使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

本方案采用 CRISPR-Cas9 技术构建基因敲除或基因敲入细胞系。该技术的主要优势在于操作简便、效率高，尤其适合初学者研究人员。进行细胞传代时，每孔板加入两毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，于 37°C 处理两分钟。

当细胞从培养板底部脱落时，加入两毫升细胞培养基以中和酶促反应，并将细胞悬液转移至锥形管中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于五毫升新鲜细胞培养基中进行计数。随后，将1.8 × 10⁵个细胞接种至24孔组织培养板的一个孔中，在37°C和5%二氧化碳条件下过夜培养。

进行细胞转染时，根据实验设计和试剂生产商的说明书，将含有适当浓度CRISPR质粒的转染混合物以适当体积加入到相应体积的转染试剂中。在室温下孵育转染混合物推荐的时间后，将溶液逐滴加入细胞中。然后轻轻摇动培养板以混匀，并将培养板置于含5%二氧化碳的湿润化37摄氏度培养箱中。

转染结束后，加入150微升胰蛋白酶-EDTA溶液以解离细胞，操作方法如前所示，然后通过离心收集脱离的细胞。将细胞沉淀重悬于含2%胎牛血清的PBS溶液中，并通过30微米滤网过滤，收集至5毫升荧光激活细胞分选（FACS）管中。接着使用未转染的细胞在流式细胞仪上设定阴性对照门控，根据转染所用CRISPR质粒上的荧光标记对转染细胞进行分选，收集至含有100微升细胞培养基的离心管中。

收集所有转染的细胞后，以最大速度离心形成细胞沉淀，并将沉淀重悬于 300 微升细胞培养基中。取 200 微升细胞悬液接种至 24 孔组织培养板的一个孔中，置于 37 摄氏度培养箱中培养数天，使细胞恢复生长。将剩余的 100 微升分选细胞以最大速度离心 5 分钟，收集细胞沉淀，并根据标准基因组 DNA 提取方案从所得沉淀中提取基因组 DNA。

接下来，加入10 µL聚合酶链式反应缓冲液、1 µL脱氧核苷酸混合物、2.5 µL用户自定义的反向引物、0.5 µL DNA聚合酶、2至5 µL提取的基因组DNA模板，以及足量的双蒸水，使反应体系总体积达到50 µL。将混合物在热循环仪中进行扩增，然后按照标准操作流程，使用1×TAE缓冲液在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。使用洁净锋利的手术刀切下目标聚合酶链式反应产物条带，并按照试剂盒说明书，利用凝胶回收试剂盒纯化DNA。

使用分光光度计在260纳米波长处测定产物的浓度。配制反应混合液，其中包含200纳克的分离DNA、2微升T7内切酶I反应缓冲液，以及足量的双蒸水，使混合液终体积达到19微升。在热循环仪中按照指定参数对聚合酶链式反应产物进行重退火，并将5单位的T7内切酶I与重退火后的产物混合，在37摄氏度下孵育50分钟。

孵育结束后，使用1× TAE缓冲液在2.5%琼脂糖凝胶上分离消化后的DNA，并在适当的凝胶成像系统上成像。在ImageJ中打开凝胶图像，尽可能贴近条带边界绘制一个矩形框。点击“Analyze”（分析），选择“Set Measurements”（设置测量），确认已勾选面积、平均灰度值和积分密度选项。

单击“确定”，然后选择“分析”和“测量”。平均值或原始荧光密度值可反映条带强度。当转染培养的细胞开始汇合时，用胰蛋白酶-EDTA将其消化脱离，如图所示，并将细胞稀疏接种于100毫米组织培养皿中，以提供充足空间，使单个克隆在放回细胞培养箱前能够充分生长。

当菌落开始形成时，使用4倍放大倍数的显微镜挑选单个菌落，转移至含有500 µL细胞培养基的24孔板的各个孔中。操作时注意移液枪头不要接触周围的菌落，以防止不同菌落在单个孔内混合；也可选择从菌落分布稀疏的区域进行挑取。所有克隆挑取完毕后，将培养板放入细胞培养箱中，直至细胞生长至完全汇合。

由于未消化的质粒呈超螺旋结构，其电泳迁移速度通常快于线性化的质粒。为了确认寡核苷酸是否成功克隆到CRISPR质粒骨架中，需进行菌落PCR，并对阳性克隆进行接种培养，随后提取质粒并送测Sanger测序。当质粒成功递送后，可在显微镜下直接观察到荧光信号，从而通过流式细胞术对转染细胞进行分选。

通过T7核酸内切酶I检测，根据琼脂糖凝胶上观察到的条带强度计算基因组DNA的切割效率。此外，如果基于同源定向修复的实验设计旨在在靶位点引入一个限制性酶切位点，则可使用相应的限制性内切酶进行限制性片段长度多态性检测。为进一步验证蛋白编码基因是否成功失活，可进行蛋白质印迹（Western blot）检测，以确认目标蛋白不存在。

转染后对细胞进行分选可去除未摄入质粒的细胞，从而提高后续筛选阶段中具有基因敲除或基因敲入的细胞比例。随着该技术的发展，我们现在能够构建基因敲除细胞系以研究基因功能，以及构建基因敲入细胞系以模拟特定疾病并阐明其作用机制。