Name: 改进 x 射线激光时分辨序列飞秒晶体学微晶的高粘度挤出 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 了解时间分辨序列飞秒晶体学中高粘度微晶挤出技术的优化方法。本方案使用三路耦合器进行样品均质化，并通过高速相机测试直接测量挤出稳定性，确保获得高质量的结构生物学数据。

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我们感谢Gebhard Schertler、Rafael Abela和Chris Milne支持在PSI使用高粘性注射器。感谢Richard Neutze及其团队就时间分辨晶体学及使用高粘性注射器进行样品递送的相关讨论。在经费支持方面，我们感谢瑞士国家科学基金会提供的资助（项目编号31003A_141235、31003A_159558（授予J.S.）以及PZ00P3_174169（授予P.N.））。本项目还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议No 701646下的资助。

1. 蛋白质晶体样品制备
<ol>
	<li>在准备注射样品前约 30 分钟，将 50 µL 含晶体的以单油精为基础的脂质立方相（LCP）装入一支 100 µL 注射器中。</li>
	<li>在常压下注射时：将 10 µL 液体石蜡装入第二支注射器的后端。将注射器垂直持握，排出其中的气泡。
	<ol>
		<li>在真空环境中注射时：将 5 µL MAG 7.9 和 5 µL 液体石蜡装入第二支注射器的后端。将注射器垂直持握，排出其中的气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装有石蜡/MAG 7.9 的注射器连接至标准注射器连接器，轻轻推动推杆，排出连接器中的空气，直至在连接器针头尖端可见少量（<1 µL）石蜡/脂质。</li>
	<li>将样品注射器连接至注射器连接器，注意避免将空气引入样品中。通过多次将样品物料穿过连接器，使其与脂质/石蜡充分混合。</li>
	<li>将 20 µL 预混的 LCP（27% PEG，100 mM Sorensen 缓冲液，pH 5.6 + MO）装入另一支 100 µL 注射器中。根据需要去除气泡。</li>
	<li>从连接器上取下空注射器，使用标准注射器连接器将预混 LCP 与含晶体的注射器连接。将样品穿过连接器 100 次。 
	注意：样品混合过程可能使样品轻微升温46。应以缓慢速度进行混合，以保持样品温度相对恒定。</li>
	<li>在光源下检查样品的透明度。若已形成澄清均一的 LCP，则进入步骤 1.9。</li>
	<li>为使样品进入立方相，加入 3 µL 单油精并混合 50 次（如上所述）。重复此操作，直至形成透明相，以避免单油精过量。 
	注意：LCP 的形成具有温度依赖性47，在略高于 20 °C 时效果最佳。所需额外添加的单油精量取决于从结晶过程中带入的残余沉淀剂溶液的体积。</li>
	<li>作为样品刚性（LCP 相所预期的特性）和可挤出性的一项初步测试，从注射器连接器上取下空注射器，垂直持握注射器，通过连接器挤出少量样品（<2 µL）。若挤出的样品形成直立的圆柱体，则样品已准备好进行挤出测试。</li>
	<li>通过添加更多预混 LCP（如步骤 1.5 所述），将样品总体积调整至 100 µL。</li>
	<li>将样品注射器和两支空注射器连接至三通注射器连接器（如前所述排出连接器中的空气）。通过将一半样品推入第二支注射器，再同时将两部分样品推入第三支注射器的方式，至少混合 50 次（或直至均匀）。</li>
	<li>将装有混合样品的注射器置于体视显微镜下，以确认晶体分布的均匀性。</li>
</ol>
2. 使用高速摄像装置测试样品挤出
<ol>
	<li>确定实验参数。
	<ol>
		<li>为测试选择喷嘴尺寸。 
		注意：喷嘴尺寸通常为 50 或 75 µm 内径（ID），但可根据具体情况选用约 30–100 µm ID 的任意尺寸。选择依据需权衡平均堵塞时间、背景散射、样品消耗量和命中率。</li>
		<li>根据实验中使用的激光光斑尺寸（1/e2 直径）以及在XFEL上将采用的数据采集方案（例如，交错的明暗数据采集），计算最佳流速。</li>
		<li>根据最佳流速（<img alt="静力平衡概念，ΣFx=0，带受力图；力学中的静态平衡分析" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2">）和选定的喷嘴直径（<img alt="静力平衡图，ΣFx=0，力平衡可视化，物理学教学方法" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3">），计算样品所需流速（<img alt="静力平衡概念，ΣFx=0，受力图；力学中的静态平衡分析" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1">）： 
		<img alt="流体流动方程 \(Q_s = v_e \pi \frac{d^2}{4}\)，描述管道流速分析" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4"> 
		根据注射器的放大因子（<img alt="静力平衡图，ΣFx=0，说明向量力与平衡的向量分析装置" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 6">），计算应在HPLC泵上设定的流速（<img alt="定量相位（Qₚ）符号，表示物理方程中的静力平衡" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 5">）。 
		<img alt="输运现象方程，Qp=QsA，流体力学研究中的相关数学方程" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 7"> 
		根据喷嘴接头的额定压力（<img alt="静力平衡，RMAX符号，用于物理方程中最大半径条件" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 9">）和注射器的放大因子（<img alt="静力平衡图，ΣFx=0公式；自由体图；力与向量" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 10">），计算最大压力（<img alt="静力平衡，ΣFx=0，受力向量图，说明平衡原理" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 8">）： 
		<img alt="功率计算公式 \( P_{\text{MAX}} = \frac{R_{\text{MAX}}}{A} \)，物理学方程" src="/files/ftp_upload/59087/59087eq11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 11"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>如图1所示，搭建高黏度挤出式注射器以用于离线操作。 
	注意：该注射器通过HPLC泵驱动的液压挤出工作，并利用气体调节器控制共流的氦气鞘层。本方案不讨论泵和调节器的具体设置。详见James（2015）48的第四章详细手册。
	<ol>
		<li>清洗泵和所有水路，以确保流速准确。同时清洗注射器的液压部分。</li>
		<li>将注射器（或相机）安装在三轴平台上，以便对高速视频进行构图和对焦。在喷射点周围预留空间，用于放置物镜、照明装置、反射屏以及用于收集废液样品的小烧杯。</li>
		<li>构建一个“假喷嘴”（即连接喷嘴的空储液器），并将其安装在注射器上，以方便定位、对焦和照明。</li>
		<li>安装高速相机，使喷嘴尖端靠近物镜的焦点位置。</li>
		<li>将反射屏置于注射器后方，并调节照明，使喷嘴正面受光。</li>
		<li>开启相机并使用配套软件连接。运行实时视频以获得视觉反馈，将喷嘴尖端置于画面中央，并通过三轴平台调节至清晰对焦。</li>
		<li>调节照明，直至喷嘴清晰可见且背景光照均匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置相机以录制高速延时视频。
	<ol>
		<li>将帧率设为 1000 fps，分辨率为 512 × 512 像素。</li>
		<li>在曝光时间由帧率确定后，调节照明强度，使喷嘴可见（即无欠曝或过曝）。重新定位喷嘴尖端，使其在画面中左右居中，并位于画面上三分之一区域。</li>
		<li>执行任何背景校正或白平衡操作。</li>
		<li>将相机设置为延时拍摄模式。将间隔设为30 s，重复次数设为40次，触发模式设为随机（或随机重置），并输入录制帧数为1000。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向储液器中加入 20 µL 测试样品，并连接毛细喷嘴。</li>
	<li>将装满样品的储液器连接至注射器。将气体管路连接至喷嘴端口，并启动气体流动。</li>
	<li>通过打开管路阀并推动注射器，手动推进活塞。当活塞与储液器中的样品完全接触后，关闭阀门。</li>
	<li>使用计算所得的流速对泵进行编程，并将最大压力设为计算值（参见步骤 2.1.3）。</li>
	<li>同时启动泵和相机录制。</li>
	<li>挤出开始后，调节气体压力以提高稳定性。若液体在喷嘴尖端形成液滴而非连续液柱，则增加气体压力；若因气体流速过大导致剪切力过高而使挤出断裂，或出现快速振荡（ whipping ），则降低压力。</li>
	<li>监测挤出过程（通常 10 分钟足以判断是否达到均匀流动状态），当泵压力在预期结束时间附近急剧上升时，停止录制，关闭泵，并通过打开泄压阀释放系统压力。</li>
	<li>视频文件分析 
	注意：若挤出明显不充分，则无需详细分析。但识别失败模式仍有助于优化样品。
	<ol>
		<li>使用分析软件（例如 Fiji49）打开视频文件，并校准测量工具。</li>
		<li>使用直线选择工具在视频图像中选择一段已知长度的线段。通过分析 | 设定比例尺打开设定比例尺窗口，输入已知距离和测量单位。 
		注意：喷嘴的已知直径可作为此类测量的合适校准长度。</li>
		<li>在视频中找到一个可见可追踪特征（例如晶体）的帧，并记录帧编号。</li>
		<li>将视频推进至同一特征可见但已从上一步位置移动的帧，并记录帧编号。</li>
		<li>使用直线测量工具，通过分析 | 测量测量该特征起点与终点之间的距离。 
		注意：可追踪距离越长，测量误差对计算结果的影响越小。</li>
		<li>根据测得的距离和经过的时间（经过的帧数除以帧率）计算射流速度。</li>
		<li>对视频的每一段重复步骤 2.11.3–2.11.6 数次。</li>
		<li>按图2所示绘制数据序列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

采用粘性挤出喷射器的TR-SFX方法已被证明是研究紫膜质9,10和光系统II13结构动力学的有效技术，目前似乎已具备研究驱动其他光生物学过程（如光驱动离子转运或感光感知）的蛋白质的能力5,50。上述方案旨在最大限度地提高紫膜质TR-SFX数据采集的成功率，但我们认为其也可作为优化其他样品数据采集的模板。通过这种方式，目前因堵塞或样品挤出不良而浪费的宝贵机时，将可被更有效地用于在更多时间延迟点采集更高质量的数据。
该实验方案中最困难且最关键的步骤是加入少量单油酸甘油酯，以使脂质基质进入立方相（步骤1.8）。难点在于相变过程十分微妙，且当单油酸甘油酯过量时会对样品产生不利影响。
应根据不同的蛋白质晶体对实验方法进行相应调整。这些晶体可能与相同的添加剂、...

X射线自由电子激光器（XFEL）的独特性质，利用数千个微米级晶体在室温下测定其结构，同时在辐射损伤发生之前完成数据采集，从而规避了大部分辐射损伤问题。 &#34;衍射先于破坏&#34; 原理1,2,3.
在SFX的时间分辨扩展技术（TR-SFX）中，利用XFEL的飞秒脉冲来研究蛋白质的结构变化4,5。在泵浦-探测实验装置中，目标蛋白质在被XFEL照射前，先通过光学激光（或其他活性触发方式）激活。通过精确控制泵浦脉冲与探测脉冲之间的延迟时间，可捕获目标蛋白质在不同状态下的构象。跨越十一个数量级时间尺度的结构变化分子电影，展示了新型XFEL光源在研究多种蛋白质动态过程中的强大能力6,7,8,9,10,11,12,13。该方法本质上将动态光谱学与静态结构技术结合为一体，实现了在接近原子分辨率下观察蛋白质动力学过程的可能。
时间分辨串行飞秒晶体学（TR-SFX）的简单系统可包含内源性激活触发元件，例如细菌视紫红质（bR）中的光敏组分视黄醛9,10、光系统II中的发色团12,13、光敏黄色蛋白（PYP）6,7、可逆光转换荧光蛋白11，或肌红蛋白中可光解的一氧化碳8。该技术仍在发展中的创新变体依赖于混合-注射方案14,15以研究酶促反应，或利用电场诱导结构变化16。鉴于X射线自由电子激光（XFEL）光源仅问世数年，若参照以往的成功经验进行推断，该方法在深化我们对蛋白质功能机制的理解方面，展现出真正的变革性潜力。
由于生物样品在受到一次高强度XFEL脉冲照射后即被破坏，因此需要开发新的蛋白质晶体学方法。在这些方法中，必须发展出能够大量生长均匀微晶的技术17,18,19。为了在XFEL上进行数据收集，这些晶体必须在每次XFEL脉冲照射后被输送、丢弃并更新。鉴于XFEL以10–120 Hz的频率发射可用脉冲，样品输送必须快速、稳定且可靠，同时保持晶体完整并尽量减少样品消耗。其中最成功的解决方案之一是高黏度微挤出喷射器，它可将含有晶体的脂质立方相（LCP）在室温下持续形成一股流动柱，穿过脉冲X射线束20。随机取向的晶体嵌于LCP流中，当被XFEL脉冲击中时，会将X射线散射到探测器上，记录下衍射图样。LCP作为样品输送介质是自然的选择，因为它常被用作膜蛋白晶体的生长介质17,21,22,23，但其他高黏度载体介质24,25,26,27,28,29,30以及可溶性蛋白质31也已在该喷射器中得到应用。利用高黏度喷射器进行的SFX已成功用于膜蛋白结构解析13,32，包括G蛋白偶联受体（GPCRs）33,34,35,36,37，所获数据质量足以进行直接相位解析38,39，同时在时间和样品利用效率方面表现优异。目前，这类喷射器正越来越多地被常规用于同步辐射光源下的室温测量28,30,40,41，以及在XFEL上进行的技术要求更高的时间分辨串行飞秒晶体学（TR-SFX）实验9,10,13,42。
已有使用其他类型喷射器（如流动聚焦喷嘴中的液相输送）进行的类似时间分辨串行飞秒晶体学（TR-SFX）实验报道6,7,12，但该方法所需的蛋白用量对于许多具有重要生物学意义的研究靶标而言难以获得。在利用高黏性挤出技术测定静态结构时，每获得10,000张索引衍射图谱平均消耗0.072 mg蛋白，而液态射流喷嘴则消耗9.35 mg（即样本利用效率高出约130倍）20。高黏性喷射器已被证明是TR-SFX实验中可行的样品输送装置，尽管在一定程度上牺牲了部分样品利用效率43。例如，在Nogly等（2018）的研究中10，每10,000张索引衍射图谱的样品消耗量约为1.5 mg，相较于使用PYP蛋白进行的类似TR-SFX实验（每10,000张索引图谱消耗74 mg蛋白）具有明显优势6。因此，当可用蛋白量受限或晶体直接在LCP中生长时，高黏性喷射器具有显著优势。
在使用高粘度注射器进行时间分辨串行飞秒晶体学（TR-SFX）实验时，为获得最可靠的数据，需解决若干技术问题：流速必须保持在某一最低临界值以上；命中率应维持在不至于使数据收集过程过慢的水平（例如高于5%）；且样品输送过程中不能出现过度扰动。理想情况下，这些条件应在计划进行TR-SFX实验之前就已满足，以尽可能高效地利用有限的X射线自由电子激光（XFEL）机时。原则上，液晶相（LCP）流的减速可能导致探测到被多个光学激光脉冲激活的晶体，从而产生混合的活性状态，或在预期探测未泵浦样品时却探测到了已被泵浦的样品。注射预测试的另一个优势是，可在XFEL上数据收集期间最大限度减少停机时间，因为用于更换堵塞喷嘴、替换无法挤出的样品以及其他维护操作的时间得以显著减少。
本文介绍了一种利用高黏度微挤出注射器优化时间分辨串行飞秒晶体学（TR-SFX）数据收集样品递送的方法。为简化操作，所描述的方法无需依赖X射线光源即可实施，尽管在同步辐射光束线上开展工作29可进一步获得有关预期命中率和晶体衍射情况的信息。我们开发该实验方案旨在优化捕获质子泵型细菌视紫红质10中视黄醛异构化过程的实验，整个流程分为两个阶段：首先制备用于挤出的晶体样品，随后利用高速摄像系统监测挤出过程。第一阶段中，将含有晶体的脂立方相（LCP）与额外的LCP、低相变温度脂质或其他添加剂混合，以确保最终混合物适合递送至样品环境，且不会发生堵塞或流速减慢。为此开发了一种新型三通注射器连接器，以提升混合效率和样品均一性。第二阶段则通过高速相机记录挤出测试视频，直接测量挤出速度的稳定性。根据视频数据分析结果，可对样品制备方案进行调整，以改善实验效果。这些方法可稍作修改后适用于其他蛋白质的TR-SFX数据收集，有助于高效利用有限的X射线自由电子激光（XFEL）机时。随着新的XFEL设施刚刚投入运行44,45，以及基于注射器的串行数据采集方法向同步辐射光源的转移28,30,40,41，未来几年必将持续为日益广泛的蛋白质靶标结构动力学研究提供激动人心的新见解。

<table><tbody><tr><td>蚊式 LCP 注射器耦合器</td><td>TTP labtech 商店</td><td>3072-01050</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器 1710 RNR，100 &amp;micro;l</td><td>Hamilton</td><td>HA-81065</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器 1750 RNR，500 &amp;micro;l</td><td>Hamilton</td><td>HA-81265</td><td></td></tr><tr><td>单油精</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>M-239</td><td></td></tr><tr><td>7.9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids 公司</td><td>850534O</td><td></td></tr><tr><td>50% w/v PEG 2000</td><td>分子维度公司（Molecular Dimensions）</td><td>MD2-250-7</td><td></td></tr><tr><td>石蜡（液态）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.07162</td><td></td></tr><tr><td>高速相机</td><td>Photron</td><td></td><td>Photron Mini AX</td></tr><tr><td>高倍放大镜头</td><td>Navitar</td><td></td><td>12X 变焦镜头系统</td></tr><tr><td>三轴位移台</td><td>ThorLabs</td><td>PT3/M</td><td></td></tr><tr><td>光纤光源</td><td>Thorlabs</td><td>OSL2</td><td></td></tr><tr><td>熔融石英光纤</td><td>Molex/Polymicro</td><td>TSP-505375</td><td></td></tr><tr><td>Lite touch 套管</td><td>IDEX</td><td>LT-100</td><td></td></tr><tr><td>ASU 高粘度注射器</td><td>亚利桑那州立大学（Arizona State University）</td><td></td><td>可向 Uwe Weierstall (weier@asu.edu) 购买</td></tr><tr><td>HPLC 泵</td><td>岛津（Shimadzu）</td><td>LC-20AD</td><td></td></tr><tr><td>电子气体调节器</td><td>Proportion Air</td><td>GP1</td><td></td></tr></tbody></table>

提高高粘度微晶挤出效率以用于x射线激光器上的时间分辨串行飞秒晶体学研究

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

高黏度微挤出注射器显著降低了在X射线自由电子激光器（XFELs）上进行的序列飞秒晶体学实验（SFX）中的样品消耗量。一系列利用光驱动质子泵细菌视紫红质开展的实验进一步确立了这些注射器作为时间分辨序列飞秒晶体学（TR-SFX）中输送晶体的首选方案，以解析蛋白质在光激活后发生的结构变化。为了获得多个高质量的结构快照，必须收集大量数据，并确保每次泵浦激光脉冲之间晶体被充分清除。本文详细描述了我们在美国直线加速器相干光源（LCLS）开展的近期TR-SFX实验中，如何优化细菌视紫红质微晶的挤出过程。该方法的目标是在维持晶体高密度的同时，实现稳定且连续的流动，从而提高TR-SFX实验中数据采集的速率。我们通过使用一种新型三通注射器连接装置制备晶体分布均匀的脂质立方相，再结合高速相机系统对挤出稳定性进行测量，进而调整样品组成，以此实现上述目标。该方法可推广适用于其他微晶流动条件的优化。该装置将向新的瑞士自由电子激光设施的用户开放使用。

本实验方案（图3）的理想起始材料是高密度微晶，需将其混悬于黏性载体介质中，用于注射器进样。每次样品制备约需50 µL含晶体的载体介质。这些微晶可直接在脂质立方相（LCP）中生长，例如本文所用的细菌视紫红质（bR）9,10（图4），也可采用传统气相扩散法培养的晶体进行制备。Ishchenko 等人（2016）37 提供了在密闭注射器中直接进行结晶的优秀视频指南。对于bR，晶体片层的理想直径约为20 μm，此尺寸在衍射能力与泵浦激光均匀激发之间达到良好平衡。采用上述方案制备的蛋白质晶体，用于在bR质子泵上采集时间分辨串行飞秒晶体学（TR-SFX）数据，揭示了光子吸收后发生的超快结构变化（图5）。
<p class="jove_c...

时间分辨序列飞秒晶体学实验的成功依赖于高效的样品递送。本文介绍了优化从高黏度微挤出注射器中挤出紫膜蛋白微晶的实验方案。该方法依赖于使用一种新型三通耦合器对样品进行均质化处理，并通过高速相机实现可视化观察。

提高高粘度微晶挤出效率以用于X射线激光器上的时间分辨串行飞秒晶体学研究

高粘度微挤出注射器已显著减少了在X射线自由电子激光串行飞秒晶体学实验（SFX）中的样品消耗量。

本方案旨在确保在时间分辨序列晶体学实验中经常遇到的问题不会影响数据质量。该方法的一个主要优势是其对不同晶体系统的适应性。高速相机挤出测试还可使我们直接测量挤出的稳定性。首先，在注射前约30分钟，将50微升基于结晶腺单油酸甘油酯（LCP）的溶液装入100微升注射器中。若需注入真空环境，则在第二个注射器尾部加入5微升MAG 7.9和5微升液体石蜡。将注射器垂直持握，排出注射器中的气泡。将装有 MAG 7.9 和石蜡的注射器连接至标准注射器接头。轻轻推动推杆，排出接头中的空气，直至接头针尖处可见少量混合物为止。将样品注射器连接到注射器接头，注意避免将空气引入样品中。通过将样品多次穿过连接器，混合脂质和石蜡。接下来，取20微升预混的LCP加入另一支100微升注射器中。将空注射器从连接器上取下，使用标准注射器连接器将预混的LCP注射器与含有晶体的注射器连接。然后，将样品通过耦合器处理100次。为使样品进入立方相，加入3 µL单油酸甘油酯并混合50次。重复此操作，直至形成透明相为止，以避免单油酸甘油酯过量。作为样品刚性和可挤出性的初步测试，将空注射器从注射器连接器上取下，垂直握住注射器，通过连接器挤出少量样品。如果挤出的样品能形成直立的圆柱体，则该样品已准备好进行挤出测试。通过添加更多预混的LCP，将样品总体积调整至100 µL。将样品注射器和两个空注射器连接至三通注射器连接头。通过将一半样品推入第二个注射器，然后同时将两份半量样品推入第三个注射器，重复此操作至少50次以充分混匀。将含有混合样品的注射器置于体视显微镜下，检查晶体是否分布均匀。清洗高效液相色谱泵及所有水相管路，以确保流速准确。然后，清洗进样器的液压装置。接下来，打开相机并将其连接至配套软件。在运行实时视频以提供视觉反馈的同时，将喷嘴尖端置于画面中央，并使用三轴载物台将其调至清晰对焦。将相机的帧率设置为每秒 1,000 帧，然后将分辨率设置为 512 × 512 像素。曝光时间现已由帧率设定，调节光照强度直至喷嘴可见。重新定位喷嘴尖端，使其在左右方向上居中，并位于画面的上三分之一处。将相机设置为延时拍摄模式。将间隔设置为30秒，重复次数设置为40次。将触发模式设置为随机，并输入要记录的帧数为1,000。现在，向储液池中加入 20 微升测试样品，并安装毛细管喷嘴。将装有样品的储液池连接到注射器上。然后，将气体管路连接至喷嘴的接口，并启动气体流动。随后，同时启动泵和相机记录。监测挤出过程，直至泵的压力在接近预期结束时间时急剧上升。然后，停止记录，关闭泵，并通过打开泄压阀释放系统压力。随后，使用分析软件打开视频文件，并校准测量工具。在视频中找到一个可在挤出物中清晰识别且可追踪的特征帧，记录该帧的帧号。接下来，将视频前进到一个相同的特征仍可见但已从上一步位置发生移动的帧，并记录该帧的编号。使用直线测量工具，通过“分析-测量”功能测量该特征起点与终点之间的距离。对视频的每个片段重复上述步骤数次。最后，绘制数据序列。本方案的理想起始材料是高密度的微晶，这些微晶需被包埋于用于注射器的黏性载体介质中。蛋白质晶体被用于在质子泵细菌视紫红质上收集时间分辨串行飞秒晶体学（TRSFX）数据，揭示了光子吸收后发生的超快变化。使用三通连接器进行样品制备后，通过肉眼观察注射器中的材料可确认样品的均一性。显微镜图像可进一步确认晶体的密度。当递送介质呈透明且黏稠时，样品处于立方相。浑浊的混合物可能表明样品处于海绵相或层状相，但并非确凿证据，因为高晶体密度可能会遮蔽LCP的透明度。可通过将注射器活塞远离样品拉动，进行低压测试以识别海绵相。在喷射测试过程中，样品应挤出一根细长且连续的LCP液柱，其移动速度近乎恒定。若样品以滴落模式流出，则表明其黏度过低。能够形成液柱的样品数据应显示，挤出速度保持在由实验参数决定的最低速度以上。在使用本方案进行优化后，可在专业设施上收集时间分辨的序列晶体学数据。这将揭示蛋白质在执行其功能时发生的整体构象变化。

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改进 x 射线激光时分辨序列飞秒晶体学微晶的高粘度挤出

我们描述了用于在X射线自由电子激光器和同步辐射光源上进行序列晶体学实验的脂质立方相中膜蛋白微晶的制备与递送方法。这些方案也可应用于可溶性蛋白微晶的包埋与递送，与液体注射相比，可显著减少样品消耗。...

用于序列飞秒晶体学的脂质立方相中蛋白质微晶的制备与递送

介绍了一种利用蛋白质微晶进行X射线晶体学的实验方案。两个分析实例 体内纯化后生长的微晶 在细胞内...

蛋白质晶体的微晶衍射分析 活细胞内 衍射

我们描述了一项旨在研究高强度飞秒X射线脉冲在巴克敏斯特富勒烯（C60）纳米晶体中诱导产生的电子损伤的实验。实验发现，出乎意料的是，C60...

在富勒烯纳米晶体飞秒衍射实验中测量长程电子关联

本方案详细描述了在室温下用于X射线衍射数据收集的微流控器件的制备与操作方法。此外，还介绍了如何通过动态光散射监测蛋白质结晶过程，以及如何处理和分析所获得的衍射数据。...

微流控芯片用于 原位 晶体X射线衍射与 原位 用于序列晶体学的动态光散射

本实验方案的目的是演示如何制备用于在澳大利亚同步加速器新近投入使用的高粘性喷射器Lipidico上进行数据采集的序列晶体学样品。...

澳大利亚同步辐射光源上用于序列晶体学测量的脂质注射方案

本文详细介绍了用于芯片上透析法蛋白质结晶的微流控芯片的制备方案 原位...

通过微透析芯片法进行蛋白质结晶 原位 X射线衍射研究

本文的目的是使读者充分理解如何将小体积蒸气扩散法用于生长大尺寸单晶蛋白晶体的实验方案，转变为适用于序列晶体学的大体积批量微晶结晶方法。...

优化内切肽酶晶体生长以用于序列晶体学实验

本文介绍了在Diamond光源I24线站进行序列同步辐射晶体学实验的固定靶样品制备、数据收集和数据处理的综合指南。...

在钻石光源进行固定靶连续数据采集

数据的信噪比是进行微晶X射线衍射测量时最重要的考虑因素之一。VMXm光束线为此类实验提供了低噪声环境和微束条件。本文介绍了适用于VMXm及其他微聚焦大分子晶体学光束线的微晶样品制备、安装与冷却方法。...

用于VMXm光束线微晶样品制备的工作流程

本文介绍了如何在晶上晶装置上设置蛋白质结晶，以及如何利用芯片结晶平台在室温下进行自动化的序列数据收集。...

片上结晶与室温大规模连续衍射

本方案介绍了一种利用96孔高通量透析板筛选蛋白质结晶条件及晶体生长的简便方法。同时展示了使用透析管进行微晶大规模生长，适用于序列晶体学和微晶电子衍射（MicroED）应用。...

高通量蛋白质结晶的微透析方法 via Microdialysis

了解时间分辨序列飞秒晶体学中高粘度微晶挤出技术的优化方法。本方案使用三路耦合器进行样品均质化，并通过高速相机测试直接测量挤出稳定性，确保获得高质量的结构生物学数据。

提高高粘度微晶挤出效率以用于X射线激光器上的时间分辨串行飞秒晶体学研究

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