Name: 酵母神经退行性蛋白病模型中组蛋白后转化修饰改变的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习利用酿酒酵母模型系统表征神经退行性疾病中的组蛋白后翻译修饰改变。该方法通过Western blot技术检测ALS和帕金森病相关的表观遗传变化，为诊断标志物和治疗靶点研究提供经济高效的实验工具。

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感谢Royena Tanaz、Huda Yousuf和Sadiqa Taasen提供的技术帮助。我们非常感谢James Shorter教授慷慨提供试剂，并在蔗糖梯度实验设计方面给予的学术支持。酵母质粒由Aaron Gitler教授慷慨惠赠（包括303Gal-FUS；Addgene质粒# 29614）。本研究得到布鲁克林学院、高级科学研究中心（CUNY）以及美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所高级博士后过渡奖（K22NS09131401）对M.P.T.的资助。

1. 用与神经退行性蛋白病相关的蛋白构建体转化S. cerevisiae
<ol>
	<li>在30 °C、200 rpm振荡条件下，于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）液体培养基中过夜培养野生型（WT）303酵母。</li>
	<li>经过12−16小时培养后，将酵母稀释至600 nm处的光密度（OD600将YPD培养基稀释至OD600为0.25。由于每次转化需要10 mL酵母液体培养物，因此共需准备50 mL酵母液体培养物，用于五组转化实验，分别对应FUS、TDP-43、a-synuclein和空载体（ccdB）构建体，以及一组不含DNA的阴性对照转化。</li>
	<li>在30 °C下振荡培养酵母至OD600 达到0.60至0.80之间，通常需要4−6小时。</li>
	<li>在酵母生长完成前30分钟，将质粒构建体线性化。 
	注意：此处使用的质粒构建体必须直接整合到基因组中，因此在转化前需要进行线性化处理。
	<ol>
		<li>计算相当于1 µg的质粒储存液的体积。从44 µL中减去该体积，以计算所需无核酸酶水的量。2O 需要。</li>
		<li>加入无核酸酶的 H2O，5 µL 10x 限制性内切酶缓冲液（材料表），1 µL NheI 限制性内切酶（材料表），以及步骤 1.4.1 中计算出的适量质粒加入微量离心管中。用移液器反复吹打充分混匀，37 °C 孵育 15 分钟。此时质粒已线性化，可用于转化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母培养物达到 OD 后600 0.6-0.8 时，将细胞收集至 50 mL 锥形管中，以 850 x g 4 °C 下离心 3 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL无菌H洗涤细胞沉淀2O 并在 850 x g 4 °C 下离心 3 分钟。弃去上清液。重复 3 次，共洗涤 4 次。</li>
	<li>在第三次洗涤开始时，将每份转化反应所需的10 µL鲑鱼精子DNA在加热块上解冻并煮沸5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于100 µL的dH₂O中2O 型细胞转化并分装至适当数量的微量离心管中。对于五次转化，将沉淀重悬于 500 µL 的 dH₂O 中2O，并均分为五个独立的微量离心管。</li>
	<li>离心5分钟，850 x g g 在室温（RT）下放置，并去除所有残留水分。</li>
	<li>按以下顺序加入：50 µL 无菌 H2O、240 µL 50% 聚乙二醇（PEG）、36 µL 1 M LiAc、10 µL 鲑鱼精子DNA、20 µL 线性化质粒DNA（或无DNA对照转化用无核酸酶水）。每次加入后充分混匀，待所有转化组分加入后短暂涡旋振荡。</li>
	<li>将转化反应在 42 °C 下孵育 20 分钟。 
	注意：为确保温度控制更加稳定，应在水浴中进行此孵育步骤。</li>
	<li>470 × g 离心 g 室温孵育5分钟。弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于200 µL无菌H2O.</li>
	<li>在选择性培养基平板上接种酵母悬液，并用玻璃珠或涂布棒涂布均匀。于30 °C培养2−3天。 
	注意：本文所述质粒使用合成缺陷型（SD）-His 平板。</li>
</ol>
2. 调查菌落生长抑制及在甘油保藏液中的储存
<ol>
	<li>从转化平板中挑取单菌落，接种于5 mL含有2%棉子糖的筛选培养基中，30 °C摇床过夜培养。每次转化至少挑选12个菌落。 
	注意：在“无DNA”转化对照平板上不应出现菌落。</li>
	<li>用乙醇对点种针（pin-frogger）进行灭菌，随后通过火焰灼烧进一步灭菌。</li>
	<li>将每种培养物的饱和菌液100 µL分装至96孔板的第一列各孔中。在相邻列的所有孔中加入200 µL无菌H2O。进行1:5梯度稀释时，用多通道移液器将第一列各孔中的50 µL菌液转移至后一列对应孔中，并通过反复吹打充分混匀；再从第二列各孔取50 µL转移至第三列，同样吹打混匀。以此类推，完成整块板的稀释操作。</li>
	<li>将点种针放入96孔板中蘸取菌液，然后轻轻且均匀地按压在含或不含半乳糖的筛选培养基平板上，实现酵母的点种。30 °C培养2−3天。 
	注意：本实验中所述质粒使用SD-His和SGal-His平板。</li>
	<li>对于FUS、TDP-43和a-synuclein的转化子，选择在含半乳糖条件下生长抑制最显著的菌落。从SD-His平板上挑取该菌落，接种于10 mL含2%棉子糖的筛选培养基中过夜培养。对于空载体对照，则挑选在含半乳糖条件下无生长抑制现象的菌落。</li>
	<li>制备甘油保存菌种时，取0.5 mL饱和液体培养物与0.5 mL 50%甘油混合，通过上下吹打混匀后于-80 °C冷冻保存。 
	注意：甘油菌种可在-80 °C保存长达一年。</li>
</ol>
3. 在S. cerevisiae中过表达与神经退行性蛋白病相关的蛋白质
<ol>
	<li>从冻存的甘油菌种中，将酵母重新划线接种于含2%葡萄糖的组氨酸缺陷型琼脂培养基平板上，30 °C培养2−3天。</li>
	<li>挑取各过表达模型及对照菌株的单菌落，分别接种于5 mL含2%棉子糖的组氨酸缺陷型液体培养基中，30 °C、200 rpm振荡培养过夜。</li>
	<li>分别培养各过表达模型及对照菌株（FUS、TDP-43及其空载体对照；α-突触核蛋白及其空载体对照）的100 mL液体培养物。
	<ol>
		<li>在补充有2%半乳糖的选择性液体培养基中制备100 mL培养液。</li>
		<li>测定过夜培养物的OD600值，并计算使过表达培养物起始OD600达到0.3所需的接种量。通常过夜培养物的OD600值在0.9−10之间，因此每100 mL新鲜培养液约需接种5 mL过夜培养物。</li>
		<li>通过在半乳糖培养基中（见步骤3.3.1）30 °C振荡培养5小时（FUS和TDP-43）或8小时（α-突触核蛋白）以诱导蛋白过表达。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在诱导结束时测定各培养物的OD600值。将所有菌液细胞数量标准化至最低OD600值。将菌液转移至50 mL离心管中，4 °C、850 × g离心5分钟，弃上清液。 
	注：若在诱导结束时测得100 mL α-突触核蛋白培养物和100 mL对照培养物的OD600值分别为0.654和0.984，则应分别收集95 mL的α-突触核蛋白培养物和67.1 mL的对照培养物。</li>
	<li>每10 mL培养液体积，用1 mL无菌dH2O重悬菌体沉淀。将重悬液按每管1 mL分装至微量离心管中，确保均分。例如，若起始培养体积为100 mL，则将沉淀重悬于10 mL无菌dH2O中，并分装至10个微量离心管中。</li>
	<li>4 °C、850 × g离心5分钟，弃上清液。将菌体沉淀在液氮中速冻，随后于-80 °C保存。 
	注：菌体沉淀可在-80 °C保存长达一年。</li>
</ol>
4. 细胞裂解及蛋白质印迹检测组蛋白翻译后修饰
<ol>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>将酵母细胞沉淀置于冰上解冻，并用 100 µL dH2O 重悬细胞沉淀。</li>
		<li>向细胞重悬液中加入 300 µL 0.2 M NaOH 和 20 µL 2-巯基乙醇。通过移液上下吹打混匀。</li>
		<li>将细胞在冰上孵育 10 分钟，然后在台式离心机中以 3,200 x g 离心 30 秒（室温），弃去上清液。</li>
		<li>用 100 µL 1x 上样染料重悬细胞沉淀，并在加热块上煮沸 10 分钟。 
		注：6x 上样染料的配方见材料表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳及膜转移
	<ol>
		<li>准备电泳槽：将两块凝胶放入凝胶架中，内槽加满电泳缓冲液至顶部，外槽加至双凝胶刻度线处。</li>
		<li>将步骤 4.1.4 中的样品每孔上样 15 µL，加至 10 孔 12% 聚丙烯酰胺凝胶中；蛋白分子量标记（ladder）孔上样 5 µL。</li>
		<li>以 150 V 电压电泳约 45 分钟，或直至上样染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
		<li>电泳过程中，准备膜转移：将纤维垫（每块凝胶两片）浸入转移缓冲液（材料表）中，将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜浸入甲醇中。转移前用转移缓冲液冲洗 PVDF 膜。 
		注：PVDF 膜应裁剪至与凝胶大小一致，每块待转移凝胶使用一张 PVDF 膜。</li>
		<li>在半干转装置上组装转移“三明治”结构：从底电极开始，依次放置（1）预浸润的纤维垫、（2）预浸润并冲洗过的 PVDF 膜、（3）步骤 4.2.3 中的凝胶、（4）第二张预浸润的纤维垫。 
		注：确保转移“三明治”中无气泡。可用移液管轻轻滚动“三明治”以排出气泡。凝胶放置于 PVDF 膜上后，切勿移动。</li>
		<li>设置电源为 150 mA，进行 1 小时蛋白转移（适用于一个“三明治”结构）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用修饰特异性抗体检测组蛋白 PTM
	<ol>
		<li>从转移装置中取出膜，用 dH2O 短暂冲洗。
		<ol>
			<li>可选：通过丽春红 S（Ponceau-S）染色检测蛋白转移效果——将足量丽春红 S 染液倒入小型塑料盒中以覆盖膜，室温轻摇孵育 30−60 秒。倒掉染液，用 dH2O 冲洗至背景染色消失且蛋白条带肉眼可见。继续用 dH2O 冲洗，直至膜上所有染料完全去除。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将膜置于小型染色盒中，加入足量的 Tris 缓冲盐水（TBS）封闭缓冲液（材料表），室温轻摇孵育 1 小时进行封闭。封闭液体积应足以覆盖膜。 
		注：将膜直立放置于染色盒中，确保带有蛋白的一面不朝下。</li>
		<li>在染色盒中，使用针对酵母的组蛋白修饰特异性抗体于 4 °C 过夜孵育。根据生产商说明，用 TBS 封闭缓冲液稀释抗体。同时设置合适的核蛋白上样对照，例如使用与修饰特异性抗体不同宿主物种的抗总 H3 抗体。例如，若使用兔源抗 H3S10ph 抗体检测 H3S10ph，则使用鼠源抗总 H3 抗体作为上样对照。根据需要，每次 blot 均重复此操作。 
		注：抗体稀释液可在一个月内重复使用最多三次，储存于 4 °C。</li>
		<li>用自制的含 0.1% 吐温 20（TBST）的 TBS 溶液在室温轻摇条件下洗涤膜 4 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>使用荧光二抗（驴抗兔 680 和驴抗鼠）按生产商推荐稀释比例，在室温避光孵育 1 小时。 
		注：荧光二抗在储存和使用过程中均需避光。孵育时应使用避光塑料盒或用铝箔包裹。</li>
		<li>在室温轻摇条件下，用 TBST 洗涤膜 4 次，每次 5 分钟，最后用 TBS 洗涤 5 分钟。</li>
		<li>在荧光 Western blot 成像系统上成像 2 分钟。分别在 800 nm 和 700 nm 通道检测驴抗兔 680 和驴抗鼠 800 二抗信号。 
		注：实验重复组应从第 1 部分开始独立进行。必须确认抗体信号响应处于线性响应范围内，以确保本实验数据解读的准确性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析与统计
<ol>
	<li>在成像软件中打开印迹图像（材料表). 在分析模式下，通过绘制一个矩形框选条带，获取对照载体、TDP-43 和 FUS（或对照载体和 a-synuclein）样品中修饰特异性条带的原始密度值。</li>
	<li>重复步骤5.1以加载内参对照条带。 
	注意：每个样本中均会出现一条上样对照条带和一条特异性修饰条带。</li>
	<li>通过将每个修饰特异性条带的密度除以相应载体对照样品中条带的密度，计算修饰特异性条带的相对密度。此步骤可将数据归一化至载体对照。</li>
	<li>通过将每个条带的密度除以对照载体样本中相应上样对照条带的密度，计算上样对照条带的相对密度。</li>
	<li>通过将每个样本的修饰特异性条带的相对密度除以其上样对照条带的相对密度，计算各条带的校正后相对密度。现在可将数据以柱状图形式进行可视化。 
	注意：为便于处理，步骤 5.3–5.5 可在电子表格中进行（补充文件).</li>
	<li>经过多次独立重复实验后，对两种对照样本与相应的蛋白质病模型之间进行韦尔奇T检验（对照组 versus FUS、对照组 versus TDP-43、对照组 versus a-synuclein） p 以 0.05 作为显著性检验的界值。</li>
</ol>

<ol><li>Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).</li>
<li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li>
<li>Beitz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+Disease%3A+a+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Parkinson's Disease: a Review.</a> Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li>
<li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013(2017).</li>
<li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).</li>
<li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li>
<li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li>
<li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS%2FTLS+in+ALS+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li>
<li>King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tip+of+the+iceberg%3A+RNA-binding+proteins+with+prion-like+domains+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease.</a> Brain Research. 1462, 61-80 (2012).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li>
<li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson%27s+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).</li>
<li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+parkinson%27s+disease%3A+dopamine%2C+vesicles+and+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+in+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li>
<li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li>
<li>Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+concepts+of+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Basic concepts of epigenetics.</a> Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).</li>
<li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and transcriptional regulatory.</a> Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li>
<li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li>
<li>Sanchez, Y., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP104+required+for+induced+thermotolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HSP104 required for induced thermotolerance.</a> Science. 248 (4959), 1112(1990).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772(2003).</li>
<li>Johnson, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+Is+Intrinsically+Aggregation-prone%2C+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis-linked+Mutations+Accelerate+Aggregation+and+Increase+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329(2009).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLOS Biology. 9 (4), e1000614(2011).</li>
<li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).</li>
<li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li>
<li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Reveal+a+%E2%80%9CDruggable%E2%80%9D+Rsp5%2FNedd4+Network+that+Ameliorates+%CE%B1-Synuclein+Toxicity+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979(2013).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li>
<li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757(1990).</li>
<li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591(2016).</li>
<li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li>
<li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+sequestration+of+FUS%2FTLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li>
<li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+%28ALS%29+Causing+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li>
<li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson%E2%80%99s+disease%3A+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li>
<li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Modifications+of+the+%CE%B1-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案为一种简单、快速且经济高效的方法，可用于分类与神经退行性蛋白病相关的全基因组组蛋白翻译后修饰变化。尽管还存在其他肌萎缩侧索硬化症和帕金森病模型，例如 体外 人细胞系和小鼠模型32, S. cerevisiae 因其使用简便而仍具吸引力。例如，酵母模型无需使用无菌操作台，也无需进行细胞培养工作所需的大量培训。此外，培养酵母所需的试剂也比哺乳动物细胞培养耗材更为经济实惠。酵母模型已被广泛用于揭示蛋白质聚集的结构域决定因素22,23,24,25,26，而且还推动了肌萎缩侧索硬化症（ALS）遗传风险因素的发现27以及蛋白质聚集毒性的调节因子22<...

神经退行性疾病是毁灭性的疾病，目前几乎没有有效的治疗手段。在这些疾病中，肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD）尤为严重。大约90%的ALS和PD病例属于散发性，即无家族病史，其余病例则具有家族遗传性，通常与特定的基因突变相关1,2。有趣的是，这两种疾病均与蛋白质的错误定位和聚集有关3,4,5,6。例如，肉瘤融合蛋白（FUS）和TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是RNA结合蛋白，在ALS中会错误地定位至细胞质并发生聚集7,8,9,10,11,12，而α-突触核蛋白（α-synuclein）则是PD中被称为路易小体（Lewy bodies）的蛋白质聚集体的主要成分5,13,14,15。
尽管在大规模患者群体中已开展了广泛的全基因组关联研究，但绝大多数肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD）病例在遗传学上仍无法解释。表观遗传学是否在神经退行性疾病中发挥作用？表观遗传学是指在不改变DNA序列的前提下发生的基因表达变化16。其中一种主要的表观遗传机制涉及组蛋白蛋白的翻译后修饰（PTMs）16。在真核细胞中，遗传物质紧密地包装成染色质。染色质的基本单位是核小体，由146个碱基对的DNA缠绕在一个组蛋白八聚体上构成，该八聚体包含四对组蛋白（H2A、H2B、H3和H4各两个拷贝）17。每种组蛋白均具有一个从核小体向外突出的N端尾部，可在赖氨酸和精氨酸残基上被添加多种化学基团而发生修饰18。这些翻译后修饰具有动态性，即可被快速添加或去除，常见的修饰类型包括乙酰化、甲基化和磷酸化等。翻译后修饰调控DNA对转录机器的可及性，从而参与调控基因表达18。例如，组蛋白乙酰化会减弱带强正电荷的组蛋白与带负电荷的DNA骨架之间的静电相互作用，使得由乙酰化组蛋白包装的基因更易于被接近，因而表达水平更高19。近年来，特定组蛋白翻译后修饰及其组合所表现出的显著生物学特异性，催生了“组蛋白密码”假说20,21，即负责书写、擦除和读取组蛋白翻译后修饰的蛋白质协同作用，共同调节基因表达。
酵母是研究神经退行性疾病的极有用模型。重要的是，许多神经元的细胞通路从酵母到人类都具有保守性22,23,24。在过表达FUS、TDP-43或α-突触核蛋白时，酵母可重现细胞毒性表型和蛋白包涵体22,23,24,25,26。事实上，用于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）的Saccharomyces cerevisiae模型已被用来鉴定人类的遗传风险因素27。此外，过表达人源α-突触核蛋白的酵母模型有助于表征Rsp5网络，将其作为可靶向的治疗靶点，以减轻神经元中α-突触核蛋白的毒性28,29。
本文介绍了一种利用Saccharomyces cerevisiae检测与神经退行性蛋白病相关的全基因组组蛋白翻译后修饰（PTM）变化的实验方案（图1）。与其它体外及动物神经退行性疾病模型相比，S. cerevisiae具有操作简便、成本低、实验周期短等显著优势，因而极具吸引力。我们利用先前建立的肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD）模型22,23,25,26，在酵母中过表达人源FUS、TDP-43和α-突触核蛋白，揭示了每种蛋白病所伴随的独特组蛋白PTM变化30。本方案从转化到数据分析可在两周内完成。

<table><tbody><tr><td>-His DO 补充剂</td><td>Clontech</td><td>630415</td><td></td></tr><tr><td>10x 电泳缓冲液</td><td></td><td></td><td>配制：141.65 g 甘氨酸（ThermoFisher BP381-1）、30.3 g Trizma 碱基（Sigma-Aldrich T6066）、10 g 十二烷基硫酸钠（Sigma-Aldrich L3771），溶于 1 L 去离子水中，调 pH 至 8.8。</td></tr><tr><td>12% 聚丙烯酰胺凝胶</td><td>BIO-RAD</td><td>456-1041</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>抗乙酰化组蛋白 H3（Lys14）一抗</td><td>MilliporeSigma</td><td>07-353（批号 2762291）</td><td>稀释比例：1/1000</td></tr><tr><td>抗乙酰化组蛋白 H4（Lys16）一抗</td><td>Abcam</td><td>ab109463（批号 GR187780）</td><td>稀释比例：1/2000</td></tr><tr><td>抗乙酰化组蛋白 H4（Lys12）一抗</td><td>Abcam</td><td>ab46983（批号 GR71882）</td><td>稀释比例：1/5000</td></tr><tr><td>抗二甲基化组蛋白 H3（Lys36）一抗</td><td>Abcam</td><td>ab9049（批号 GR266894, GR3236147）</td><td>稀释比例：1/1000</td></tr><tr><td>抗组蛋白 H3 一抗</td><td>Abcam</td><td>ab24834（批号 GR236539, GR174196, GR3194335）</td><td>核蛋白上样对照；稀释比例：1/2000</td></tr><tr><td>抗磷酸化组蛋白 H2B（Thr129）一抗</td><td>Abcam</td><td>ab188292（批号 GR211874）</td><td>稀释比例：1/1000</td></tr><tr><td>抗磷酸化组蛋白 H3（Ser10）一抗</td><td>Abcam</td><td>ab5176（批号 GR264582, GR192662, GR3217296）</td><td>稀释比例：1/1000</td></tr><tr><td>BioPhotometer D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿（100 × 20 mm）</td><td>Eppendorf</td><td>30702118</td><td></td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板</td><td>Eppendorf</td><td>30730011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IRDye 800 CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32212（批号 C60301-05, C61116-02, C80108-05）</td><td>稀释比例：1/5000</td></tr><tr><td>驴抗兔 IRDye 860 RD</td><td>LI-COR</td><td>926-68073（批号 C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07）</td><td>稀释比例：1/2500</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>加厚印迹纸（滤纸）</td><td>BIO-RAD</td><td>1703968</td><td></td></tr><tr><td>半乳糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>配制 20% w/v 储存液。</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>配制 20% w/v 储存液。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>配制 50% w/v 溶液。</td></tr><tr><td>Immobilon-FL 转膜膜</td><td>MilliporeSigma</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂二水合物（LiAc）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td>配制 1 M 溶液。</td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td></td><td></td><td>配制：1.2 g 十二烷基硫酸钠、6 mg 溴酚蓝（Sigma-Aldrich B8026）、4.7 mL 甘油、1.2 mL 0.5 M Trizma 碱基（pH 6.8）、0.93 g DL-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich D0632），加去离子水至总体积 2.1 mL。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>ThermoFisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽</td><td>BIO-RAD</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>2231300045</td><td></td></tr><tr><td>NEB 限制性内切酶缓冲液 2.1，10x</td><td>New England Bio Labs</td><td>102855-152</td><td></td></tr><tr><td>Nhe I 限制性内切酶</td><td>New England Bio Labs</td><td>101228-710</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc 成像系统</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>2800-03</td><td></td></tr><tr><td>OmniTray 细胞培养处理带盖无菌聚苯乙烯培养盘（86 × 128 mm）</td><td>ThermoFisher</td><td>165218</td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td><td>由 A. Gitler 惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-ccdB</td><td>Addgene</td><td>14133</td><td></td></tr><tr><td>pAG303Gal-FUS</td><td>Addgene</td><td>29614</td><td></td></tr><tr><td>pAG303GAL-TDP-43</td><td>由 A. Gitler 惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（PEG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td><td>配制 50% w/v 溶液。</td></tr><tr><td>Ponceau S 染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504</td><td>配制：0.5 g 0.1% w/w Ponceau S 染料、5 mL 1% v/v 乙酸（Sigma-Aldrich 320099），溶于 500 mL 去离子水中。</td></tr><tr><td>PowerPac Basic 电源</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>棉子糖五水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7630</td><td>配制 10% w/v 储存液。</td></tr><tr><td>鲑精 DNA</td><td>Agilent Tech</td><td>201190</td><td></td></tr><tr><td>SD-His 平板</td><td></td><td></td><td>配制：20 g 琼脂（Sigma-Aldrich A1296）、0.77 g -His DO 补充剂、6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础（ThermoFisher 291920），溶于 900 mL 去离子水中。</td></tr><tr><td>SGal-His 平板</td><td></td><td></td><td>配制：20 g 琼脂、0.77 g -His DO 补充剂、6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础、100 mL 半乳糖溶液，加去离子水至总体积 900 mL。</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠上样缓冲液</td><td></td><td></td><td>于 -20 °C 保存。6X 配方：1.2 g 十二烷基硫酸钠、6 mg 溴酚蓝、0.93 g DL-二硫苏糖醇、2.1 mL 去离子水、4.7 mL 甘油、1.2 mL 0.5 M Trizma 碱基（pH 6.8）。</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>配制 0.2 M 溶液。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>配制 20% w/v 储存液。</td></tr><tr><td>TBS + 0.1% Tween 20（TBST）</td><td></td><td></td><td>配制：100 mL 10X TBS、1 mL Tween 20（Sigma-Aldrich P7949），加去离子水至总体积 900 mL。</td></tr><tr><td>TBS 封闭缓冲液</td><td>LI-COR</td><td>927-5000</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD 半干式电转移槽</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>转膜缓冲液</td><td></td><td></td><td>配制：22.5 g 甘氨酸、4.84 g Trizma 碱基、400 mL 甲醇、1 g 十二烷基硫酸钠，加去离子水至总体积 1.6 L。</td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐水（TBS）</td><td></td><td></td><td>10X，pH 7.6：配制 24 g Trizma 碱基和 88 g 氯化钠（Sigma-Aldrich S7653），加去离子水至 1 L。</td></tr><tr><td>WT 303 &lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; 酵母</td><td>由 J. Shorter 惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375</td><td></td></tr></tbody></table>

表征酵母神经退行性蛋白病模型中的组蛋白翻译后修饰变化

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD））每年导致数十万人死亡。目前尚缺乏能够阻止疾病进展的有效治疗手段。尽管已在大规模患者群体中开展了广泛的测序工作，但大多数ALS和PD病例仍无法仅通过基因突变加以解释。表观遗传机制（如组蛋白蛋白的翻译后修饰）可能参与了神经退行性疾病的病因及进展过程，并为药物干预提供新的靶点。用于研究ALS和PD的哺乳动物体内和体外模型成本高昂，且通常需要耗时且繁琐的实验流程。本文介绍了一种实用、快速且经济高效的方法，利用Saccharomyces cerevisiae作为模型系统，检测组蛋白修饰水平的全基因组变化。该实验方案可全面探究与神经退行性蛋白病相关的表观遗传改变，不仅验证了在其他模型系统中已有的发现，还显著拓展了我们对神经退行性疾病表观基因组的认识。

为了说明该方法，我们将利用近期发表的研究结果30。野生型人源 FUS 和 TDP-43 过表达 5 小时，而野生型 α-突触核蛋白过表达 8 小时。使用 ccdB 构建体作为载体阴性对照。图 2 显示了在固体和液体培养基中生长受到抑制的情况。按照所述方法收集酵母，并使用修饰特异性抗体进行蛋白质印迹分析。抗 H3 总抗体用作上样对照。在 FUS 过表达模型中，H3S10 磷酸化（H3S10ph）和 H3K14 乙酰化（H3K14ac）水平显著降低（图 3a、b）。在 TDP-43 过表达模型中，H4K12 和 H4K16 乙酰化水平显著升高，而在 FUS 或 α-突触核蛋白过表达模型中未观察到该现象（图 3c、d）。在 α-突触核蛋白过表达模型中，H3K36 二甲基化（H3K36me...

本方案概述了在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）模型中，针对与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病相关蛋白过表达所引发的组蛋白翻译后修饰（PTM）全基因组水平变化的表征实验流程。经SDS-PAGE分离后，通过特异性识别修饰位点的抗体，利用蛋白质印迹法（Western blotting）检测各组蛋白PTM的水平。

神经退行性疾病，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD），导致数十万人死亡……

本方案使我们能够便捷地探究神经退行性疾病的表观遗传特征。该技术的主要优势在于利用酵母作为模型系统，与其他细胞和动物神经退行性疾病模型相比，酵母具有快速高效且成本低廉的特点。该技术使我们能够绘制出神经退行性疾病中出现的表观遗传变化，这可能为疾病诊断提供新的标志物，并为治疗提供新的靶点。该方法可用于进一步研究表观遗传标记在神经退行性疾病中的作用，并可经修改后用于评估人类成纤维细胞和诱导性多能干细胞。此特定方法包含多个需要通过视觉演示才能准确展示的细节，例如蛋白质印迹装置的正确上样操作。本次实验操作将由 Michel Fallah 和 Navin Rana 进行演示，两人均为 Torrente 实验室的本科研究人员。首先将酵母从冷冻甘油菌种中重新划线接种至含2%葡萄糖的组氨酸选择性琼脂培养基平板上，在30摄氏度条件下培养两到三天。培养结束后，将每种过表达模型及对照菌株的重新划线酵母分别接种至5毫升组氨酸选择性液体培养基中，添加2%棉子糖，在30摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养。第二天早晨，在选择性培养基中加入2%半乳糖，每种过表达模型和对照组分别培养100毫升液体培养物过夜。测定600纳米处的光密度（OD600），以确定为使过表达培养物的起始OD600达到0.3所需的过夜培养物体积。为诱导蛋白过表达，将酵母在30摄氏度下于半乳糖培养基中振荡培养，持续适当的实验时间。然后在诱导期结束时测定每种培养物的OD600值，并将所有细胞数量标准化至最低的OD600值。将培养物在50毫升离心管中通过离心收集，并将沉淀物重新悬浮于每10毫升培养物体积对应1毫升的无菌蒸馏水中。将细胞重悬液每管1毫升分装至若干微量离心管中，进行额外一次离心，并吸除上清液。随后将细胞沉淀在液氮中速冻，于-80摄氏度保存。为进行蛋白质印迹分析而裂解细胞时，先将酵母细胞沉淀置于冰上解冻，再重悬于100微升蒸馏水中。向每个细胞样品中加入 300 微升 0.2 摩尔的氢氧化钠和 20 微升 2-巯基乙醇。用移液器重悬沉淀。冰上孵育 10 分钟后，通过离心收集细胞沉淀，并将样品重悬于 100 微升上样染料中。然后将样品在加热块上煮沸10分钟。在样品裂解的同时，将两块凝胶放入凝胶架中，并将电泳缓冲液加至内槽顶部，外槽加至双凝胶线标记处。当样品准备好后，向每块10孔、12%聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中加入15 µL细胞裂解液，并在蛋白ladder加样孔中加入5 µL蛋白ladder。在150伏电压下电泳约45分钟，或直至加样染料前沿迁移至凝胶底部。在电泳进行的同时，每块凝胶用转移缓冲液浸泡两块纤维垫，并用甲醇浸泡一张聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。当凝胶电泳完成后，用转移缓冲液冲洗膜，并将一块预先浸泡过的纤维垫放置于半干式转膜装置细胞的底部。随后放置PVDF膜、凝胶以及第二块预浸泡的纤维垫。然后将电流设置为150毫安，持续1小时。蛋白转膜结束后，从转膜装置中取出膜，用蒸馏水短暂漂洗。将清洗后的膜蛋白面朝上放入小型染色盒中，加入TBS（Tris缓冲盐水）封闭液，室温下轻轻摇动孵育1小时。封闭孵育结束后，将膜与抗酵母组蛋白及修饰特异性抗体在4°C的TBS中4°C过夜孵育，并同时使用适当的核蛋白上样对照抗体。次日早晨，用含0.1%吐温-20的TBS溶液在室温下振荡洗涤膜，每次5分钟，共洗涤4次。最后一次洗涤后，在室温下用适当的二抗孵育1小时。随后用TBST振荡洗涤4次，每次5分钟，最后再用TBS单独振荡洗涤1次，每次5分钟。然后在荧光 Western 印迹成像系统中对印迹成像两分钟。此处显示了在固体和液体培养物中生长抑制的情况，在含半乳糖的融合肉瘤病毒过表达模型中观察到对酵母生长的显著影响。在融合肉瘤病毒过表达模型中，组蛋白水平显著降低；而在 TAR 结合蛋白 43 过表达模型中，组蛋白乙酰化水平显著升高，而这种变化在融合肉瘤病毒或 α-突触核蛋白过表达模型中均未观察到。在α-突触核蛋白过表达模型中，组蛋白水平也存在显著下降。在该蔗糖调节实验中，用于诱导FUS（fused in sarcoma）过表达的半乳糖浓度越低，在固体和液体培养中观察到的毒性也越低。重要的是，FUS过表达水平越低，组蛋白水平下降的幅度也越小。在执行本实验方案时，必须对每个样品中的酵母用量进行标准化，以便准确比较组蛋白翻译后修饰水平。2-巯基乙醇应在通风橱中使用，以避免吸入。若使用丽春红染色，必须按规定妥善处理废液。

characterizing-histone-post-translational-modification-alterations

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

酵母神经退行性蛋白病模型中组蛋白后转化修饰改变的表征

在这次访谈中，Lindquist 博士阐述了蛋白质折叠、朊病毒疾病与神经退行性疾病之间的关系。蛋白质折叠问题是现代生物学的核心。除了传统的生化功能外，蛋白质还能介导生物信息的传递，因此可被视为一种遗传物质。蛋白质这一新近发现的功能，对人类疾病的研究具有重要意义。Lindquist...

访谈：蛋白质折叠与神经退行性疾病研究

高通量酵母质粒过表达筛选

本文描述了三种互补的实验方案，用于评估聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白在酵母Saccharomyces...

评估酵母中多聚谷氨酰胺毒性的生长实验

来源：Bennett, S. A., 等，在酵母神经退行性蛋白病模型中表征组蛋白翻译后修饰的改变。J. Vis. Exp.

在神经退行性蛋白过表达的酵母细胞中检测组蛋白修饰

酵母蛋白病变模型是评估与疾病相关的蛋白质毒性和聚集性的有力工具。本文介绍了筛选Hsp104变体文库中毒性抑制因子的方法。该方案可适用于在酵母中具有毒性的任何蛋白质，用于筛选任意蛋白文库中的毒性抑制因子。...

利用酵母蛋白病变模型分离增强型Hsp104变体

果蝇（Drosophila）被广泛用作研究神经变性的模式系统。本方案描述了一种通过检测大脑中空泡形成来量化神经变性的方法。此外，通过将对照组和实验组果蝇作为同一样本进行处理和切片，该方法还能最大限度地减少实验操作带来的影响。...

大规模组织学定量分析神经退行性变 果蝇

靶向 原位 酿酒酵母组蛋白基因的诱变

本文介绍了一种基于交配的方法，利用阵列式质粒文库促进芽殖酵母中的过表达筛选。...

基于交配的酵母过表达文库筛选

本方案概述了如何利用三维细胞培养系统在接近生理状态下建模、处理和分析染色质修饰。...

三维肝组织细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全局定量分析

研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。...

一种利用人源化酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

本文描述了一种重建人源γ-分泌酶的酵母系统。该系统可用于鉴定和研究影响酶活性的突变，并可用于筛选γ-分泌酶抑制剂（GSIs）。利用家族性阿尔茨海默病突变体的功能丧失特性，还可用于筛选γ-分泌酶调节剂（GSMs）。...

Saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

学习利用酿酒酵母模型系统表征神经退行性疾病中的组蛋白后翻译修饰改变。该方法通过Western blot技术检测ALS和帕金森病相关的表观遗传变化，为诊断标志物和治疗靶点研究提供经济高效的实验工具。

表征酵母神经退行性蛋白病模型中的组蛋白翻译后修饰变化

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