改进 x 射线激光时分辨序列飞秒晶体学微晶的高粘度挤出
2019年2月28日
时间解析的飞秒晶体学实验的成功取决于有效的样品传递。在这里, 我们描述了从高粘度微挤压喷射器中优化细菌视紫红质微晶挤出的方案。该方法依赖于样品同质化与一种新的三向耦合器和可视化与高速相机。
该协议旨在确保在时间解析的串行晶体学实验中经常遇到的问题不会损害数据质量。这种方法的一个主要优点是它对单个晶体系统的适应性。高速摄像机挤出测试还使我们能够直接测量挤出稳定性。
首先，在注射前约30分钟将50微升的结晶单醇基LCP装在100微升注射器中。对于注入真空环境，将五升 MAG 7.9 和五微升液体石蜡加载到第二个注射器的背面。垂直握住注射器，将气泡从注射器中排出。
使用 MAG 7.9 和石蜡将注射器连接到标准注射器配线。然后轻轻按压柱塞，清除压入器中的空气，直到在对插针的尖端可见少量混合物。将样品注射器连接到带车的注射器对子，不要将任何空气引入样品中。
通过多次通过副体将样品穿过，混合在脂质和石蜡中。接下来，在另一个100微升注射器中装载20微升预混合LCP。从配对器上取出空注射器，并使用标准注射器配对器将预混合 LCP 连接到含晶体注射器。
然后，将样本通过对两个对分器传递 100 次。要将样品进入立方相，请加入三个单醇微升，混合50次。重复此过程，直到形成透明相，以避免单烯过量。
作为样品刚度和挤出性的初步测试，将空注射器从注射器对子中分离开，并垂直握住注射器，通过注射器挤压少量取样器。如果拉伸样品形成直立圆柱体，则样品已准备好进行拉伸测试。通过添加更多预混料 LCP，将样品的总体积调整为 100 微升。
将样品注射器和两个空注射器连接到三向注射器对子上。将一半样品传递到第二个注射器中，然后同时将样品的两半压入第三个注射器中，至少混合50次。将含有混合样品的注射器放在立体显微镜下，以验证晶体的均匀分布。
净化 HPLC 泵和所有水管，确保流量准确。然后，清除喷油器的液压阶段。接下来，打开相机并连接到随附的软件。
运行实时视频以进行视觉反馈时，将喷嘴尖端放在框架中心，然后通过三轴舞台对焦。将摄像机的帧速率设置为每秒 1，000 帧。然后，将分辨率设置为 512 x 512 像素。
现在，曝光时间由帧速率设置，调整照明水平，直到喷嘴可见。重新定位喷嘴尖端，使喷嘴从左到右居，位于框架的三分之一以上。在时间推移模式下设置摄像机。
将间隔设置为 30 秒，重复设置为 40 次。将触发模式设置为随机。并输入要记录的帧数为 1，000。
现在，将储液罐装载 20 微升的测试样品，并连接毛细管喷嘴。将填充的储液罐连接到喷油器。然后，将气体管路连接到喷嘴上的端口，然后启动气体流。
在此之后，同时启动泵和摄像机录制。监控挤出，直到泵压力在接近预期结束时间时急剧上升。然后，停止记录，关闭泵，通过打开安全阀释放系统压力。
之后，使用分析软件打开视频文件并校准测量工具。在视频中查找在拉伸中可见可跟踪特征的帧。记录帧编号。
接下来，将视频前进到显示相同要素但已移出上一步中其位置的帧。记录帧编号。使用直线测量工具，通过分析测量测量与要素起点和终点的距离。
对视频的每个部分重复上述步骤几次。最后，绘制数据系列。此处所述步骤的理想起始材料是将高密度微晶体并入喷油器的粘性载体介质中。
蛋白质晶体用于收集关于质子泵送细菌罗多普辛的 TRSFX 数据，该数据揭示了光子吸收后发生的超快变化。使用三向对子器制备样品后，对注射器中的材料进行目视检查，显示样品均匀性。显微镜图像可以确认晶体的密度。
当输送介质清晰、粘稠时，样品处于立方相。浊性混合物表明样品处于海绵或跛脚阶段，但并不是决定性的，因为高晶体密度可能会掩盖LCP的清晰度。通过将注射器柱塞从样品中拉出，可以进行低压测试以识别海绵相。
在喷射测试期间，样品应挤出以几乎恒定速度移动的长连续 LCP 列。在滴水模式下运行的样本表示粘度太低。来自形成列的样本的数据应显示挤出保持高于实验参数规定的最小速度。
使用该协议进行优化后，可以在专家设施收集时间解析串行晶体学数据。这将揭示整个蛋白质在执行其功能时的构象变化。
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概述
该协议描述了优化细菌视紫红质微晶体挤出以用于时间分辨序列飞秒晶体学的方法。它强调了样品输送和稳定性对确保高质量数据的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 晶体学
- 生物物理学
- 结构生物学
背景
- 时间分辨序列晶体学对于研究动态过程至关重要。
- 高效的样品输送对于成功的实验至关重要。
- 高粘度微挤出注射器可能在样品处理中带来挑战。
- 可视化技术，如高速摄像机，用于监测样品稳定性。
研究目的
- 开发提高微晶体挤出的协议。
- 解决时间分辨晶体学实验中的常见问题。
- 确保对各种晶体系统的适应性。
使用的方法
- 使用新型三通接头进行样品均质。
- 使用高速摄像机测量挤出稳定性。
- 在注射器中准备基于LCP的单油酸甘油酯晶体。
- 在真空环境中注射特定的液体成分。
主要结果
- 该方法允许直接测量挤出稳定性。
- 展示了对不同晶体系统的适应性。
- 可以在不损害样品完整性的情况下获得高质量数据。
结论
- 优化的样品输送对于成功的晶体学实验至关重要。
- 所开发的协议可以应用于各种实验设置。
- 未来的工作可能集中在进一步完善这些方法以便于更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Optimizing high-viscosity extrusion of microcrystals is critical for maximizing data yield and structural insight in time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) at X-ray lasers. Reliable sample delivery directly impacts the predictive confidence of dynamic protein structure studies, supporting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This methodology enables high-throughput, reproducible workflows essential for advancing structural biology-driven drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein conformational changes following activation, informing target validation.
- Supports mechanistic de-risking by providing high-resolution, time-resolved structural data.
- Facilitates predictive confidence in structure-based drug design by ensuring data quality and reproducibility.
Screening & Assay Development
- Prepares homogenous, high-density microcrystal samples for downstream TR-SFX workflows.
- Standardizes extrusion and delivery conditions, improving assay reproducibility and quantitative output.
- Enables scalable, high-throughput screening of protein structural dynamics under controlled conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant protein states for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of molecular targets.
- Reduces risk in advancing candidates by clarifying dynamic structural mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This optimized extrusion protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting TR-SFX from early hypothesis testing through lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Enables robust hypothesis testing of protein function via time-resolved structural analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative extrusion outputs for comparative condition analysis.
- Analytics: Provides direct measurement of extrusion stability and sample homogeneity using high-speed imaging.
- Translational Research: Connects dynamic structural data to disease-relevant mechanisms when supported by protein system.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol supports a range of microcrystal systems and experimental setups across facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein target studies.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and delivery, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by ensuring high-quality structural data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on dynamic structural insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in crystallography, sample preparation, and high-speed imaging analysis.
- Needs access to specialized injectors, high-speed cameras, and analytical software for extrusion monitoring.
- Demands cross-team standardization of sample mixing and extrusion protocols for reproducibility.
- Adaptable to various microcrystal systems with protocol adjustments based on sample properties.
- Practical limitations include sensitivity to sample viscosity and the need for facility-specific injector compatibility.
