Name: 培养细胞功能化纳米化对跨 golgi 网络的内分泌吸收和逆行迁移分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 了解利用功能化纳米抗体在HeLa细胞中分析蛋白质从高尔基体逆行转运至细胞表面的生化方法。该技术通过硫酸化修饰评估报告复合物到达反式高尔基网络的动态过程，为研究膜稳态机制提供有效工具。

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本工作由瑞士国家科学基金会资助（项目编号 31003A-162643）。我们感谢Nicole Beuret以及巴塞尔大学生物中心成像核心设施（IMCF）提供的支持。

1. 利用功能化纳米抗体进行细菌转化
注意：本方案已针对功能化抗GFP纳米抗体的表达、纯化和分析进行了优化，如先前所述30。若与其他蛋白部分进行衍生化，可能需要对该标准方案进行修改。
<ol>
	<li>将适用于蛋白表达的化学感受态细菌（约 100 µL）置于冰上融化（例如 Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) 细胞）。 
	注意：根据实验室常规操作制备化学感受态细菌细胞。或者，也可直接购买商业化的化学感受态细菌细胞。</li>
	<li>加入 50 ng 编码功能化纳米抗体的质粒。为在细菌表达过程中实现纳米抗体报告分子的充分位点特异性生物素化，还需额外加入三倍过量（150 ng）编码生物素连接酶 BirA 的细菌表达质粒（质粒信息参见 表 1）。用移液器轻柔吹打混匀。 
	注意：若无需进行纳米抗体生物素化，或纳米抗体报告分子不含生物素受体肽（BAP），则无需共转化编码 BirA 的质粒。</li>
	<li>将细菌细胞在冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>将细菌细胞置于 42 °C 水浴或加热块中 1 分钟，进行热激处理。</li>
	<li>加入 1 mL 室温（RT）的 LB 培养基（Luria broth），并将转化后的细菌在恒温振荡器中于 37 °C 孵育 1 小时，以实现抗性基因的表型表达。配制 1 L LB 培养基的方法：称取 5 g 酵母提取物、10 g 胰蛋白胨和 10 g NaCl，加水定容后高压灭菌。若功能化纳米抗体已亚克隆至含氨苄青霉素/羧苄青霉素抗性的表达载体中，则可省略步骤 1.5。</li>
	<li>在 11,000 x g 离心 1 分钟收集菌体，并用 100 µL 新鲜 LB 培养基重悬菌体。</li>
	<li>将重悬的菌液涂布于含有相应抗生素的 LB 平板上（例如，当细菌如上文步骤 1.2 所述共转化了纳米抗体报告分子和 BirA 时，使用含 50 µg/mL 卡那霉素和 50 µg/mL 羧苄青霉素的 LB 平板）。</li>
	<li>将 LB 平板置于 37 °C 培养箱中过夜（O/N）培养。 
	注意：可在本步骤暂停实验流程，将长出菌落的 LB 平板密封于 4 °C 保存。建议使用封口膜（parafilm）密封 LB 平板。</li>
</ol>
2. 细菌液体培养及功能化纳米抗体表达的诱导
<ol>
	<li>从平板上挑取含有目标质粒的细菌单菌落，接种于含有20 mL添加抗生素的LB培养基的锥形瓶中，在37 °C摇床培养箱中过夜培养（关于筛选抗生素的说明，另见步骤1.7）。</li>
	<li>次日，将已培养的20 mL菌液转接至含有1 L添加筛选抗生素的LB培养基的锥形瓶中。</li>
	<li>继续在37 °C培养细菌至OD600达到0.6–0.7。在诱导蛋白表达前，使菌液冷却至室温。</li>
	<li>通过加入1 mL 1 M异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG），使诱导剂终浓度达到1 mM（1:1,000稀释），以诱导功能化纳米抗体和BirA蛋白的表达。同时加入10 mL 20 mM d-生物素储备液，使培养基中d-生物素终浓度为200 µM，以实现功能化纳米抗体中BAP表位的生物素化（质粒信息另见表1）。 
	注意：d-生物素储备液用ddH2O配制，并通过逐滴加入500 mM NaH2PO4助溶。或者，d-生物素也可溶于DMSO中。若要表达与APEX2融合的纳米抗体（VHH-APEX2），LB培养基还需额外补充1 mM 5-氨基乙酰丙酸（dALA）盐酸盐，以促进血红素的插入。dALA以100 mM储备液形式用ddH2O配制。</li>
	<li>将加入IPTG后的1 L菌液在30 °C继续培养4小时（适用于VHH-2xTS），或在20 °C或室温过夜培养（适用于VHH-APEX2），或在16 °C过夜培养（适用于VHH-mCherry）（质粒信息另见表1）。 
	注意：新构建的纳米抗体表达条件需由实验人员自行优化。</li>
	<li>将菌液从锥形瓶转移至1 L离心瓶中，在4 °C、5,000 × g条件下离心45分钟收集菌体。弃去上清液，继续进行纯化步骤。 
	注意：此时可将菌体沉淀长期保存于-80 °C，暂停实验流程。VHH-APEX2或VHH-mCherry的菌体沉淀通常分别为棕褐色（因含有插入的血红素）或粉红色。</li>
</ol>
3. 功能化纳米抗体的纯化
<ol>
	<li>如有需要，将冷冻的细菌沉淀置于冰上解冻（另见步骤 2.6）。</li>
	<li>向细菌细胞沉淀中加入 30 mL 冰冷的结合缓冲液（含 20 mM 咪唑的 1× PBS），通过反复吹打重悬菌体。将重悬后的细菌转移至已标记的 50 mL 离心管中。</li>
	<li>在 30 mL 结合缓冲液中加入 200 µg/mL 溶菌酶、20 µg/mL DNase I、1 mM MgCl2 和 1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），先在室温下孵育 10 分钟，然后在 4 °C 下于翻转摇床中孵育 1 小时。</li>
	<li>在 50 mL 离心管中使用探头式超声仪对细菌细胞进行机械裂解。以持续 3 次、每次 1 分钟的超声脉冲处理，每次之间间隔 1 分钟冰上冷却。</li>
	<li>将细菌裂解液在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 45 分钟，以沉淀细胞碎片和完整细胞。将超声处理后的细菌裂解液转移至合适的离心瓶用于离心，或分装至多个 5 mL 离心管中进行台式离心。</li>
	<li>将上清液转移至新的 50 mL 离心管中，并弃去沉淀的碎片。</li>
	<li>在准备固定化金属亲和层析（IMAC）纯化的同时，将澄清的裂解液置于冰上保存。为分离带有组氨酸标签的功能化纳米抗体，可使用一次性 His 柱（见材料表），实现快速简便的重力流纯化。 
	注意：也可选择使用批量纯化方法替代商用层析柱。</li>
	<li>将 His 柱固定于金属支架上。
	<ol>
		<li>排尽层析柱的保存液，并用 10 mL 结合缓冲液（含 20 mM 咪唑的 1× PBS）对 His 柱进行平衡。</li>
		<li>通过重力流排空（流出液可弃去）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将澄清的细菌裂解液（约 30 mL）缓慢加载到层析柱上。通过重力流排空（流出液可弃去）。</li>
	<li>用 10 mL 结合缓冲液（含 20 mM 咪唑的 1× PBS）洗涤 His 柱两次，每次 10 mL。</li>
	<li>用 2 mL 洗脱缓冲液（含 500 mM 咪唑的 1× PBS）将纳米抗体洗脱至 2 mL 离心管中，并进行缓冲液置换。</li>
	<li>缓冲液置换。
	<ol>
		<li>将脱盐柱（见材料表）置于 50 mL 管用柱适配器中，用 5 mL 1× PBS 重复平衡 5 次。</li>
		<li>让缓冲液完全进入填料床，弃去流出液。</li>
		<li>第五次 PBS 平衡后，在 1,000 × g 下离心 2 分钟。</li>
		<li>弃去流出液。</li>
		<li>将柱与适配器一起放置于新的 50 mL 离心管上。将 2 mL 洗脱得到的功能化纳米抗体（来自步骤 3.11）加载至已用 PBS 平衡的脱盐柱上，在 1,000 × g 下离心 2 分钟，并收集洗脱液。 
		注意：除商用脱盐柱外，也可采用透析法进行缓冲液成分置换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商说明书，使用二辛可宁酸（BCA）法或 Bradford 法测定洗脱液中蛋白（纳米抗体）的浓度。 
	注意：对于 GFP 报告细胞系的纳米抗体摄取实验，2–10 mg/mL 的储存浓度为最佳。</li>
</ol>
4. 功能化纳米抗体表达的验证（考马斯亮蓝染色）
<ol>
	<li>根据标准方案制备10-12.5%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶。 
	注意：也可使用市售的预制梯度凝胶。</li>
	<li>用移液器将20 µg纯化的功能化纳米抗体加入1.5 mL离心管中，在95 °C的上样缓冲液中煮沸5分钟。 
	注意：例如，将10 µL浓度为2 mg/mL的纳米抗体储备液加入1.5 mL离心管中，再加入10 µL 2x上样缓冲液。若体积过小，可在加入上样缓冲液前用PBS进一步稀释纳米抗体。</li>
	<li>将经上样缓冲液煮沸处理的纯化纳米抗体上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶，按照标准PAGE方案电泳，直至示踪染料（如溴酚蓝）迁移至分离胶底部，随后进行考马斯亮蓝染色和脱色。</li>
	<li>考马斯亮蓝凝胶染色与脱色。
	<ol>
		<li>将凝胶从玻璃板中取出，浸入考马斯亮蓝染色液（将5%的10 g/L考马斯亮蓝储备液溶于含10%乙酸和45%甲醇的ddH2O中）中，在室温下于摇床上染色20-30分钟，确保染色液完全覆盖凝胶。</li>
		<li>用脱色液（含7.5%乙酸和15%甲醇的ddH2O）在室温下脱色2-3次，每次1小时，之后将凝胶过夜放置以进一步脱色。 
		注意：可在凝胶周围放置厨房用纸巾，有效吸除多余的考马斯亮蓝染料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用合适的成像仪或相机对凝胶进行成像。 
	注意：可通过针对其表位的抗体进行免疫印迹分析，进一步验证纳米抗体的表达（另见图1A）。</li>
</ol>
5. 培养细胞对功能化纳米抗体的摄取用于荧光染色
<ol>
	<li>在细胞培养超净台中，将约400,000至500,000个稳定表达GFP标记报告蛋白的HeLa细胞接种于35 mm培养皿或6孔板中的18 mm玻璃盖玻片（No. 1.5H）上，使用含抗生素的完全培养基（DMEM培养基，补充10%胎牛血清（FCS）、100单位/mL链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1.5 µg/mL嘌呤霉素）。 
	注意：此处以表达EGFP-Calnexin、EGFP-CDMPR和TfR-EGFP的HeLa细胞为例进行说明。除稳定转染细胞系外，也可使用瞬时转染的HeLa细胞。此步骤中，稳定细胞系可与未转导的亲本HeLa细胞共培养，以便进行直接比较。</li>
	<li>将细胞在37 °C、7.5% CO2培养箱中孵育过夜，使其增殖。 
	注意：次日细胞融合度应约为80%。</li>
	<li>将2 µL浓度为2 mg/mL的纳米抗体储备液加入含有2 mL完全培养基的15 mL或50 mL离心管中（该体积足以覆盖一个35 mm培养皿或6孔板中的一个孔；若需处理更多培养皿或孔板，请按比例调整培养基和纳米抗体的体积）。 
	注意：为便于说明，此处使用VHH-mCherry，因其无需额外抗体染色即可观察纳米抗体被EGFP报告蛋白内吞的情况（见图2C）。</li>
	<li>移除细胞培养基，并为每个35 mm培养皿或6孔板单位加入2 mL预热的完全培养基，其中含2 µg/mL功能化纳米抗体。</li>
	<li>在37 °C、7.5% CO2培养箱中孵育1小时，使细胞通过报告蛋白介导内吞纳米抗体。 
	注意：根据实验设计不同，纳米抗体内吞时间需相应调整。本实验所示条件下，1小时足以使EGFP-CDMPR和TfR-EGFP介导的纳米抗体内吞达到稳态。</li>
	<li>移除培养基，并在室温下用1 mL 1×PBS洗涤细胞2–3次。</li>
	<li>在室温下用1 mL 3%多聚甲醛（PFA）固定细胞10分钟。</li>
	<li>移除PFA溶液，并在室温下用1 mL含50 mM NH4Cl的1×PBS淬灭残留固定剂5分钟。 
	注意：3% PFA应作为固定剂废弃物单独处理。</li>
	<li>在室温下用1 mL 1×PBS洗涤细胞3次。</li>
	<li>在室温下用1 mL含0.1% Triton X-100的1×PBS对细胞进行透化处理10分钟。 
	注意：尽管本实验无需透化步骤，但后续若将细胞封片于封片剂中，EGFP和mCherry的荧光效果更佳。</li>
	<li>在室温下用1 mL 1×PBS洗涤细胞3次。</li>
	<li>用镊子将盖玻片置于滴加于载玻片上的液滴（约100 µL）中，该液滴为含5 µg/mL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的1% BSA/PBS溶液，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将盖玻片放回培养皿/孔中，并在室温下用1 mL 1×PBS洗涤3次。</li>
	<li>标记载玻片，使用Fluoromount-G封片剂封片。避光静置3–4小时使封片剂固化，并将载玻片置于4 °C避光保存。</li>
	<li>使用合适的显微镜（例如点扫描共聚焦直立显微镜）观察染色模式。</li>
</ol>
6. 培养细胞对功能化纳米抗体的摄取（用于硫酸化分析）
<ol>
	<li>在细胞培养超净台中，将约 400,000 至 500,000 个稳定表达 GFP 标记报告蛋白的 HeLa 细胞接种于 35 mm 培养皿或 6 孔板中，使用含抗生素的完全培养基（DMEM 培养基，补充 10% 胎牛血清（FCS）、100 单位/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和 1.5 µg/mL 嘌呤霉素）。 
	注意： 如上所述，本文以稳定表达 EGFP-Calnexin、EGFP-CDMPR 和 TfR-EGFP 的 HeLa 细胞为例进行说明。除稳定细胞系外，也可使用瞬时转染的 HeLa 细胞。</li>
	<li>将细胞在 37 °C、7.5% CO2 培养箱中孵育过夜，使其增殖。 
	注意： 次日细胞融合度应约为 80%。</li>
	<li>弃去完全培养基，用室温 1× PBS 洗涤 2 次，并在 37 °C、7.5% CO2 培养箱中用无硫酸盐培养基（SFM）饥饿细胞 1 小时。 
	注意： SFM 的配制方法为：向 500 mL Eagle 平衡盐溶液中加入 10 mL MEM 氨基酸（50×）溶液、5 mL L-谷氨酰胺（200 mM）、5 mL 维生素溶液（100×）和 900 µL CaCl2·2H2O。经 0.22 µm 滤器过滤后分装。</li>
	<li>在专用于放射性操作的通风橱或工作台中，配制含 0.5 mCi/mL [35S]硫酸盐（钠盐形式）的硫酸盐标记培养基（SFM）。 
	注意： 所有含放射性物质的溶液均需小心操作，仅可在指定通风橱或工作台中进行。所有接触放射性物质的耗材（枪头、离心管、培养板等）或洗涤缓冲液均需单独收集并处理。此要求适用于后续所有步骤（步骤 6.5–6.20）。</li>
	<li>将 VHH-2xTS 溶于 1× PBS 中，加入硫酸盐标记培养基，使其终浓度为 2 µg/mL。 
	注意： 作为对照，应同时设置 VHH-std 或其他不含酪氨酸硫酸化位点（TS 位点）的纳米抗体，以验证标记的特异性。</li>
	<li>弃去 SFM，加入 0.7 mL 含 0.5 mCi/mL [35S]硫酸盐和 2 µg/mL VHH-2xTS 的硫酸盐标记培养基，在专用于放射性操作的 37 °C、7.5% CO2 培养箱中孵育细胞 1 小时。 
	注意： 根据实验设计，纳米抗体硫酸化时间需相应调整。此外，为测定反式高尔基网络（TGN）到达动力学，可进行不同时间点的标记（例如 10 分钟、20 分钟、30 分钟等）。</li>
	<li>弃去标记培养基，用预冷的 1× PBS 在冰上或冷却板上洗涤细胞 2–3 次。</li>
	<li>加入 1 mL 裂解缓冲液（含 1% Triton X-100 和 0.5% 脱氧胆酸钠的 PBS），并加入 2 mM PMSF 和 1× 蛋白酶抑制剂混合物，在 4 °C 摇床上孵育 10–15 分钟。</li>
	<li>刮取细胞并转移至 1.5 mL 离心管中，涡旋混匀后，在 4 °C 条件下置于翻转混匀仪上孵育 10–15 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 10 分钟，制备去核裂解液。</li>
	<li>取新的 1.5 mL 离心管，加入 20–30 µL 镍柱填料（Ni-NTA beads）悬液，并用 1× PBS 轻柔离心（1,000 × g，1 分钟）洗涤一次。 
	注意： 除镍柱填料外，也可使用链霉亲和素磁珠（若纳米抗体经生物素标记）或蛋白 A 磁珠（结合针对纳米抗体表位（如 T7 或 HA 标签）的 IgG 抗体）。</li>
	<li>将去核裂解液转移至含镍柱填料的 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 翻转混匀仪上孵育 1 小时，以富集纳米抗体。同时取部分去核裂解液（50–100 µL）加入 SDS 上样缓冲液，煮沸，用于后续总细胞相关纳米抗体、GFP 报告蛋白及上样对照的免疫印迹分析。</li>
	<li>用 1× PBS 或裂解缓冲液洗涤磁珠 3 次，每次以 1,000 × g 轻柔离心 1 分钟。 
	注意： 若需更严格的洗涤条件，可在 PBS 或裂解缓冲液中加入 20 mM 咪唑。</li>
	<li>小心弃去所有洗涤液，加入 50 µL 2× 上样缓冲液，95 °C 煮沸 5 分钟。</li>
	<li>将煮沸后的样品上样至 midi 规格 12.5% SDS-PAGE 胶，按标准 PAGE 方法电泳，直至示踪染料（如溴酚蓝）迁移至分离胶底部。 
	注意： 总细胞相关纳米抗体、GFP 报告蛋白及上样对照的免疫印迹分析也可使用 mini 规格 12.5% SDS-PAGE 胶或预制梯度胶进行。</li>
	<li>将分离胶置于约 30 mL 固定液（ddH2O 中含 10% 乙酸和 45% 甲醇）中，室温固定 1 小时，随后用去离子水洗涤 3 次，每次约 50 mL，然后准备进行凝胶干燥。</li>
	<li>SDS-PAGE 凝胶干燥。
	<ol>
		<li>将固定后的凝胶小心置于拉伸的保鲜膜上，并覆盖预先裁剪的滤纸。</li>
		<li>将凝胶连同滤纸面朝下放置于干燥平台上，盖上真空盖，开启真空泵进行干燥，持续 3–5 小时。</li>
		<li>取下保鲜膜，将干燥后的凝胶放入配备磷屏的放射自显影暗盒中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用磷屏成像仪进行放射自显影成像，具体操作请遵循仪器制造商的说明。 
	注意： 根据信号强度，干燥凝胶在磷屏上需进行更长时间的曝光。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

纳米抗体是一类新兴的蛋白质结合支架，相较于传统抗体具有诸多优势：分子量小、稳定性高、呈单体形式、可筛选出高亲和力的克隆，且不含二硫键33,35,44,45。它们已被广泛应用于多种研究场景，例如在发育生物学的细胞培养系统和模式生物中46,47,48,49，作为结构生物学中稳定构象状态的结晶伴侣50,51,52,<sup cla...

蛋白质和脂质从细胞表面逆向运输至各种细胞内区室，对于维持膜稳态、平衡分泌过程以及回收顺向运输机制的组分至关重要1,2通过网格蛋白依赖性或非依赖性内吞作用内化后，蛋白质和脂质货物首先到达早期内体，随后被进一步分选至内体-溶酶体系统、循环返回质膜，或靶向转运至反式高尔基网络（TGN）。从早期内体和/或细胞表面向TGN的循环转运，是多种顺向跨膜货物受体功能循环的一部分，例如依赖阳离子的和非依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CDMPR和CIMPR），它们负责将新合成的溶酶体水解酶从TGN转运至晚期内体和溶酶体3,4,5，sortilin 和 SorLA6,7以及Wntless（WLS）将Wnt配体转运至细胞表面8,9,10,11其他被回收至反式高尔基网络的蛋白质包括TGN46及其相关同工型12,13,14，SNAREs（可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感型融合因子附着受体）15,16,17，淀粉样前体蛋白（APP）18,19进行性钙化性关节强直（ANK）蛋白20，金属转运蛋白如ATP7A/B或DMT121,22以及跨膜加工酶，包括羧肽酶D、furin或BACE123,24,25除了这些内源性蛋白外，细菌和植物毒素（如志贺毒素和霍乱毒素、蓖麻毒素和相思子毒素）也会劫持逆向运输机制，逆行转运至内质网，进而反向转位至细胞质26,27,28,29.
为了直接分析逆向运输过程，我们此前开发了一种基于纳米抗体的工具包，用于标记并追踪从细胞表面到细胞内区室的货物蛋白30。纳米抗体是一类新型的蛋白质结合分子，来源于天然存在于骆驼科动物和软骨鱼类中的同源二聚体仅重链抗体（hcAbs）31,32。它们构成了hcAbs的重链可变区（VHH），相较于传统抗体（如IgG）具有多种优势：单体结构、分子量小（约15 kDa）、高度可溶、不含二硫键、可在细菌中表达，并且能够筛选出高亲和力结合的克隆33,34,35,36。为了使我们的纳米抗体工具具有广泛的适用性和通用性，我们采用了功能化的抗GFP纳米抗体，对在其胞外/管腔结构域带有GFP标签的蛋白进行细胞表面标记与追踪。通过将纳米抗体偶联mCherry、抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2）37或酪氨酸硫酸化（TS）序列，可利用固定细胞成像、活细胞成像、电子显微镜或生化方法分析真实跨膜货物蛋白的逆向运输过程。由于酪氨酸硫酸化修饰由酪氨酸蛋白硫酸转移酶（TPST1和TPST2）介导，且该修饰仅发生在反式高尔基体/反式高尔基网络（trans-Golgi/TGN），因此我们可以直接研究目标蛋白从细胞表面至该细胞内高尔基区室的运输过程及其动力学特征38,39,40。
在本方法学文章中，我们描述了功能性纳米抗体（VHH-2xTS、-APEX2、-mCherry及其衍生物）的简便制备方法，这些纳米抗体适用于多种应用，可用于分析哺乳动物细胞中的逆行运输过程30。我们主要聚焦于利用TS位点修饰的纳米抗体，研究从细胞表面至硫酸化区室的细胞内运输过程。

<table><tbody><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>产品由Sigma-Aldrich经销，但由Roche生产</td></tr><tr><td>抗His6抗体</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>抗肌动蛋白抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗鼠HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>溶于1× PBS/1% BSA</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Applichem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>溶于无菌500 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;或DMSO</td></tr><tr><td>5-氨基乙酰丙酸盐酸盐（dALA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>溶于无菌水</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>溶于无菌水</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>产品由Sigma-Aldrich经销，但由Roche生产</td></tr><tr><td>布雷菲德菌素A（BFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5936</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s改良Eagle&amp;rsquo;s培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>硫-35（以硫酸钠形式）</td><td>Hartmann Analytics</td><td>ARS0105</td><td>产品含5 mCi</td></tr><tr><td>Earle's平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6267</td><td></td></tr><tr><td>MEM氨基酸溶液（50×）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>MEM维生素溶液（100×）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>产品由Sigma-Aldrich经销，但由Roche生产</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>溶于无菌水，储存液为1 M</td></tr><tr><td>羧苄青霉素二钠盐</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>溶于无菌水，储存液为100 mg/mL</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>溶于无菌水，储存液为100 mg/mL</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝R（Brilliant Blue）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Applichem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose High Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>His GraviTrap层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0033-99</td><td></td></tr><tr><td>His缓冲液试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0034-00</td><td></td></tr><tr><td>一次性PD10脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX凝胶，4–20%，15孔</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的Dulbecco&amp;rsquo;s磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35 mm培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>TPP</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（No. 1.5H）</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>溶于40% DMSO和60%异丙醇，储存液为500 mM</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>溶于无菌水，储存液为1 M</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>溶于无菌水，储存液为1 M</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>溶于无菌水，储存液为5 M</td></tr></tbody></table>

利用功能化纳米抗体在培养细胞中分析内吞摄取及逆行转运至反式高尔基网络

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

蛋白质和膜从细胞表面向高尔基体及更远区域的运输对于维持细胞稳态、细胞器特性及生理功能至关重要。为了研究逆向蛋白质运输，我们近期开发了一套多功能的基于纳米抗体的工具包，可用于通过固定细胞和活细胞成像、电子显微镜或生物化学方法，分析从细胞表面到高尔基体复合物的运输过程。我们构建了功能化的抗绿色荧光蛋白（GFP）纳米抗体——一种小分子、单体、高亲和力的蛋白质结合物——可应用于表达带有胞外GFP片段的膜蛋白的目标细胞系。这些衍生化的纳米抗体与GFP报告分子结合后，能够特异性地被内化，并沿着报告分子的分选路径“搭便车”进行运输。纳米抗体可通过标记荧光染料，用于荧光显微镜和活体成像追踪逆向运输过程；通过偶联抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2），用于电子显微镜下研究报告分子-纳米抗体复合物的超微结构定位；或通过引入酪氨酸硫酸化（TS）基序，用于评估其到达反式高尔基网络（TGN）的动力学过程。在本方法学文章中，我们概述了在细菌中表达和纯化功能化纳米抗体的一般流程。我们以mCherry标记和TS修饰的纳米抗体为例，展示了该工具在分析内吞摄取及货物蛋白到达TGN过程中的强大应用。

为了研究蛋白质逆行运输至各种细胞内目的地的过程，我们近期建立了一种基于抗GFP纳米抗体的工具，用于标记并追踪从细胞表面开始的重组融合蛋白30。本文中，我们展示了此类修饰型纳米抗体的细菌表达生产方法，并演示了其在荧光显微镜和免疫印迹分析中用于研究内吞摄取的应用，以及通过硫酸化分析来检测其是否到达反式高尔基网络（TGN）的方法。后者是本实验方案的方法学重点。
我们通过标准分子克隆技术构建了一套具有共同特征但功能各异的抗GFP纳米抗体工具箱30。其中最简单的（标准型）纳米抗体VHH-std包含VHH结构域、用于后续特异性抗体检测的T7和HA表位、用于纯化的C端六组氨酸（His6）标签，以及一段生物素受体肽（BAP）序列，可用于生物素化及高亲和力链霉亲和素下拉实验（图1A）。通过对VHH-std进行衍生化改...

蛋白质从细胞表面逆行运输至高尔基体对于维持膜稳态至关重要。本文介绍一种利用功能化纳米抗体在HeLa细胞中对重组蛋白从细胞表面到高尔基体的运输进行生化分析的方法。

从细胞表面到高尔基体及更远位置的蛋白质和膜运输对于维持细胞稳态、细胞器特性及生理功能至关重要。为了……

该方法可实现细菌表达的功能化纳米抗体的制备与应用，用于分析蛋白质从细胞表面向细胞内区室（特别是反式高尔基体网络）的逆向转运过程。该技术的主要优势在于利用硫酸化修饰——一种高度特异、具有区室化特征且灵敏的翻译后修饰，以评估报告纳米抗体复合物是否到达DTN区室。该方法结合其他经修饰的纳米抗体，可用于活细胞成像和电子显微镜研究，进一步探索与疾病相关的细胞表面受体的内吞过程。我们所构建的功能化纳米抗体工具组已被设计用于研究培养细胞中的逆向转运过程，但这些工具亦可应用于多细胞生物体中。开始本实验时，从平板中挑选含有目标质粒的细菌单克隆，接种至含有20毫升LB培养基（添加抗生素）的锥形瓶中。在37°C下过夜培养

analysis-endocytic-uptake-retrograde-transport-to-trans-golgi-network

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

本视频展示了一种研究功能化纳米抗体摄取及其逆行运输的方法，以了解其细胞内转运途径。通过引入放射性标记的硫酸盐，并结合分离与检测技术，该方法可用于研究货物蛋白的内吞摄取及其向反式高尔基网络的运输过程。...

利用功能化纳米抗体监测GFP标记的膜蛋白到达反式高尔基体网络的过程

膜运输涉及蛋白质从质膜向细胞内部的转运即...

基于细胞的L-谷胱甘肽保护法检测质膜蛋白的内吞与再循环

我们描述了一种利用特异性多克隆抗体标记活神经元表面蛋白的方法，该抗体针对细胞外表位。通过内吞作用被抗体结合并在细胞表面内化的蛋白，可与在孵育期间仍停留在表面或转运至表面的蛋白区分开来。...

活体培养神经元抗体孵育后细胞表面与内化蛋白的差异标记

本文介绍了纳米颗粒（NPs）的合成及其荧光标记方法。这些纳米颗粒被用于脉冲-追踪实验，以标记真核细胞的内体-溶酶体系统。通过活细胞成像并进行定量分析，追踪了胞内病原体Salmonella...

应用荧光纳米颗粒研究细胞内细菌对内体-溶酶体系统的重塑

受体转运可调节细胞对配体的信号转导及反应性，并且其自身也响应细胞内的各种条件，包括配体诱导的信号通路。本文中，我们介绍一种强大且灵活的技术，通过免疫标记和共定位分析，定量评估药物诱导的受体转运。...

通过共定位分析追踪药物诱导的受体内在化后转运变化

研究膜运输对于理解神经元功能至关重要。本文介绍一种用于量化神经元中囊泡运动性的方法。该方法简便易行，可适用于神经系统中膜运输的量化分析。...

使用荧光探针定量培养神经元中内体和溶酶体的运动性

本报告介绍了两种基于生物素标记的方法，用于测定在质膜上表达的蛋白质的细胞表面表达水平及其内吞速率。...

利用生物素标记法测定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达及内吞速率

我们描述了一种用于培养神经元中突触小泡（SV）循环的光学检测方法。将该方案与双重转染技术结合，可同时表达突触前标记物和目的蛋白，从而定位突触前位点及其突触小泡循环能力，并确定目的蛋白的作用。...

一种用于检测过表达突触前蛋白的培养神经元中突触小泡循环的光学检测方法

回收内体是内体管状网络的一部分。本文介绍一种利用GFP-STX13作为细胞器标记物来定量分析回收内体动态变化的方法。...

基于显微镜的检测方法用于通过SNARE运输研究和分析循环内体

蛋白质从质膜到反式高尔基网络的内吞和逆向运输对于维持膜稳态和调控信号传导至关重要。本文介绍一种利用衍生化抗GFP纳米抗体，通过活细胞显微镜在HeLa细胞中对跨膜货物蛋白的内吞运输进行成像和定量分析的方法。...

利用功能化纳米抗体对培养细胞进行内吞运输的活细胞成像

了解利用功能化纳米抗体在HeLa细胞中分析蛋白质从高尔基体逆行转运至细胞表面的生化方法。该技术通过硫酸化修饰评估报告复合物到达反式高尔基网络的动态过程，为研究膜稳态机制提供有效工具。

利用功能化纳米抗体在培养细胞中分析内吞摄取及逆行转运至反式高尔基网络

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