Name: 微链 rna 的共聚焦成像和模式识别受体在负感 rna 病毒感染中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学习利用共聚焦显微镜技术对负链RNA病毒产生的双链RNA及模式识别受体进行单细胞水平成像，揭示病毒与宿主先天免疫反应的相互作用机制。该方法有助于深入理解病毒免疫逃逸并为抗病毒治疗提供新思路。

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我们感谢德克萨斯大学医学分部成像核心设施以及 Maxim Ivannikov 在显微镜使用方面的协助。
本工作获得了公共卫生服务基金授予 SP 的 RO1AI093445 和 RO1AI129198 项目资助、UTMB 承诺基金 P84373（授予 CH）以及授予 EM 的 T32 AI007526 项目的支持。

1. A549 细胞的准备与 JUNV 感染
<ol>
	<li>在感染前24小时，将2 × 105个人类肺上皮A549细胞接种于12孔板中经多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的玻璃盖玻片上。</li>
	<li>准备150 μL JUNV13病毒液，感染复数（MOI）为每细胞1.0个蚀斑形成单位，用添加了2%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）稀释。</li>
	<li>移除细胞培养液，向每孔含盖玻片的细胞中加入病毒接种物，在37 °C孵育1.5小时，每15分钟摇动一次培养板。</li>
	<li>移除病毒接种物，加入1 mL添加了5% FBS和1% P/S的DMEM培养基，在37 °C孵育至预定时间点。</li>
</ol>
2. 固定与免疫染色
<ol>
	<li>吸弃培养基。通过向每孔加入 1 mL 含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞。</li>
	<li>移除 PBS。向每孔加入 1 mL 预冷至 -20 °C 的甲醇（MeOH），在 -20 °C 或干冰上孵育 15 分钟。</li>
	<li>移除甲醇（MeOH）。</li>
	<li>向每孔加入 1 mL PBS，在 4 °C 下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复洗涤，共洗涤 4 次。</li>
	<li>在 1 mL 0.2% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇中，于 4 °C 轻轻振荡洗涤盖玻片上的固定细胞 5 分钟。</li>
	<li>向每孔加入 1 mL PBS，在 4 °C 下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复洗涤步骤，共洗涤 4 次。</li>
	<li>为检测 dsRNA 和 MDA5，将样品在 200 μL 含 3% 牛血清白蛋白（BSA）的稀释液中与一抗孵育。抗-dsRNA 9D5 抗体按 1:2 稀释，抗-MDA-5 抗体按 1:250 稀释。4 °C 轻轻振荡过夜孵育。</li>
	<li>移除一抗，每孔用 1 mL PBS 在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤 4 次。</li>
	<li>加入 200 μL 用 3% BSA 稀释的二抗（1:2,000 稀释），室温孵育 1 小时。</li>
	<li>移除二抗，每孔用 1 mL PBS 在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤 4 次。</li>
	<li>为检测 JUNV 核蛋白（NP）和 RIG-I，加入 200 μL 用 3% BSA 稀释的偶联抗体。偶联抗-JUNV NP（AG-12）抗体按 1:1,000 稀释，室温轻轻振荡孵育 2 小时；偶联抗-RIG-I 抗体按 1:500 稀释，4 °C 轻轻振荡过夜孵育。</li>
	<li>移除偶联抗体，每孔用 1 mL PBS 在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤 4 次。</li>
	<li>用 DAPI（1:1,000）在室温下轻轻振荡复染盖玻片 3 分钟。</li>
	<li>在 1 mL 0.5% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇中，室温轻轻振荡洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在 1 mL PBS 中洗涤 2 次，每次 5 分钟，室温轻轻振荡。</li>
	<li>在 1 mL ddH2O 中室温轻轻振荡洗涤 1 次，持续 1 分钟。</li>
	<li>使用封片剂将盖玻片封固于载玻片上，室温避光固化过夜。</li>
	<li>用指甲油封片，室温晾干 1 小时。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜，配备 60x/1.42 数值孔径油镜，对所有样品采用相同的激光发射参数进行成像。</li>
	<li>分析数据时，如有必要，对所有样品使用相同的线性调整方式调节亮度和对比度。</li>
</ol>

<ol><li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+RNA+viruses%3A+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li>
<li>Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 6(2006).</li>
<li>Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+direct+interaction+of+MDA5+and+the+dsRNA+replicative+intermediate+form+of+positive+strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses.</a> Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).</li>
<li>Onomoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+an+antiviral+stress+granule+containing+RIG-I+and+PKR+in+viral+detection+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity.</a> PLoS One. 7, e43031(2012).</li>
<li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+is+detected+by+immunofluorescence+analysis+in+RNA+and+DNA+virus+infections%2C+including+those+by+negative-sense+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li>
<li>Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+double-stranded+RNA+colocalizing+with+pattern+recognition+receptors+in+arenavirus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells.</a> Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251(2018).</li>
<li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).</li>
<li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+interferon+in+Argentine+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever.</a> The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).</li>
<li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+endogenous+interferon+and+the+clinical+evolution+of+patients+with+Argentine+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever.</a> Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+pathogenic+new+world+and+old+world+human+arenaviruses+induce+distinct+interferon+response+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells.</a> Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junin+virus+infection+activates+the+type+I+interferon+pathway+in+a+RIG-I-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659(2012).</li>
<li>Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+pathogenic+new+world+arenavirus+infection+activates+the+pattern+recognition+receptor+protein+kinase+R+without+attenuating+virus+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells.</a> Journal of Virology. 91, 20(2017).</li>
<li>Emonet, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+from+cloned+cDNAs+and+in+vivo+characterization+of+recombinant+pathogenic+Romero+and+live-attenuated+Candid%231+strains+of+Junin+virus%2C+the+causative+agent+of+Argentine+hemorrhagic+fever+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease.</a> Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).</li>
<li>Child, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+the+protein+kinase+R+pathway+in+human+cells+by+Rhesus+Cytomegalovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus.</a> Journal of Virology. 92, 6(2018).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对于正义链RNA病毒和双链DNA病毒，可使用广泛使用的J2抗双链RNA抗体轻松检测到双链RNA。然而，据认为，使用相同抗体检测负义链RNA病毒产生的双链RNA时，其水平较低或低于检测限2。因此，负义链RNA病毒中病毒RNA与模式识别受体（PRR）相互作用的许多方面仍不明确。我们曾尝试使用J2抗体对沙粒病毒感染中的双链RNA进行染色，但其荧光信号与模拟感染相比无明显差异。单克隆抗体9D5最初用于泛肠道病毒检测，后被发现对双链RNA具有特异性且比J2抗体更敏感5。该抗体已成功用于检测负义链RNA病毒感染过程中产生的病毒双链RNA，包括原型沙粒病毒淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus）5,6,14。因此，我们采用单克隆抗体9D5对双链RNA、病毒核蛋白（NP）以及模式识别受体（PRRs）进行共染色，以进一...

先天免疫反应诱导的初始步骤是宿主通过模式识别受体（PRR）识别双链（ds）RNA，例如视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLR）RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA-5）1。对于正链RNA病毒，通常可使用J2或K1抗双链RNA单克隆抗体（Mab） readily检测到双链RNA2。利用共聚焦显微镜已对小RNA病毒等正链RNA病毒中双链RNA与PRR之间的相互作用进行了表征3。然而，对于负链RNA病毒，由于缺乏高灵敏度的双链RNA抗体，PRR与双链RNA相互作用的可视化和表征一直受到限制。RNA荧光原位杂交（FISH）技术已被用于病毒RNA和PRR的可视化研究4。然而，FISH方法需要已知靶RNA序列，且可能无法与PRR共染色兼容。最近发现，最初用于泛肠道病毒感染诊断的9D5单克隆抗体（Mab）比J2 Mab更敏感，能够 readily检测负链RNA病毒感染中的双链RNA5,6。因此，9D5 Mab是一种研究负链RNA病毒复制及其PRR与病毒RNA相互作用的新型且有用的工具。
沙粒病毒是一类单链负义RNA病毒，包含多种可导致人类严重出血热疾病的病原体，例如拉沙病毒（LASV）、胡宁病毒（JUNV）和马秋波病毒（MACV）7。来自由新大陆沙粒病毒JUNV引起阿根廷出血热重症及致死病例的临床数据显示，患者血清中干扰素-α（IFN-α）水平异常升高8,9。我们已证实，致病性新大陆沙粒病毒（JUNV和MACV）能够在人单核细胞来源的树突状细胞中诱导I型干扰素（IFN）反应，而致病性旧大陆沙粒病毒LASV则不能10。此外，RIG-I是介导JUNV感染细胞产生I型干扰素反应的传感器之一11。我们还发现，蛋白激酶R（PKR）受体——传统上以其识别双链RNA（dsRNA）的功能而著称——在致病性新大陆沙粒病毒感染中被激活12。为了进一步理解沙粒病毒感染过程中病毒特异性干扰素反应的机制，我们旨在建立一种可视化病毒dsRNA与胞质模式识别受体（PRR）相互作用的实验方案。
致病性JUNV、MACV和LASV的感染实验必须在生物安全四级（BSL-4）设施中进行。因此，除了沙粒病毒感染过程中可能产生的双链RNA（dsRNA）水平较低之外，满足生物安全要求是在BSL-2实验室中对这些高致病性病毒开展成像研究的另一项技术挑战。本报告描述了一种基于共聚焦显微镜的实验方案，该方案利用9D5抗体和JUNV的Candid1#疫苗株，已成功用于在BSL-2实验室中可视化沙粒病毒感染细胞内的dsRNA、病毒蛋白和模式识别受体（PRR）。该方案同样适用于在BSL-4设施中研究致病性沙粒病毒感染期间dsRNA与PRR的细胞内分布情况。

<table><tbody><tr><td>APEX Alexa Fluor 647 抗体标记试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A10475</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td>1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>驴抗兔 Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td><td>1:2,000 稀释；批号 #: 1454437</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium）</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Bio</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠 Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td>1:2000 稀释；批号 #: 1874804</td></tr><tr><td>人肺上皮 A549 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗体抗 JUNV NP</td><td>BEI</td><td>NA05-AG12</td><td>与 Alexa-647 偶联，使用 1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗体 pan-Enterovirus 9D5 试剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>3361</td><td>即用型；稀释至 1:2；批号 #: 3067445</td></tr><tr><td>含 Ca 和 Mg 的 PBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>PDL 包被的盖玻片</td><td>Neuvitro</td><td>H-12-1.5-pdl</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗体 MDA-5</td><td>Abcam</td><td>ab126630</td><td>1:250 稀释；批号 #: GR97758-7</td></tr><tr><td>重组 JUNV Candid#1 毒株</td><td>实验室制备</td><td>实验室制备</td><td>如参考文献 13 中先前所述</td></tr><tr><td>与 Alexa-594 偶联的小鼠单克隆抗体 RIG-I</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-376845</td><td>1:1000 稀释；批号 #: AO218</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

负链rna病毒感染中双链rna与模式识别受体的共聚焦成像

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

双链（ds）RNA 是 RNA 病毒感染过程中产生的复制中间体。宿主模式识别受体（PRRs），例如视黄酸诱导基因 I（RIG-I）样受体（RLRs）RIG-I 和黑色素瘤分化相关蛋白 5（MDA-5）可识别 dsRNA，从而诱导先天免疫反应。在正义链 RNA 病毒感染中，dsRNA 的形成及其细胞内分布已通过显微镜技术得到充分表征。许多负义链 RNA 病毒（包括某些沙粒病毒）在感染期间也会触发先天免疫反应。然而，人们曾认为负义链 RNA 病毒产生的 dsRNA 水平较低，这阻碍了对 PRR 识别病毒 dsRNA 过程的成像研究。此外，高致病性沙粒病毒的感染实验必须在高等级生物安全防护实验室（BSL-4）中进行。由于研究人员在 BSL-4 实验室中面临额外的技术挑战，目前对高致病性 RNA 病毒的病毒 RNA 与 PRR 之间的相互作用仍知之甚少。最近，一种最初用于泛肠道病毒检测的单克隆抗体（Mab）（克隆号 9D5）被发现能够比传统的 J2 或 K1 抗 dsRNA 抗体更敏感且特异地检测 dsRNA。本文中，我们利用 9D5 抗体描述了一种共聚焦显微镜实验方案，该方案已成功用于在单个沙粒病毒感染细胞中同时可视化 dsRNA、病毒蛋白和 PRR。该方案也适用于在 BSL-4 实验室中对高致病性沙粒病毒感染细胞中 dsRNA 与 PRR 分布的成像研究。

本方案用于研究RLR（RIG-I和MDA-5）与JUNV感染细胞中dsRNA的分布及共定位情况。如图1和图2所示，随着病毒感染进程的推进，dsRNA的积累随时间逐渐增加。集中的MDA-5信号（图1）和RIG-I信号（图2）均与NP和dsRNA的点状结构共定位。
<img alt="JUNV 感染显微镜图像；dsRNA、MDA-5、NP 染色；与模拟感染的时间推移比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59095/59095fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 ...

RNA病毒复制过程中产生的双链RNA可被模式识别受体识别，从而诱导先天免疫反应。对于负链RNA病毒而言，低水平的双链RNA与模式识别受体之间的相互作用仍不明确。我们开发了一种共聚焦显微镜方法，用于在单个细胞中可视化沙粒病毒的双链RNA和模式识别受体。

负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像

双链（ds）RNA 是 RNA 病毒感染过程中产生的复制中间体。宿主模式识别受体对双链 RNA 的识别……

传统的双链RNA检测方法通常不够灵敏，无法检测到负链RNA病毒感染过程中形成的双链RNA。因此，双链RNA与宿主模式识别受体之间的相互作用在这些病毒中仍 largely 未被阐明。利用本方案，我们能够在单细胞水平上可视化并表征负链RNA病毒的病毒核蛋白、双链RNA与宿主PRR之间的相互作用。这是一种多重检测方法，可在单个细胞中同时对双链RNA以及两种病毒或宿主蛋白靶标进行染色。与RNA-FISH检测不同，该技术不依赖RNA序列，通常可与蛋白靶标的抗体检测兼容。在感染前24小时开始，将200,000个人类肺上皮A549细胞接种于12孔板中经Poly-D-Lysine包被的玻璃盖玻片上，并在37

confocal-imaging-double-stranded-rna-pattern-recognition-receptors

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

微链 rna 的共聚焦成像和模式识别受体在负感 rna 病毒感染中的应用

荧光法检测病毒RNA 原位 杂交（FISH）

来源：Mateer, E., 等，负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像。J. Vis. Exp.

感染上皮细胞中病毒双链RNA与宿主模式识别受体的可视化

本视频演示了杂交链式反应（HCR）-荧光原位杂交（FISH）技术在可视化SARS-CoV-2亚基因组RNA空间分布中的应用。将HCR与免疫荧光技术相结合，有望在单细胞水平上揭示宿主与病毒之间的相互作用。...

利用免疫-RNA 荧光原位杂交技术可视化 SARS-CoV-2

我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。...

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

病毒颗粒附着于表面是通过超分辨率荧光成像或原子力显微镜（AFM）进行单病毒颗粒成像的前提条件。本文展示了一种用于实现病毒颗粒在玻璃表面可控黏附的样品制备方法，适用于原子力显微镜和超分辨率荧光成像。...

单病毒颗粒原子力显微镜与超分辨率荧光成像的样品制备

针对病毒感染的先天防御反应由模式识别受体（PRRs）触发。两种胞质PRRs——RIG-I和PKR——可结合病毒特征性RNA，发生构象改变、寡聚化，并激活抗病毒信号通路。本文描述的方法可方便地监测这些胞质PRRs的构象转换和寡聚化过程。...

通过有限蛋白酶消化和天然PAGE监测抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR的激活

病毒转录工厂是富含细胞RNA聚合酶II的独立结构，在病毒再激活期间可增强病毒基因的转录。本文介绍一种结合免疫荧光染色与三维细胞核空间成像的方法，用于定位活跃转录的病毒染色质位点。 原位...

利用三维荧光显微镜对病毒转录工厂进行功能成像

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

在此，我们介绍一种简单的方法，该方法结合了RNA荧光原位杂交 将RNA原位杂交（RNA-FISH）与免疫荧光结合，用于可视化严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。该方案可能有助于加深理解SARS-CoV-2...

使用免疫RNA-荧光原位杂交技术可视化SARS-CoV-2

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。...

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

学习利用共聚焦显微镜技术对负链RNA病毒产生的双链RNA及模式识别受体进行单细胞水平成像，揭示病毒与宿主先天免疫反应的相互作用机制。该方法有助于深入理解病毒免疫逃逸并为抗病毒治疗提供新思路。

负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像

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