墨西哥洞穴鱼基因功能的操作

洞穴动物为研究多种形态学、发育学和行为学特征提供了极具吸引力的研究体系。然而，建立这一模式系统的一个限制因素是缺乏能够操控基因功能的遗传学工具。本文中，我们展示了三种不同的方法，用于在墨西哥洞穴鱼（Astyanax mexicanus）中操控基因功能。

这些工具将有助于研究表层鱼与洞穴鱼之间自然变异的基因基础，以及这些基因如何与表型相关联。我实验室中一位出色的博士后 Bethany Stahl 将演示该实验步骤。在开始操作前，先用温热的、溶解于养鱼系统水中的 3% 琼脂糖填充一个 100 毫升的培养皿，然后以 45 度角小心地将一枚卵注射模具插入琼脂糖中，在缓慢下压模具时需避免在模具下方困住空气。

当琼脂糖凝固后，小心移除模具，然后将培养板在4°C下保存，最长可保存一周。随后，根据制造商的说明，使用电极拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制针头。在注射当天，用玻璃移液器将单细胞卵转移到注射板中，每行放置30至40枚卵，最多填充注射板的五行。

用少量鱼系统水保持卵的湿润。将吗啉代（Morpholino）在冰上解冻，并配制注射液，使每枚卵注射400皮克吗啉代，可使用长型Microloader移液器吸头，或在末端加入2至4微升的溶液。当所有针头装载完毕后，用镊子剪去注射针尖端多余的长度，并将第一根针安装到连接皮升微量注射器的显微操作仪上。

然后，将注射皿置于解剖显微镜下，使用显微操作仪用注射针刺入每个卵细胞，并将一纳升的吗啉代寡核苷酸注射液直接注入卵黄中。对于CRISPR注射，将25皮克的向导RNA与300皮克的CRISPR相关蛋白9信使RNA混合，将所得RNA溶液两纳升注入每个胚胎，操作如所示。对于Tol2转座酶及两侧带有Tol2序列的质粒注射，将每微升25纳克的Tol2信使RNA与每微升25纳克的Tol2质粒构建体及酚红溶于无RNase的水中。

然后，按照刚刚演示的方法，向每个胚胎注射一纳升溶液。在注射后第四天筛选注射了吗啉环寡核苷酸（Morpholino）的动物时，根据目标基因的不同，可在体视显微镜下观察鱼胚幼虫的表型，或进行录像以分析其行为。若需筛选CRISPR插入缺失突变（indels），则将注射了CRISPR的胚胎转移至PCR管中，并按照标准的聚合酶链式反应（PCR）DNA提取流程提取DNA，用于后续PCR分析。

为评估诱变效果，取5 µL PCR产物在3%琼脂糖凝胶中以70伏电压电泳运行3小时。野生型未诱变DNA将呈现清晰条带，而突变DNA则呈现弥散条带。与注射随机序列Morpholino的表型鱼相比，注射对照Morpholino的墨西哥洞穴鱼（Cave A mexicanus）在24小时内表现出显著增强的运动活性及减少的睡眠时间。

与对照组注射的表层鱼相比，注射促食欲素（hypocretin orexin）Morpholino 对表层鱼的睡眠影响甚微。相反，通过注射 Morpholino 敲低促食欲素（hypocretin orexin）在洞穴鱼类中对睡眠具有显著影响，从而建立了促食欲素（hypocretin orexin）表达与睡眠减少之间的直接关联。在表层鱼中通过 CRISPR 介导的突变对白化病基因 OCA2 进行诱变，部分个体携带野生型 OCA2 阳性等位基因的纯合子，并表现出色素沉积；而携带两份 CRISPR 突变的 OCA2 阴性等位基因的个体则表现为白化，这揭示了突变型 OCA2 基因与洞穴鱼白化现象之间的直接联系。

选择对 Tol2 转座子传递的转基因呈阳性的 F0 代个体，与野生型进行回交，以建立稳定的 F1 代品系。这将实现活体钙成像，用于揭示神经元活动的差异，阐明洞穴环境中行为变化的神经机制，并为在 A. mexicanus 中表达更多转基因以鉴定和操控基因功能奠定基础。需要牢记的关键要点是：将卵紧密地加载到培养板上，正确修剪显微注射针，以及优化显微注射条件。

在成功实现基因敲低、转基因整合或CRISPR介导的基因编辑后，这些鱼类可用于发育、行为及脑活动分析。