Name: 墨西哥鱼基因功能的操纵 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学习在墨西哥洞穴鱼Astyanax mexicanus中进行基因功能操纵的方法，包括Tol2转座子介导的转基因技术、CRISPR/Cas9基因组编辑和吗啉代寡核苷酸基因敲低技术，以研究表面鱼与洞穴鱼之间的表型变异遗传基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 Sunishka Thakur 在基因分型以及对图2中所示的oca2突变型鱼进行成像方面提供的帮助。本研究由美国国家科学基金会（NSF）资助，项目编号1656574（授予 A.C.K.），NSF 项目编号1754321（授予 J.K. 和 A.C.K.），以及美国国立卫生研究院（NIH）项目编号 R21NS105071（授予 A.C.K. 和 E.R.D.）。

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供了一种利用吗啉环寡核苷酸（morpholinos）、CRISPR/Cas9 基因编辑和转基因技术来调控基因功能的方法。A. mexicanus 中遗传技术的不断丰富以及这些系统在斑马鱼中的优化，有望使这些工具轻松应用于该物种52。尽管已有研究在 A. mexicanus 中采用了这些方法，但其在该体系多种形态学、发育及行为性状研究中的应用仍显不足30,36,42,53。&#160;
吗啉寡核苷酸（Morpholinos）已广泛应用于斑马鱼研究中以敲低基因表达。该方法操作简便，且能有效实现基因表达的显著下调。然而，已有大量文献报道其存在脱靶效应22,<sup class=...

自达尔文以来 物种起源1，科学家通过洞穴生物获得了关于性状如何在特定环境和生态压力下发生进化性改变的深刻见解2墨西哥 tetra， A. mexicanus，包括分布在墨西哥各地及美国南部德克萨斯州河流中的有眼祖先型“表层”种群，以及至少29个地理上相互隔离的衍生洞穴形态种群，后者栖息于阿布拉山脉及墨西哥东北部其他地区3已鉴定出多种与洞穴相关的性状 A. mexicanus包括耗氧量改变、脱色、眼睛退化以及摄食和觅食行为的改变4,5,6,7,8,9. A. mexicanus 由于具有明确的进化历史、对生态环境的详细表征以及独立进化的洞穴种群，该模型为研究趋同进化机制提供了一个强有力的体系10,11许多在洞穴鱼中存在的洞穴衍生性状，包括眼睛退化、睡眠减少、摄食增加、群游行为丧失、攻击性降低以及应激反应减弱，已通过独立起源多次演化形成，且不同洞穴种群间常利用不同的遗传通路实现这些性状的演化。8,12,13,14,15这一重复演化是其重要特征 A. mexicanus 系统，并有助于深入理解更普遍的问题，即如何通过扰动遗传系统以产生相似的表型。&#160;
尽管遗传技术在多种鱼类物种（包括 A. mexicanus），斑马鱼领域的最新进展为鱼类遗传技术的开发奠定了基础16,17,18,19,20. 斑马鱼中广泛使用多种工具来操控基因表达，这些操作流程早已实现标准化。例如，在单细胞阶段注射吗啉代寡核苷酸（MOs）可选择性阻断RNA并抑制翻译，从而在发育的短暂时间窗口内实现基因功能的敲低21,22此外，基因编辑技术（如成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN））能够通过基因组中的重组实现特定的缺失，或在某些情况下实现插入。19,20,23,24转基因技术用于以细胞类型特异性的方式操控基因的稳定表达或功能。 Tol2 系统通过共注射转座酶mRNA与转座子载体，可高效用于转基因动物的制备 Tol2 含有转基因的DNA质粒25,26。该 Tol2 系统利用了 Tol2 转座酶用于青鳉以产生转基因构建体的稳定生殖系插入。生成 Tol2 转基因技术涉及共注射一种质粒，该质粒包含两侧带有侧翼序列的外源基因 Tol2 整合位点和 mRNA Tol2 转座酶17该系统已被用于在斑马鱼中产生一系列转基因品系，近年来其应用已扩展到其他新兴的模式生物系统，包括慈鲷、鳉鱼、刺鱼，以及最近的墨西哥洞穴鱼。27,28,29,30.&#160;
尽管洞穴鱼是阐明性状进化机制的一个引人入胜的生物系统，但其作为进化模型的全部潜力尚未得到充分开发。部分原因在于难以直接操控其遗传和细胞功能31。虽然已通过数量性状位点（QTL）研究鉴定出调控复杂性状的候选基因，但这些候选基因的验证仍存在困难32,33,34。近年来，已采用吗啉代寡核苷酸进行瞬时敲低、利用CRISPR和TALEN系统进行基因编辑，以及通过Tol2介导的转基因技术，来研究多种性状背后的遗传基础35,36,37,38。这些技术的实施与标准化将有助于深入探究生物性状的分子与神经机制，包括基因功能的操控、特定细胞群体的标记以及功能性报告基因的表达。尽管这些遗传工具在新兴模式系统中已成功用于操控基因或细胞功能，但在A. mexicanus中仍缺乏详细的实验方案。&#160;
A. mexicanus 为研究生物在环境变化下的进化机制提供了重要见解，并为鉴定调控多种性状的新基因创造了机会。多种因素表明，A. mexicanus 是一个极为适用的模型，可用于应用目前在成熟遗传模型中已建立的基因组工具，这些优势包括易于在实验室中饲养、产卵量大、胚胎透明、基因组已测序以及具备明确的行为学检测方法39。本文描述了在A. mexicanus 的表型鱼和洞穴鱼种群中使用吗啉环寡核苷酸（morpholinos）、转基因技术和基因编辑技术的方法。这些工具在A. mexicanus 中的广泛应用，将有助于从机制层面深入探究洞穴鱼与表型鱼在发育、生理和行为差异背后的分子过程。&#160;

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;鱼类繁殖 &amp;和卵供应&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细孔鱼网</td><td>Penn Plax</td><td>BN4</td><td></td></tr><tr><td>鱼缸加热器</td><td>Aqueon</td><td>100106108</td><td></td></tr><tr><td>卵捕获装置</td><td>定制制作</td><td>NA</td><td>设计并制作塑料格栅，放置于水箱底部以保护鱼卵</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>移液管吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>卵模具</td><td>适应性科学工具</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;吗啉寡核苷酸供应&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>对照吗啉代寡核苷酸</td><td>Gene Tools, LLC</td><td>标准对照油</td><td></td></tr><tr><td>定制吗啉代寡核苷酸</td><td>Gene Tools, LLC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;CRISPR试剂&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cas9 质粒</td><td>AddGene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>KOD Hot Start Taq</td><td>EMD Millipore</td><td>71-842-3</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>T7 Megascript 试剂盒</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T3 试剂盒</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>MinElute 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Tol2 转基因技术&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-zT2TP 质粒</td><td>Kawakami 等，2004</td><td>资深作者请求</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>B7204</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF 限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189</td><td></td></tr><tr><td>PCR纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SP6 mMessenger 试剂盒</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;显微注射试剂与器材&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射仪</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>世界精密仪器公司</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪支架</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪基座</td><td>世界精密仪器公司</td><td>钢制底板，10磅</td><td></td></tr></tbody></table>

墨西哥洞穴鱼基因功能的操作

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

洞穴动物为研究多种复杂性状（包括眼睛退化、白化病、睡眠减少、多食行为以及感觉处理）的进化机制和遗传基础提供了极具吸引力的研究体系。来自世界各地的洞穴鱼类物种由于不同洞穴系统之间相似的环境压力，表现出形态和行为性状的趋同进化。目前已有多种洞穴物种在实验室条件下被研究。其中，墨西哥盲鳉（Astyanax mexicanus）具有视觉正常和盲眼两种形态，为揭示复杂性状进化的生物学与分子机制提供了独特视角，并正迅速发展成为一个新兴的模式系统。尽管已在 A. mexicanus 中鉴定出调控多种生物学过程进化的候选基因，但验证单个基因功能的能力仍受到限制。转基因技术和基因编辑技术的应用有望克服这一重大障碍，并深入探究复杂性状进化的潜在机制。本文介绍了一种在 A. mexicanus 中操控基因表达的不同方法。该方法包括使用吗啉代寡核苷酸（morpholinos）、Tol2 转基因技术以及基因编辑系统——这些技术在斑马鱼及其他鱼类模型中已被广泛应用，可用于调控 A. mexicanus 中的基因功能。这些实验方案包含对定时繁殖程序、受精卵收集、显微注射以及遗传修饰个体筛选的详细描述。这些方法学手段将有助于深入研究 A. mexicanus 中复杂性状进化的遗传与神经机制。&#160;

多个洞穴栖居的 A. mexicanus 种群表现出相较于其地表栖居同种个体的睡眠减少以及觉醒/活动增加14。下丘脑分泌素/食欲素（Hypocretin/orexin, HCRT）是一种高度保守的神经肽，其功能是促进觉醒，HCRT 通路的异常可导致人类及其他哺乳动物发生嗜睡症47,48。我们先前已证实，洞穴型 A. mexicanus 中 HCRT 肽的表达量升高，提示该肽表达的增加可能是洞穴鱼睡眠减少的基础38。hcrt 表达的吗啉寡核苷酸（MO）敲降为直接检验 hcrt 表达升高在介导洞穴鱼睡眠减少中的作用提供了一种有力的方法。
为了研究 hcrt 表达与睡眠之间的关系，我们设计了一种翻译阻断型吗啉代寡核苷酸（morpholino）。该吗啉代寡核苷酸（MO）靶向第一外显子的前25...

我们介绍了在进化模型系统 Astyanax mexicanus 中进行基因操作的方法。文中描述了三种不同的技术：基于Tol2的转基因技术、利用CRISPR/Cas9对基因组进行靶向编辑，以及使用吗啉寡核苷酸（morpholinos）进行基因表达敲低。这些工具将有助于直接研究控制表型鱼类与洞穴栖息鱼类之间差异的基因基础。

洞穴动物为研究多种复杂性状变化背后的进化机制和遗传基础提供了极具说服力的研究体系，……

洞穴动物为研究多种形态学、发育学和行为学特征提供了极具吸引力的研究体系。然而，建立这一模式系统的一个限制因素是缺乏能够操控基因功能的遗传学工具。本文中，我们展示了三种不同的方法，用于在墨西哥洞穴鱼（Astyanax mexicanus）中操控基因功能。这些工具将有助于研究表层鱼与洞穴鱼之间自然变异的基因基础，以及这些基因如何与表型相关联。我实验室中一位出色的博士后 Bethany Stahl 将演示该实验步骤。在开始操作前，先用温热的、溶解于养鱼系统水中的 3% 琼脂糖填充一个 100 毫升的培养皿，然后以 45 度角小心地将一枚卵注射模具插入琼脂糖中，在缓慢下压模具时需避免在模具下方困住空气。当琼脂糖凝固后，小心移除模具，然后将培养板在4°C下保存，最长可保存一周。随后，根据制造商的说明，使用电极拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制针头。在注射当天，用玻璃移液器将单细胞卵转移到注射板中，每行放置30至40枚卵，最多填充注射板的五行。用少量鱼系统水保持卵的湿润。将吗啉代（Morpholino）在冰上解冻，并配制注射液，使每枚卵注射400皮克吗啉代，可使用长型Microloader移液器吸头，或在末端加入2至4微升的溶液。当所有针头装载完毕后，用镊子剪去注射针尖端多余的长度，并将第一根针安装到连接皮升微量注射器的显微操作仪上。然后，将注射皿置于解剖显微镜下，使用显微操作仪用注射针刺入每个卵细胞，并将一纳升的吗啉代寡核苷酸注射液直接注入卵黄中。对于CRISPR注射，将25皮克的向导RNA与300皮克的CRISPR相关蛋白9信使RNA混合，将所得RNA溶液两纳升注入每个胚胎，操作如所示。对于Tol2转座酶及两侧带有Tol2序列的质粒注射，将每微升25纳克的Tol2信使RNA与每微升25纳克的Tol2质粒构建体及酚红溶于无RNase的水中。然后，按照刚刚演示的方法，向每个胚胎注射一纳升溶液。在注射后第四天筛选注射了吗啉环寡核苷酸（Morpholino）的动物时，根据目标基因的不同，可在体视显微镜下观察鱼胚幼虫的表型，或进行录像以分析其行为。若需筛选CRISPR插入缺失突变（indels），则将注射了CRISPR的胚胎转移至PCR管中，并按照标准的聚合酶链式反应（PCR）DNA提取流程提取DNA，用于后续PCR分析。为评估诱变效果，取5 µL PCR产物在3%琼脂糖凝胶中以70伏电压电泳运行3小时。野生型未诱变DNA将呈现清晰条带，而突变DNA则呈现弥散条带。与注射随机序列Morpholino的表型鱼相比，注射对照Morpholino的墨西哥洞穴鱼（Cave A mexicanus）在24小时内表现出显著增强的运动活性及减少的睡眠时间。与对照组注射的表层鱼相比，注射促食欲素（hypocretin orexin）Morpholino 对表层鱼的睡眠影响甚微。相反，通过注射 Morpholino 敲低促食欲素（hypocretin orexin）在洞穴鱼类中对睡眠具有显著影响，从而建立了促食欲素（hypocretin orexin）表达与睡眠减少之间的直接关联。在表层鱼中通过 CRISPR 介导的突变对白化病基因 OCA2 进行诱变，部分个体携带野生型 OCA2 阳性等位基因的纯合子，并表现出色素沉积；而携带两份 CRISPR 突变的 OCA2 阴性等位基因的个体则表现为白化，这揭示了突变型 OCA2 基因与洞穴鱼白化现象之间的直接联系。选择对 Tol2 转座子传递的转基因呈阳性的 F0 代个体，与野生型进行回交，以建立稳定的 F1 代品系。这将实现活体钙成像，用于揭示神经元活动的差异，阐明洞穴环境中行为变化的神经机制，并为在 A. mexicanus 中表达更多转基因以鉴定和操控基因功能奠定基础。需要牢记的关键要点是：将卵紧密地加载到培养板上，正确修剪显微注射针，以及优化显微注射条件。在成功实现基因敲低、转基因整合或CRISPR介导的基因编辑后，这些鱼类可用于发育、行为及脑活动分析。

manipulation-of-gene-function-in-mexican-cavefish

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

墨西哥鱼基因功能的操纵

本视频介绍了一种利用翻译阻断型吗啉环寡核苷酸在洞穴鱼单细胞期进行显微注射以实现基因敲低的技术。吗啉环寡核苷酸是一类可与靶mRNA互补序列结合并阻断其翻译为蛋白质的DNA寡核苷酸。因此，吗啉环寡核苷酸被用作分子工具，以暂时性地抑制或降低基因的表达水平。...

吗啉代介导的基因编辑：利用翻译阻断型吗啉代寡核苷酸在单细胞洞穴鱼卵中进行基因敲低的技术

关键词：吗啉代寡核苷酸，基因敲低，翻译阻断，洞穴鱼，单细胞胚胎，基因功能研究，发育生物学

本文介绍了一种利用反义吗啉环寡核苷酸在成年斑马鱼端脑室管膜细胞中调控基因表达的方法。我们提出该方法是一种高效且快速的实验方案，可用于成年脊椎动物脑部的功能研究。...

利用吗啉代寡核苷酸脑室微量注射技术对成年斑马鱼大脑进行基因表达的微操作

我们在此报告了在将mRNA注射到未受精卵母细胞后，荧光蛋白的稳定且高效的表达 Branchiostoma lanceolatum该微型注射技术在这一基础脊索动物中的建立，将为这一新兴模式系统带来深远的技术革新，包括 体内...

通过向未受精卵母细胞注射 mRNA 在文昌鱼（Branchiostoma lanceolatum）中表达荧光蛋白

转基因操作和基因组编辑对于功能验证基因和cis-调控元件的作用至关重要。本文针对新兴的模式鱼类——三刺棘背鱼，详细介绍了用于产生基因组修饰（包括Tol2介导的荧光报告转基因构建体、TALENs和CRISPRs）的显微注射方案。...

三刺鱼转基因与基因组编辑的显微注射技术

利用基因组编辑技术，现在可以在多种生物体中实现基因靶向诱变。本文以Astyanax...

使用转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）对墨西哥盲鱼（Astyanax mexicanus）进行基因组编辑

在本实验方案中，我们演示了如何繁殖墨西哥盲鱼（Astyanax...

培育墨西哥盲鱼 Astyanax mexicanus 以分析仔鱼后表型及进行整体免疫组织化学

本文介绍了对一系列墨西哥洞穴鱼行为进行高通量研究以及对机械感觉系统进行活体染色的方法。这些方法采用免费软件和自制脚本，为行为学研究提供了实用且经济高效的技术方案。...

墨西哥洞穴鱼的行为追踪与神经丘成像

Astyanax 胚胎的整体原位杂交

本实验方案详细介绍了量化墨西哥洞穴鱼运动行为和睡眠的方法。该方法在以往分析的基础上进行了扩展，可用于测量群居条件下饲养的鱼类的这些行为。该系统可广泛应用于其他鱼类物种的睡眠和活动研究。...

墨西哥洞穴鱼睡眠与运动活动的自动化测量

体外受精是一种常用的技术，可用于多种模式生物，以维持实验室种群并为下游应用提供同步发育的胚胎。本文介绍了一种针对墨西哥盲鱼（Astyanax...

Astyanax mexicanus 配子采集与体外受精

本文概述了用于诱导墨西哥盲鱼Astyanax...

Astyanax mexicanus 繁殖和产卵最适条件下的渐进式温度变化

学习在墨西哥洞穴鱼Astyanax mexicanus中进行基因功能操纵的方法，包括Tol2转座子介导的转基因技术、CRISPR/Cas9基因组编辑和吗啉代寡核苷酸基因敲低技术，以研究表面鱼与洞穴鱼之间的表型变异遗传基础。

墨西哥洞穴鱼基因功能的操作

探索更多视频