孢子吸附作为一种非重组型酶和抗原展示系统

展示抗原或酶的活细菌芽孢是具有功能活性的纳米颗粒，可用作黏膜疫苗或生物催化剂。原则上，任何蛋白质均可高效吸附到芽孢上。该技术操作简便，无需进行任何基因改造。

因此，该过程不涉及将重组生物体释放到环境中。除了用于人类和动物的黏膜疫苗学之外，展示酶的芽孢还可开发为可重复使用的生物催化剂。首先，在25摄氏度下，于含有50毫摩尔柠檬酸钠的200微升结合缓冲液中，使用2至5或10微克浓度的模型RFP，对两份各10的9次方个纯化的枯草芽孢杆菌野生型芽孢进行标记，振荡孵育1小时。

孵育结束后，通过离心收集结合混合物的沉淀，并将上清液转移至新的锥形管中，用于后续吸附效率分析。随后，用200微升结合缓冲液洗涤孢子沉淀两次，每次洗涤后在第二次洗涤结束时将沉淀重悬于100微升新鲜结合缓冲液中。对于表面蛋白提取，将每种吸附后孢子重悬液50微升加入50微升2×十二烷基硫酸钠-二硫苏糖醇溶液中，以溶解表面孢子蛋白。

在65摄氏度孵育45分钟后，通过离心收集混合物，并取10微升每份提取的蛋白质上清液进行Western印迹分析，使用识别mRFP N端His标签的单克隆抗His抗体来鉴定标记的表面蛋白。为通过荧光显微镜定位并定量吸附的分子，将5微升吸附孢子重悬液加入95微升PBS中，再将5微升所得悬液分别加至各载玻片上。将经多聚-L-赖氨酸处理的盖玻片置于每张载玻片上，然后将一张载玻片放置于荧光显微镜载物台上。

然后，对每个视野分别保存相差显微镜和荧光显微镜图像。进行图像分析时，在 ImageJ 中打开荧光显微镜图像，选择“Image”（图像）→“Type”（类型），确认所有图像均为 8 位格式。在“Analyze”（分析）菜单中选择“Set Measurements”（设置测量），并确认已选中“Area”（面积）、“Integrated density”（积分密度）和“Mean gray value”（平均灰度值）。

使用绘图或选择工具在目标孢子周围画一条线，然后从“分析”菜单中选择“测量”。此时将弹出一个对话框，显示所选孢子的一系列数值。在至少选择50个孢子后，再选择几个无孢子的区域，重复测量以获得背景荧光的读数。

在获取多个背景测量值后，将结果窗口中的所有数据复制到电子表格中，计算所选孢子区域的积分密度均值以及背景荧光值，以获得校正后的每细胞总荧光值。为间接评估吸附效率，将纯化的mRFP以0.5纳克/微升的浓度用结合缓冲液进行六次两倍系列稀释，每次稀释终体积为250微升；同时，对各保留的上清液样品（含有吸附反应中未结合的mRFP组分）取100微升，按实验所需数量用结合缓冲液进行两倍系列稀释，每次稀释加入100微升结合缓冲液。接着，将截留分子量为0.45微米的硝酸纤维素膜裁剪为9厘米×10厘米大小，使其恰好覆盖点印迹装置中五样品×六稀释梯度点的区域，且不超出密封垫圈边缘。

将预湿的膜放入点印迹装置中。检查膜的尺寸是否正确，并除去膜与垫圈之间截留的气泡。按照制造商的说明组装点印迹装置，并遮盖装置上未使用的部分，以防止空气通过这些孔。

当装置准备就绪后，在最外侧的两列加样孔中加入标准品，中间各列加入样品，每孔加入100 µL相应稀释度的溶液。所有样品加入后，开启真空泵抽吸两分钟，然后关闭真空泵，使样品依靠重力自然过滤通过膜。10分钟后，用100 µL PBS清洗每孔。

继续运行真空泵五分钟。当洗涤缓冲液完全从装置中排出后，在保持真空状态的同时，松开螺丝并小心打开点印迹装置。随后，根据标准的蛋白质印迹（Western blot）实验步骤处理膜。

对于滤膜的密度分析，打开 ImageJ 软件，参照示例，使用“分析”菜单中的“测量”命令，圈定每个点以测量其积分密度。为对图像进行背景校正，在空白区域绘制一个圆形，并测量其积分密度，操作如示例所示。将标准点的积分密度与所加载蛋白量相关联，得到校准曲线，并利用该校准曲线外推各样品点中 mRFP 的浓度。

随后可计算未结合组分中残留的mRFP浓度。只有在上样了吸附孢子提取物的泳道中出现预期大小的蛋白质，表明吸附反应成功。对吸附效率的直接评估取决于所使用的异源蛋白，可通过荧光显微镜和流式细胞仪对吸附反应分离后的沉淀组分进行分析来完成。

随后可使用 ImageJ 对孢子上的荧光信号进行定量分析，如示例所示。通过点印迹法分析含有未结合蛋白的上清组分，并对未结合蛋白进行后续的密度测定分析，可间接评估吸附效率。尽管原则上任何蛋白质均可被吸附用于黏膜疫苗或生物催化剂，但实际上吸附效率取决于蛋白质的结合位点及其化学性质。