻轻摇动培养板以混匀，并将培养板置于含5%二氧化碳的湿润化37摄氏度培养箱中。转染结束后，加入150微升胰蛋白酶-EDTA溶液以解离细胞，操作方法如前所示，然后通过离心收集脱离的细胞。将细胞沉淀重悬于含2%胎牛血清的PBS溶液中，并通过30微米滤网过滤，收集至5毫升荧光激活细胞分选（FACS）管中。接着使用未转染的细胞在流式细胞仪上设定阴性对照门控，根据转染所用CRISPR质粒上的荧光标记对转染细胞进行分选，收集至含有100微升细胞培养基的离心管中。收集所有转染的细胞后，以最大速度离心形成细胞沉淀，并将沉淀重悬于 300 微升细胞培养基中。取 200 微升细胞悬液接种至 24 孔组织培养板的一个孔中，置于 37 摄氏度培养箱中培养数天，使细胞恢复生长。将剩余的 100 微升分选细胞以最大速度离心 5 分钟，收集细胞沉淀，并根据标准基因组 DNA 提取方案从所得沉淀中提取基因组 DNA。接下来，加入10 µL聚合酶链式反应缓冲液、1 µL脱氧核苷酸混合物、2.5 µL用户自定义的反向引物、0.5 µL DNA聚合酶、2至5 µL提取的基因组DNA模板，以及足量的双蒸水，使反应体系总体积达到50 µL。将混合物在热循环仪中进行扩增，然后按照标准操作流程，使用1×TAE缓冲液在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。使用洁净锋利的手术刀切下目标聚合酶链式反应产物条带，并按照试剂盒说明书，利用凝胶回收试剂盒纯化DNA。使用分光光度计在260纳米波长处测定产物的浓度。配制反应混合液，其中包含200纳克的分离DNA、2微升T7内切酶I反应缓冲液，以及足量的双蒸水，使混合液终体积达到19微升。在热循环仪中按照指定参数对聚合酶链式反应产物进行重退火，并将5单位的T7内切酶I与重退火后的产物混合，在37摄氏度下孵育50分钟。孵育结束后，使用1× TAE缓冲液在2.5%琼脂糖凝胶上分离消化后的DNA，并在适当的凝胶成像系统上成像。在ImageJ中打开凝胶图像，尽可能贴近条带边界绘制一个矩形框。点击“Analyze”（分析），选择“Set Measurements”（设置测量），确认已勾选面积、平均灰度值和积分密度选项。单击“确定”，然后选择“分析”和“测量”。平均值或原始荧光密度值可反映条带强度。当转染培养的细胞开始汇合时，用胰蛋白酶-EDTA将其消化脱离，如图所示，并将细胞稀疏接种于100毫米组织培养皿中，以提供充足空间，使单个克隆在放回细胞培养箱前能够充分生长。当菌落开始形成时，使用4倍放大倍数的显微镜挑选单个菌落，转移至含有500 µL细胞培养基的24孔板的各个孔中。操作时注意移液枪头不要接触周围的菌落，以防止不同菌落在单个孔内混合；也可选择从菌落分布稀疏的区域进行挑取。所有克隆挑取完毕后，将培养板放入细胞培养箱中，直至细胞生长至完全汇合。由于未消化的质粒呈超螺旋结构，其电泳迁移速度通常快于线性化的质粒。为了确认寡核苷酸是否成功克隆到CRISPR质粒骨架中，需进行菌落PCR，并对阳性克隆进行接种培养，随后提取质粒并送测Sanger测序。当质粒成功递送后，可在显微镜下直接观察到荧光信号，从而通过流式细胞术对转染细胞进行分选。通过T7核酸内切酶I检测，根据琼脂糖凝胶上观察到的条带强度计算基因组DNA的切割效率。此外，如果基于同源定向修复的实验设计旨在在靶位点引入一个限制性酶切位点，则可使用相应的限制性内切酶进行限制性片段长度多态性检测。为进一步验证蛋白编码基因是否成功失活，可进行蛋白质印迹（Western blot）检测，以确认目标蛋白不存在。转染后对细胞进行分选可去除未摄入质粒的细胞，从而提高后续筛选阶段中具有基因敲除或基因敲入的细胞比例。随着该技术的发展，我们现在能够构建基因敲除细胞系以研究基因功能，以及构建基因敲入细胞系以模拟特定疾病并阐明其作用机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

利用 Crispr-ca 在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

CRISPR/Cas9 是一种强大的系统，可用于破坏基因和遗传元件。本文介绍了一种利用 CRISPR/Cas9...

利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞系中产生基因组缺失

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

本文介绍了一种利用电穿孔管对哺乳动物细胞进行高效CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的基因编辑的实验方案。...

通过电穿孔转染CRISPR/Cas9核糖核蛋白实现精确基因编辑

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

本方案描述了利用质粒DNA转染和mRNA核转染技术，在人源细胞系中进行基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的表观基因组编辑的方法。...

利用质粒DNA转染和mRNA核转染递送在人类细胞中进行CRISPR表观基因组编辑

以RNA形式递送基因组编辑器是修饰原代哺乳动物细胞和细胞系基因组的一种特别有效的方法。本方案的目标是将基因组编辑器以mRNA形式递送至原代哺乳动物细胞和细胞系中，随后通过靶向Illumina测序与分析，定量编辑结果。...

通过电穿孔递送编辑器RNA在原代哺乳动物细胞中进行基因组编辑

学习利用CRISPR-Cas9技术在人类细胞系中进行基因敲除和敲入的基因组编辑方法。该方案简单高效，适合初学者快速掌握基因工程核心操作。

使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

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