酵母神经退行性蛋白病模型中组蛋白后转化修饰改变的表征

该协议使我们能够轻松探索神经退行性疾病的表观遗传特征。与神经退行性疾病的其他细胞和动物模型相比，该技术的主要优点是利用酵母作为模型系统，酵母是权宜之计且具有成本效益的。这项技术使我们能够绘制出神经退行性疾病产生的表观遗传变化，这可能导致新的诊断标记，以及新的治疗目标。

该方法可进一步研究表观遗传标记在神经退行性疾病中的作用，并可修改用于人类成纤维细胞和诱导多能干细胞的评估。此特定方法包含许多需要直观演示的详细信息，例如正确加载西方印迹装置。演示这个程序的将是米歇尔·法拉和纳文·拉纳，他们都是托伦特实验室的本科生。

首先将酵母从冷冻甘油中重新吸收到2%葡萄糖糖选择性培养中板，在30摄氏度下孵育两到三天。在孵化结束时，接种再生长酵母，每个超过表达模型和控制在五毫升组蛋白选择性液体介质。在30摄氏度下辅以2%的拉芬糖，在一夜之间每分钟旋转200次。

第二天早上，在选择性介质中，每个过度表达模型和控制培养100毫升的液体培养，并在夜间辅以2%的乳糖。测量 600 纳米或 OD600 的光学密度，以确定在 0.3 的起始 OD600 下渲染表达区域性所需的隔夜培养量。为了诱导蛋白质过度表达，在30摄氏度的高温下将酵母生长在乳糖介质上，在适当的实验周期内摇动。

然后在感应期结束时测量每种区域性的 OD600。将所有单元格计数标准化为最低 OD600 值。通过离心在50毫升离心管中收获培养物，并在每生长10毫升培养物的无菌静止水中将颗粒重新塞在一毫升中。

一毫升细胞再增入单个微离心管，用于额外的离心和吸附超盐。然后在零下80摄氏度时将液氮中的细胞颗粒捕捉冻结，以储存。要将细胞裂化为西方的印迹分析，在100微升蒸馏水中重新浮光之前，先将酵母细胞颗粒解冻到冰上。

在每个细胞样品中加入300微升0.2摩尔氢氧化钠和20微升2-墨二甲醇。通过移液重新暂停颗粒。在冰上孵育10分钟后，通过离心对细胞进行颗粒化，并在100微升的装载染料中重新入料。

然后在加热块上煮样品10分钟。在将样品进行线状处理时，将两个凝胶放在凝胶支架中，用运行缓冲液填充内腔，将外室填充到双凝胶线标记处。当样品准备好时，将每个15微升、细胞解液装进10井、12%聚丙烯酰胺凝胶，并将5微升蛋白质梯加入蛋白质梯井。

在 150 伏特下运行凝胶约 45 分钟，或直到加载染料前部到达凝胶底部。当凝胶运行时，将每个凝胶的两个纤维垫浸入转移缓冲液中，将一个聚氯乙烯氟化物（PVDF）浸泡在甲醇中，每个凝胶的膜。凝胶准备就绪后，在转移缓冲液中冲洗膜，并在半干转移装置单元的底部放置一个预索的纤维垫。

其次是PVDF膜、凝胶和第二个预索纤维垫。然后将电源设置为 150 毫安一小时。在蛋白质转移结束时，从转移装置上取出膜，用蒸馏水短暂冲洗。

将冲洗过的膜、蛋白质侧放在一个小染色盒中，并用三分缓冲的盐水或TBS覆盖膜，用温和的摇动在室温下阻断缓冲液一小时。在阻断孵育结束时，在4摄氏度的TBS中用抗酵母组蛋白和修饰特异性抗体孵育膜过夜。和适当的核载荷控制抗体。

第二天早上，用TBS洗四次膜，辅以0.1%多糖20，每次洗涤时摇动5分钟。最后一次洗涤后，用适当的二次抗体在室温下孵育一小时。接着是四，五分钟洗在TBST和一个五分钟洗在TBS单独与摇摆。

然后在荧光西方印迹想象系统上成像两分钟的印迹。在这里，固体和液体培养物的生长抑制显示对酵母生长有显著的影响，在肉瘤过度表达模型中，在糖酸乳过度表达模型中存在注入的半乳糖。在肉瘤过度表达模型中的融合中，组蛋白水平显著下降，在 TAR 结合蛋白 43 过度表达模型中，组蛋白乙酰化水平显著增加，在熔融中肉瘤或阿尔法通核过度表达模型中均未见。

在α合成素过度表达模型中，组蛋白水平也有显著降低。在这个蔗糖调谐实验中，用于诱导肉瘤过度表达的半乳糖的量越低，在固体和液体培养中观察到的毒性越低。重要的是，肉瘤过度表达的熔融水平越低，组蛋白水平降低的幅度越小。

在执行此协议时，必须标准化每个样品中的酵母量，以便能够对转化后组蛋白的含量进行适当的比较。2-墨卡托乙醇应在发动机罩下使用，以避免吸入。如果使用庞塞奥污渍，则必须正确丢弃。