Name: 在异种性鼠模型中的移植-无源疾病的诱导和评分,以及使用数字PCR对小鼠组织中人类T细胞的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 学习在NSG小鼠中诱导异种移植物抗宿主病(xenoGVHD)并进行标准化评分的方法。使用数字PCR定量检测小鼠组织中的人类T细胞，为免疫抑制疗法的临床转化研究提供可靠的体内模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Lane Christenson实验室为本实验提供了数字PCR仪以及给予的技术支持。我们还要感谢Thomas Yankee博士提供的指导和帮助。这些研究得到了Tripp家族基金会的资助。

所有小鼠实验均在堪萨斯大学医学中心机构动物护理和使用委员会的合规监督下并经其批准后进行。所有健康人血液样本均在获得知情同意及堪萨斯大学医学中心机构审查委员会批准后获取。
1. NSG 小鼠的照射
<ol>
	<li>在PBMC注射前一天，对8至12周龄的NSG小鼠（可使用任一性别）进行照射。在无菌生物安全柜中，将小鼠放入已灭菌的派型鼠笼或独立通气笼具中。使用Cs137放射源或小型动物照射仪（例如RS 2000），以150 cGy的总剂量对小鼠进行照射，同时缓慢旋转以确保照射均匀。</li>
	<li>将小鼠转移至无菌生物安全柜中的洁净笼盒内。</li>
</ol>
2. 注射用人外周血单个核细胞的制备
<ol>
	<li>采集足量的健康人血液，以分离出每只小鼠 1.1 × 107 个外周血单个核细胞（PBMC）。将肝素抗凝的血液用等体积含 2% 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。 
	注意：采用本方案，通常每 10 mL 全血可获得 0.5–1 × 107 个 PBMC。每只小鼠将接受 107 个 PBMC，溶于 100 µL PBS 中。额外准备每只小鼠 1 × 106 个 PBMC（溶于 10 µL PBS），以确保在注射器加样过程中若出现损耗，仍能保证每只小鼠获得完整剂量。</li>
	<li>向 50 mL 圆底离心管中加入 15 mL 淋巴细胞分离密度梯度介质（例如 Ficoll），然后小心地将最多 25 mL 稀释后的血液叠加在密度梯度液上方。将含有密度梯度介质和稀释血液的离心管在室温下以 400 × g 离心 40 分钟，离心过程中不启用刹车。</li>
	<li>收集位于密度梯度界面的 PBMC 层，转移至含 10 mL PBS 的 50 mL 圆底离心管中。以 400 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>轻弹离心管使细胞沉淀松散，加入 10 mL PBS 重悬细胞以洗涤 PBMC。以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>（可选）弃去上清液，向细胞沉淀中加入与沉淀体积相等的氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液，以裂解红细胞（RBCs）。轻轻重悬沉淀，并轻轻摇晃离心管 30–60 秒。随后用无血清 RPMI 培养基充满离心管，以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL PBS 中。使用血细胞计数板和显微镜，通过台盼蓝排斥法进行细胞计数。</li>
	<li>以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 PBS 中，调整细胞浓度至 1 × 108 个细胞/mL。</li>
</ol>
3. 人外周血单个核细胞经眶后注射入小鼠21
<ol>
	<li>将麻醉室置于层流罩内以维持无菌环境。用5%异氟烷和1 L/min的氧气流速预充麻醉室5分钟。</li>
	<li>将异氟烷浓度降至2%，并将同一只笼子中的小鼠放入麻醉室。待小鼠失去翻正反射后，在麻醉室内继续麻醉5分钟。在此期间，用注射器预先抽取100 µL细胞悬液（含1 × 107个细胞）。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上，鼻部插入鼻罩以维持麻醉状态。通过轻捏足垫并观察是否无反射反应来确认意识丧失。</li>
	<li>用拇指和中指固定小鼠。将28 G 1/2英寸针头斜面向下，从内眦外侧穿过结膜膜，直至抵达眼球后方。稍回撤针头，缓慢注入100 μL细胞悬液（含1 × 107个细胞）。</li>
	<li>完全撤出针头，并妥善处理注射器和针头。闭合眼睑，用纱布轻轻按压注射部位。</li>
	<li>检查注射部位是否有肿胀或其他可见损伤。让小鼠在铺有纸巾的无菌笼中恢复意识，以防止在转移至饲养笼前吸入垫料。&#160;待出血停止后，向眼部滴加一滴丙帕他卡因以缓解疼痛。 
	注意：根据Macholz等人的描述22，尾静脉注射是本方案中PBMC静脉注射的替代方法。</li>
</ol>
4. 小鼠急性移植物抗宿主病的临床评分（图1）23
<ol>
	<li>每隔一天测量一次移植物抗宿主病（GVHD）评分，直到小鼠评分为2分，之后每天测量一次，直至安乐死当天。
	<ol>
		<li>将笼子放入超净工作台，移除食物和水，盖上笼盖。观察小鼠5分钟，评估其活动能力并评分：0分 = 小鼠数分钟内开始行走并在笼内持续活动；1分 = 小鼠超过数分钟才起身，且在笼内行走缓慢；2分 = 小鼠在5分钟内不起身，仅在受到触碰时才行走。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每只小鼠放入玻璃烧杯中称重，并给予体重减轻评分：0分 = 体重变化&#60;10%；1分 = 体重变化10–25%；2分 = 体重变化&#62;25%。</li>
	<li>小鼠仍在烧杯中时，检查其姿势：0分 = 正常；1分 = 静息时呈弓背状；2分 = 弓背影响活动能力；毛发质地：0分 = 正常；1分 = 轻度至中度毛发蓬乱；2分 = 严重毛发蓬乱；以及皮肤完整性：0分 = 正常；1分 = 足垫或尾部出现脱屑；2分 = 明显的皮肤裸露区域（需检查耳朵、尾巴和足垫是否有脱屑）。</li>
	<li>共五个评分类别，每类评分范围为0–2分，因此小鼠最高评分为10分。当小鼠评分达到7分或以上，或注射后达到42天时，采用CO2安乐死法或其他经本地机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方法实施安乐死。 
	注：为确保结果准确性，评分应由对处理分组设盲的研究人员进行24。此外，尽管多数IACUC方案推荐将体重减轻超过&#62;20%作为人道终点，但在提供额外依据的情况下，可获得IACUC对该方案的批准。</li>
</ol>
5. 收集安乐死小鼠的组织以提取基因组DNA并分离基因组DNA
<ol>
	<li>使用无菌外科器械解剖小鼠。从目标器官（如肺、肝或脾）上切下一小块约 3 mm × 0.5 mm 大小的组织。称量组织样本，并将组织放入无菌的 1.5 mL 离心管中。若需采集多个组织，每次切割不同器官之间须用乙醇清洗器械。</li>
	<li>将装有组织的离心管浸入液氮中速冻，直至液氮停止沸腾，随后于 -80 °C 冷冻过夜。解冻组织样本，并按照基因组 DNA（gDNA）提取试剂盒说明书进行裂解。</li>
	<li>根据试剂盒说明书提供的步骤提取基因组 DNA。务必记录每微升洗脱的 gDNA 所对应的组织处理量（mg/μL）。 
	注意：冷冻组织可长期保存于 -80 °C，待后续实验时再行处理。</li>
</ol>
6. 使用数字PCR对人体T细胞进行定量（图2）
<ol>
	<li>根据所用数字PCR仪的DNA结合染料操作规程配制数字PCR反应体系。使用以下针对人CD3ε基因组DNA（NCBI参考序列：NG_007383.1）的特异性引物：正向引物：AGGCTGCCTTAACTCCCAAG，反向引物：GCCCTACCAGCTGTGGAAAC。这些引物将扩增出一条105 bp的单一产物。 
	注意：在每个反应中加入0.5 μL的限制性内切酶（如HindIII），以消化基因组DNA。务必测试不同浓度的基因组DNA稀释液，以优化阳性与阴性液滴的分离效果。此外，部分浸润性T细胞可能是无致病性的调节性T细胞。这些细胞可通过使用针对调节性T细胞标志物的额外引物进行定量。</li>
	<li>按照以下条件进行数字PCR反应：热盖温度105 °C，95 °C预变性10 min（1个循环）；95 °C变性30 s（升温速率2 °C/s），55 °C退火1 min（升温速率2 °C/s），共40个循环；72 °C延伸10 min，最后12 °C保存。 
	注意：这些参数可能需要根据具体的数字PCR设备进行调整。</li>
	<li>使用分析软件获取数字PCR数据。采用以下公式将结果表示为每毫克组织中的拷贝数：（拷贝数/μL）×（反应中gDNA体积/μL）×（稀释倍数）/（组织质量/mg ÷ 总gDNA体积/μL）</li>
</ol>

<ol><li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li>
<li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+3+clinical+trial+of+steroids%2Fmycophenolate+mofetil+vs+steroids%2Fplacebo+as+therapy+for+acute+GVHD%3A+BMT+CTN+0802%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), quiz 3335 3221-3227 (2014).</li>
<li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li>
<li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use%2C+older+recipient+age%2C+and+use+of+unrelated+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li>
<li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li>
<li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical & Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li>
<li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+antimurine+xenogeneic+cytotoxic+response.+I.+Dependence+on+responder+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li>
<li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li>
<li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes%2C+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li>
<li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4%28%2B%29+or+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22T+Cells+Using+Immunodeficient+NOG+Mice.+American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li>
<li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li>
<li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li>
<li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68(2017).</li>
<li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+Technology+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li>
<li>Sykes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li>
<li>Vitale, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+to+evaluate+estrogen+receptor+gene+mutations+in+small+amounts+of+cell-free+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA.</a> Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).</li>
<li>Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+and+liquid+biopsy%3A+opportunities%2C+challenges%2C+and+recent+advances+in+detection+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies.</a> Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22LabAnimal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation%3A+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li>
<li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation%3A+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li>
<li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+T+cell+engraftment%2C+trafficking%2C+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD%2FSCID+beta2mnull+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li>
<li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein%3A+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22LabAnimal%22%5BJournal%5D)">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219(2012).</li>
<li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-%2F-+gammac-%2F-+double-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li>
<li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li>
<li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+graft-versus-host+disease%3A+advances+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li>
<li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease%3A+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中，即使使用不同供体的外周血单个核细胞（PBMC）进行注射，疾病进展通常也具有一致性，因此可将多个实验的数据合并分析。维持这种一致性的关键步骤包括正确的静脉注射技术、盲法操作以及一致的评分标准。Nervi 等人的一项研究25表明，与尾静脉注射相比，经眶后注射PBMC可实现更稳定的植入效果并引发更严重的GVHD。Leon-Rico 等人26也证实，与尾静脉注射相比，眶后注射在小鼠中可实现更稳定的造血干细胞植入。然而，如有必要，尾静脉注射也可作为xenoGVHD模型中的替代方法27,28,29。
通过增加实验动物数量，可以降低尾静脉注射结果变异性的相关问题。此外，对小鼠进行评分的人员必须对小鼠的处理情况保持盲态，以避免在评估活动能力或毛发质地等较为主观的指标时引入...

同种异体造血干细胞移植（HSCT）已成为治疗预后不良的血液系统恶性肿瘤（如白血病）患者的常规疗法。HSCT 的一个严重并发症是急性移植物抗宿主病（GVHD）。2012 年的一项研究报道，在接受同胞供者移植的 HSCT 患者中，有 39% 发生急性 GVHD，而在接受无关供者移植的患者中，这一比例为 59%1。急性 GVHD 是由供体来源的 T 细胞攻击受体器官所引起的。目前治疗 GVHD 唯一有效的方法是使用强效免疫抑制药物2，但这些药物具有高度毒性，会增加感染和肿瘤复发的风险。因此，尽管近年来在改善急性 GVHD 患者生存率方面已取得一定进展3,4,5，但仍迫切需要开发毒性更低、能够促进长期缓解的新型 GVHD 治疗方法。
以下方法的总体目标是诱导并评估异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）。xenoGVHD模型作为一种研究工具，可用于利用人源细胞而非鼠源细胞诱导急性GVHD，从而更直接地将临床前GVHD研究结果转化为临床试验6。该模型通过尾静脉向亚致死剂量照射的NOD-SCID IL-2Rγnull（NSG）小鼠体内注射人外周血单个核细胞（PBMC）。注入的人T细胞被呈递小鼠抗原的人抗原呈递细胞（APCs）激活，活化的T细胞迁移至远端组织，引发全身性炎症反应，最终导致动物死亡6,7,8,9,10。xenoGVHD模型中的疾病病理特征及进展过程与人类急性GVHD高度相似。具体而言，致病性人T细胞对小鼠主要组织相容性复合体（MHC）蛋白产生反应，这与人类GVHD中T细胞的同种异体反应性相似6,9。相较于另一种广泛应用的GVHD模型——小鼠MHC错配模型，xenoGVHD模型的主要优势在于允许在人源细胞上测试治疗手段，而非鼠源细胞。这使得所测试的产品无需任何修改即可直接应用于临床，因为这些产品原本就是针对人细胞设计的。近期，该模型已被用于评估人源抗IL-2抗体11、人胸腺调节性T细胞（Tregs）12以及人源间充质干细胞13作为治疗急性GVHD的潜在方案。从更广泛的角度来看，该模型还可作为体内抑制实验的平台，用于评估任何能够抑制人T细胞活性的药物或细胞类型。例如，Stockis等人14利用xenoGVHD模型研究了阻断整合素αVβ8对Treg在体内抑制功能的影响。 因此，xenoGVHD模型可在体内环境中揭示任何靶向T细胞疗法的作用机制。
本方案中描述的另一种方法是使用数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction, dPCR）在小鼠组织中检测人源T细胞。该方法的目的是提供一种工具，用于量化T细胞在靶组织中的迁移和增殖情况，从而评估在此模型中测试的免疫抑制疗法的有效性。dPCR是一种相对较新的核酸定量技术15。简而言之，将PCR反应体系分割成多个独立的分区，每个分区含有少量目标序列或不含目标序列。随后通过DNA嵌入染料或荧光标记的序列特异性探针对目标序列进行扩增和检测。dPCR基于阳性分区的比例和泊松统计学原理来计算目标序列的拷贝数15,16。与流式细胞术和组织学等其他替代方法相比，使用dPCR检测T细胞所需的组织量显著减少，并且可用于冷冻或固定保存的组织样本。dPCR无需标准曲线即可确定拷贝数，也不需要技术重复。与传统的定量PCR（qPCR）相比，这减少了dPCR所需的试剂和模板DNA用量16。dPCR通过将PCR反应分割为多个子反应，有效富集了目标分子17。因此，dPCR主要用于在大量非目标DNA背景中检测稀有目标序列。例如，dPCR已被用于检测牛奶中的细菌污染18、鉴定雌激素受体基因中的稀有突变19，以及检测患者血液中的循环肿瘤DNA20。在本方案中，dPCR作为一项高效工具，用于检测和定量异基因移植物抗宿主病（xenoGVHD）小鼠模型组织中的人源T细胞。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>VWR International</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>10 mL BD 真空采血管 — 绿色盖，含肝素钠</td><td>Becton Dickinson</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>250 &amp;micro;L Ranin 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>17001118</td><td>不得使用其他移液器或吸头进行液滴生成</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>VWR International</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>96 孔微滴数字 PCR 板</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ACK（氯化铵-氯化钾）溶血缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>可选</td></tr><tr><td>酒精擦拭巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>麻醉室</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-178</td><td>由动物设施提供</td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Parkland Scientific</td><td>PM1002</td><td>由动物设施提供</td></tr><tr><td>BD Vacutainer 安全锁式采血套装</td><td>Becton Dickinson</td><td>367281</td><td></td></tr><tr><td>用于 QX100/QX200 微滴生成仪的 DG8 微滴生成卡和垫圈</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>无 DNA 酶和 RNA 酶的分子级 H2O</td><td>Life Technologies</td><td>1811318</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级纯乙醇，200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>45001750</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936</td><td>由动物设施提供</td></tr><tr><td>液氮</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>小鼠辐照用 Pie 型鼠笼</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC 1</td><td>最多可容纳 11 只小鼠</td></tr><tr><td>Nexcare 柔性纸质胶带（又称 3M Micropore 外科胶带 / 3/4&quot;）</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>MidSci</td><td>A-1000</td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td>MidSci</td><td>A-200</td><td></td></tr><tr><td>可穿刺铝箔热封膜</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pipetaid Gilson Macroman 移液辅助器</td><td>Fisher Scientific</td><td>F110756</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite 多通道移液器 L8-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>不得使用其他移液器或吸头进行液滴生成</td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy 血液与组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 板</td><td>VWR International</td><td>89218-292</td><td></td></tr><tr><td>QX200 微滴数字 PCR 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td>包含微滴生成仪、微滴读取仪、笔记本电脑、软件及相关耗材，适用于 EvaGreen 或探针法数字 PCR 应用</td></tr><tr><td>用于 EvaGreen 的 QX200 微滴生成油</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen 超级预混液</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 和 DNase 的板封膜</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565491</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Advanced 1640 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布垫（2&quot; × 2&quot;，12 层）</td><td>Fisher Scientific</td><td>67522</td><td></td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>无菌储液槽</td><td>VWR International</td><td>89094-662</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600393-4</td><td></td></tr><tr><td>手术镊</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650914-4</td><td></td></tr></tbody></table>

异基因小鼠模型中移植物抗宿主病的诱导与评分及使用数字pcr定量小鼠组织中的人源t细胞

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

急性移植物抗宿主病（GVHD）是接受造血干细胞移植以治疗血液系统缺陷和恶性肿瘤的患者面临的重要限制因素。当供体T细胞将宿主组织识别为外来抗原并对宿主发起免疫应答时，便会发生急性GVHD。目前的治疗方法主要依赖具有毒性的免疫抑制药物，这会使患者易受感染并增加疾病复发风险。因此，目前正在进行持续研究，以开发能够有效靶向供体T细胞并减少副作用的急性GVHD治疗策略。大量临床前研究采用异种GVHD（xenoGVHD）小鼠模型，该模型可在体内系统中直接在人源细胞而非小鼠细胞上测试免疫抑制疗法。本实验方案详细说明了如何诱导xenoGVHD，以及如何实施盲法和标准化临床评分，以确保结果的一致性。此外，本方案还描述了如何使用数字PCR检测小鼠组织中的人源T细胞，从而可用于量化所测试疗法的有效性。xenoGVHD模型不仅为GVHD治疗提供了研究平台，也可用于评估任何能够抑制人源T细胞的疗法，这些疗法未来可能应用于多种炎症性疾病。

接受人外周血单个核细胞（PBMC）的亚致死剂量照射的8至12周龄NSG小鼠（两性均有），在注射后约第10天开始出现移植物抗宿主病（GVHD）的临床症状，而仅接受磷酸盐缓冲液（PBS）的阴性对照小鼠则未出现相关症状（图1A）。异种GVHD（XenoGVHD）小鼠的中位生存期为23.5天（图1B）。通过数字PCR检测，在接受人PBMC的小鼠肺和肝组织样本中可检测到CD3ε阳性的人源T细胞。注射PBS的小鼠组织样本作为对照（图2）。
<img alt="GVHD 病情进展与生存曲线；PBMC 与 PBS 治疗对比；50 天研究分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59107/59107fig1.jpg" data-altupdate...

本文介绍了一种在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中诱导并评估疾病发生的方法。xenoGVHD 提供了一种体内模型，用于研究人T细胞的免疫抑制作用。此外，我们还描述了如何利用数字PCR检测组织中的人T细胞，以此作为量化免疫抑制程度的工具。

异基因小鼠模型中移植物抗宿主病的诱导与评分及使用数字PCR定量小鼠组织中的人源T细胞

急性移植物抗宿主病（GVHD）是接受造血干细胞移植作为血液系统疾病治疗手段的患者面临的重要限制因素之一。

本方案概述了如何诱导异种移植物抗宿主病（xenoGVHD），以及如何实施盲法并标准化临床评分，以确保结果的一致性。xenoGVHD 模型提供了一种体内方法，用于测试针对人源而非鼠源 T 细胞的免疫抑制疗法，从而提高这些研究向临床应用的转化能力。本次实验操作将由本实验室的研究生 Amara Seng 演示。注射前一天，将8至12周龄的非肥胖糖尿病scid gamma或NSG小鼠放入无菌的派形笼中，使用铯-137源以150厘戈瑞的总剂量对小鼠进行照射，照射过程中缓慢旋转以确保受照均匀。随后，将小鼠转移至无菌生物安全柜中的洁净笼具内过夜。次日早晨，采集足量的健康人外周血，以每只小鼠分离1.1×10⁷个外周血单个核细胞（PBMC）为标准，用等体积含2%胎牛血清（FBS）的PBS稀释肝素抗凝血液。在50毫升锥形管中，将最多25毫升稀释后的血液小心地铺加到15毫升淋巴细胞分离密度梯度介质上，用于密度梯度离心。分离结束后，在界面处收集外周血单个核细胞（PBMC），并在新的50毫升锥形管中用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除上清液，并轻弹管壁以松解细胞沉淀。将PBMC重悬于10毫升新鲜PBS中，再次离心，随后重悬于5毫升新鲜PBS中进行计数。然后，通过最终一次离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于PBS中，浓度为每毫升含1 × 10⁸个PBMC。为将分离的人PBMC经眶后途径递送至小鼠眼内，取一支1毫升注射器（配备28号针头），吸取100微升细胞悬液。确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，用拇指和中指轻轻固定小鼠。将针头斜面朝下，从内眼角外侧经结膜膜插入，直至到达眼球后部。稍向后回撤针头，然后缓慢注入全部细胞体积。然后，完全回撤针头，妥善处理注射器和针头。闭合眼睑，并用纱布对注射部位施加轻柔压力。接着，检查注射部位是否有肿胀或其他可见损伤，并将小鼠置于铺有纸巾的无菌笼中，待其恢复意识并进行监测后，再将其转移至饲养笼中。为测量移植物抗宿主病（GVHD）评分，将小鼠笼盒放入超净工作台，并移除笼中的食物和水。为评估活动能力评分，观察小鼠行为5分钟。为获得体重减轻评分，将每只小鼠置于玻璃烧杯中称重。在小鼠仍置于烧杯中时，检查其姿势、毛发质地及皮肤完整性。在收获目标组织后，从器官上切取一块约3毫米×0.5毫米的组织，用天平称重。将称重后的组织转移至无菌的1.5毫升离心管中，并在液氮中速冻，随后于-80摄氏度保存过夜。第二天早晨，根据基因组DNA提取试剂盒的说明书，在裂解前将样品解冻。为通过数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction，dPCR）对人T细胞进行定量，按照所用数字PCR仪的DNA结合染料反应体系说明书，并使用针对人CD3ε基因组DNA的特异性引物，配制数字PCR反应体系。随后，在适当的反应条件下进行数字PCR反应。接受人外周血单个核细胞（PBMC）的亚致死剂量照射的8至12周龄NSG小鼠（两性均有），在注射后约第10天开始出现移植物抗宿主病（GVHD）的临床症状，而仅接受PBS处理的阴性对照小鼠则无此表现。发生异种GVHD的小鼠中位生存期为23.5天。通过数字PCR技术，可在接受人PBMC的小鼠肺和肝组织样本中检测到CD3ε阳性的人源T细胞。评分过程必须保持一致性，且进行小鼠评分的研究人员需对处理分组设盲。按照本方案操作后，可从安乐死的小鼠中采集血清，用于外周细胞因子表达分析；同时可从小鼠脾脏中收集免疫细胞，用于流式细胞术分析。

induction-scoring-graft-versus-host-disease-xenogeneic-murine-model

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在异种性鼠模型中的移植-无源疾病的诱导和评分,以及使用数字PCR对小鼠组织中人类T细胞的定量

小鼠骨髓移植是一种广泛使用的技术，用于研究调控人类移植物抗宿主病的免疫学机制。体内监测T细胞迁移模式的能力，使得能够对移植物抗宿主病过程中T细胞反应的发生与发展进行详细分析。...

移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

本视频展示了如何利用同种异体造血干细胞和可诱导移植物抗宿主病（GvHD）的脾源性异反应性T淋巴细胞，在经致死剂量照射的受体小鼠中诱导肠道移植物抗宿主病。该实验方案有助于建立严重的急性肠道GvHD模型，以深入理解该疾病的发病机制，并开发创新的治疗策略。...

通过同种异体骨髓与脾细胞移植在小鼠模型中诱导移植物抗宿主病

本视频展示了一种建立人源化异种移植小鼠模型的实验方法。将免疫缺陷小鼠注射环磷酰胺以耗竭其免疫细胞，随后将来源于患者的肿瘤细胞与人外周血单个核细胞（PBMCs）混合于水凝胶中，皮下注射至小鼠体内，从而形成含有T细胞浸润的肿瘤。...

一种构建人PBMC嵌合人源化异种移植小鼠模型的技术

在缺乏明确表型标志物的小鼠骨髓移植模型中，确定供体细胞植入情况具有挑战性。我们描述了一种定量分析雄性供体细胞在雌性移植受体小鼠中植入程度的方法。该方法适用于所有小鼠品系，可用于造血干细胞（HSC）功能的研究。...

利用定量实时 PCR 检测在竞争性小鼠骨髓移植模型中供体细胞的植入情况

免疫缺陷小鼠中的人类肿瘤异种移植模型是研究癌症生物学的有力工具。本文描述了从人肝细胞癌细胞或肿瘤组织片段建立皮下和肝内异种移植模型的具体实验方案。通过部分肝切除术诱导受体小鼠肝脏再生，可作为促进肝内移植瘤定植的有效策略。...

在免疫缺陷小鼠中建立人肝细胞癌皮下及肝内异种移植模型

本文介绍了一种通过每周腹腔注射经细胞因子转导的基质细胞系，在患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中产生外源性细胞因子的方法。该方法拓展了PDX模型的应用范围，并为在多种PDX模型中实现外源性细胞因子的瞬时或持续递送提供了选择。...

通过注射经细胞因子转导的基质细胞系在患者来源的异种移植瘤中表达外源性细胞因子

本文介绍了一种异基因造血干细胞移植方案，并可在原位对患有肠道移植物抗宿主病的活体小鼠远端结肠进行重复的微型内窥镜评估，以检测结肠炎症的存在、特征及其严重程度。...

活体小鼠肠道移植物抗宿主病的诱导及其微型内镜评估

我们描述了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的人源化异种移植小鼠模型，用于转化性肿瘤免疫学研究。该方案可作为建立和表征类似模型以评估免疫肿瘤学疗法的通用指南。...

用于转化性肿瘤免疫学（I-O）研究的人源外周血单个核细胞（PBMC）移植人源化异种移植模型

移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。...

用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台

本文介绍了一种用于在小鼠肿瘤模型中表征肿瘤固有及外周来源的肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤移植方案。通过流式细胞术特异性追踪受体来源免疫细胞的浸润，可揭示这些细胞在抗肿瘤免疫应答过程中表型与功能变化的动力学特征。...

小鼠肿瘤浸润性CD8+ T细胞动态评估的肿瘤移植方法

本方案描述了如何将人皮肤移植到非肥胖型糖尿病（NOD）-scid...

异种移植皮肤模型用于调控人类免疫反应 体内

学习在NSG小鼠中诱导异种移植物抗宿主病(xenoGVHD)并进行标准化评分的方法。使用数字PCR定量检测小鼠组织中的人类T细胞，为免疫抑制疗法的临床转化研究提供可靠的体内模型。

异基因小鼠模型中移植物抗宿主病的诱导与评分及使用数字PCR定量小鼠组织中的人源T细胞

探索更多视频