Name: 通过后染色方法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记RNA的荧光可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 了解使用TO1-Biotin后染色法在聚丙烯酰胺凝胶中对Mango标记RNA进行荧光可视化的快速灵敏技术。该方法简化了生物重要RNA及其复合物的追踪与纯化流程，为RNA相关疾病研究提供有力工具。

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作者感谢Razvan Cojocaru和Amir Abdolahzadeh提供的技术协助，以及Lena Dolgosheina对手稿的校对。本项目获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向P.J.U.提供的运营资助。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>TO1-生物素后染色溶液（凝胶染色溶液）
	<ol>
		<li>通过将342 mL的1 M Na2HPO4与158 mL的1 M NaH2PO4混合，配制1 L pH 7.2（25 °C）的1 M磷酸盐缓冲液。通过加入适量磷酸盐溶液，将pH调整至50 mM条件下的7.2。使用0.2 µm滤器进行无菌过滤，并将溶液储存于塑料器皿中，室温保存。</li>
		<li>按如下方法配制5x凝胶染色溶液（不含TO1-生物素）：将247.5 mL ddH2O、700 mL的1 M KCl、50 mL的1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）和2.5 mL Tween 20混合，定容至1 L。使用0.2 µm滤器进行无菌过滤，并将溶液储存于塑料器皿中。可室温保存。 
		注：如有需要，可向该溶液中添加MgCl2，因其可能有助于稳定RNA复合物。这将对荧光信号产生轻微影响2。</li>
		<li>使用步骤1.1.2中的5x凝胶染色溶液配制1x凝胶染色溶液，并在使用前立即加入TO1-生物素荧光染料（见材料表），使其终浓度为20 nM。例如，将20 mL的5x凝胶染色溶液加入80 mL去离子水中，制成100 mL的1x凝胶染色溶液，然后加入2 µL以二甲基甲酰胺配制的1 mM TO1-生物素储备液。 
		注：TO1-生物素染料在500 nm处的消光系数为63,000 M-1·cm-1，在染色溶液中测得1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>变性PAGE（2x变性凝胶上样溶液及溶液A、B、C、过硫酸铵和四甲基乙二胺）
	<ol>
		<li>通过混合40 mL甲酰胺、0.5 mL的0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8.0）和9.5 mL ddH2O，配制50 mL的2x变性凝胶上样溶液。该溶液可室温保存。此溶液中不添加上样染料，以免干扰荧光成像。</li>
		<li>按如下方法配制2x变性凝胶上样染料：在RNA和DNA寡核苷酸纯化过程中，向步骤1.2.1所述溶液中加入0.5 mL的2.5%（w/v）溴酚蓝（BB）和0.5 mL的2.5%（w/v）二甲苯青（XC），并将ddH2O的体积由9.5 mL调整为8.5 mL。该溶液可室温保存。</li>
		<li>通过称取200.2 g尿素（分子量：60.06 g/mol）并加入312.5 mL的40% 19:1丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，配制100 mL溶液A。使用磁力搅拌器以最大速度搅拌至完全溶解（约3小时），然后用ddH2O定容至500 mL。注意最终浓度为6.667 M尿素和25% 19:1丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。将溶液储存于4 °C洁净塑料器皿中。</li>
		<li>通过称取400.4 g尿素并用ddH2O定容至1 L，配制1 L溶液B；持续搅拌直至尿素完全溶解。溶液B可室温保存。</li>
		<li>按如下方法配制溶液C（10x Tris-硼酸-EDTA [TBE]）：称取432 g Tris碱和220 g硼酸，加入160 mL pH 8的0.5 M EDTA（已过滤），并用ddH2O定容至4 L，配制4 L的10x TBE。该缓冲液大量配制，因其也用作凝胶电泳运行缓冲液。</li>
		<li>通过将1 g过硫酸铵（APS）溶解于10 mL ddH2O中，配制10%过硫酸铵溶液。4 °C保存。</li>
		<li>准备好四甲基乙二胺（TEMED）。与APS溶液一同在4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非变性PAGE（2x非变性凝胶上样溶液）
	<ol>
		<li>通过混合25 mL的100%甘油、10 mL的5x凝胶染色溶液和15 mL的ddH2O，配制50 mL的2x非变性凝胶上样溶液，定容至50 mL。 
		注：与变性凝胶部分相同，可向该储备液中添加上样染料，但其可能干扰凝胶中的荧光信号，因此应避免添加。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 变性凝胶的制备与上样
<ol>
	<li>根据表1配制适当浓度的变性凝胶。考虑所用的具体凝胶制备系统，通常使用30 mL的凝胶。可通过表2估算合适的凝胶浓度：选择聚丙烯酰胺浓度，使溴酚蓝（BB）和二甲苯氰（XC）染料的迁移速率分别快于和慢于目标RNA，以确保在相关大小范围内实现良好的条带分离。</li>
	<li>按照表1混合溶液A、B和C，并在灌胶前立即加入APS和TEMED。使用洁净的塑料器皿充分混匀溶液。</li>
	<li>在确认所有组件均已彻底清洁后，将凝胶溶液倒入合适的凝胶制备装置中。灌胶时抬起装置的一侧，使凝胶略微倾斜，以避免凝胶内部截留气泡。</li>
	<li>插入所需的加样梳，静置使其聚合（约30分钟）。通过仔细观察凝胶加样孔周围折射率的变化来判断聚合是否完成。使用1x溶液C（1x TBE）填充电泳槽，小心移除加样梳。在上样前，用注射器抽吸清洗各加样孔。</li>
	<li>按以下步骤制备变性样品：向目标RNA样品中加入2x变性凝胶上样缓冲液，使终浓度为1x，然后在95 °C下加热变性5分钟，可使用PCR仪或水浴锅完成。</li>
	<li>上样前将样品在室温下冷却数分钟，直至触感凉爽。使用凝胶上样枪头将样品逐层加至每个加样孔底部。 
	注意：对于厚度为1 mm或以上的凝胶可使用圆头枪头；较薄的凝胶应使用平头枪头。</li>
	<li>在室温下进行变性凝胶电泳。确保功率足够低，以防止凝胶装置的玻璃板破裂。 
	注意：在本实验室中，20 cm × 16 cm的玻璃板使用28 W的功率即可满足要求。</li>
</ol>
3. 天然凝胶的制备与上样
<ol>
	<li>根据表3配制适当浓度的非变性凝胶。需考虑具体的凝胶制备系统，但需注意通常使用30 mL的凝胶。按照表3混合1×TBE、40% 29:1 丙烯酰胺:N,N’-亚甲基双丙烯酰胺和甘油溶液，并在灌胶前立即加入APS和TEMED。随后按照步骤2.3和2.4所述进行操作。</li>
	<li>通过向目标RNA样品中加入2×非变性凝胶上样缓冲液，使终浓度为1×，并在室温孵育100分钟后再进行电泳，以确保RNA完全折叠。</li>
	<li>在4 °C的冷室中进行非变性凝胶电泳，确保功率足够低，以免产生热量影响凝胶。 
	注：在本实验室中，20 cm × 16 cm的电泳板使用14 W的功率即可满足要求。</li>
</ol>
4. 通过T7体外转录制备RNA
注意：用于RNA Mango结构体的加尾转录10的DNA序列通过商业途径订购。在本方法中，含有待转录序列及T7启动子的反向互补（RC）序列的DNA寡核苷酸，与T7启动子的上链序列退火后，在体外进行转录。以下每个寡核苷酸中，Mango核心序列的反向互补序列以粗体显示，T7启动子区域的反向互补序列以斜体显示。常规字体的残基对应于其他任意的互补螺旋区域，这些区域有助于Mango核心正确折叠。
芒果 I：GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG 
芒果 II：GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCC TCT CCT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG 
芒果 III：GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG 
芒果 IV：GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC ACT CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT GAG TCG TAT TAA AG 
T7 上游链：CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G
<ol>
	<li>DNA寡核苷酸的制备型凝胶纯化
	<ol>
		<li>对于0.2 µmol规模的DNA合成，将去保护的DNA寡核苷酸重悬于100 µL ddH2O和100 µL 2倍变性上样染料（来自步骤1.2.2）中。此时，上样溶液中的凝胶上样染料浓度应与步骤1.2.2中的浓度相同为宜。</li>
		<li>使用适当聚丙烯酰胺浓度的50 mL制备型变性凝胶纯化DNA寡核苷酸；参考表2选择凝胶浓度。例如，对于50 nt的序列使用8%凝胶。理想情况下，溴酚蓝应比寡核苷酸迁移更快，而二甲苯青应迁移更慢。 
		注意：在本实验室中，此类凝胶使用厚度为1.5 mm的灌胶间隔片和宽度为2–2.5 cm的加样梳制备。</li>
		<li>按照步骤2.4–2.7所述，每孔加样100 µL在步骤4.1.2中制备的DNA寡核苷酸溶液至制备型凝胶孔中。</li>
		<li>小心擦干凝胶外表面，取下玻璃板，并用保鲜膜覆盖凝胶两面。将凝胶置于荧光成像屏上（掺入荧光染料的铝背薄层色谱板是一种经济的替代方案），使用短波长紫外手持灯通过紫外阴影法观察DNA条带。</li>
		<li>若DNA合成质量较高，应观察到清晰、界限分明的阴影。用永久性记号笔在保鲜膜上标记条带位置。 
		注意：应保护皮肤和眼睛免受紫外线伤害，并尽量缩短照射时间，以避免损伤核酸样品。</li>
		<li>将凝胶置于洁净的玻璃板上，小心切下标记的条带，将每块凝胶碎片放入400 µL 300 mM NaCl溶液中。在室温下使用旋转器过夜洗脱DNA。</li>
		<li>将洗脱液转移至洁净的离心管中，加入2.5倍体积的乙醇以沉淀DNA。充分涡旋混匀，将离心管置于-20 °C下30分钟。</li>
		<li>在台式离心机中于4 °C、156,000 x g离心30分钟收集沉淀。小心弃去上清液，将沉淀重悬于ddH2O中。使用分光光度计准确测定DNA寡核苷酸浓度。为方便起见，将样品储存为10 μM储备液，置于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA样品的转录延伸反应及凝胶纯化
	<ol>
		<li>通过混合以下液体NTP储备液配制5倍核苷三磷酸（NTP）储备液：终浓度为40 mM三磷酸鸟苷（GTP，11,400 M-1·cm-1）、25 mM三磷酸胞苷（CTP，7,600 M-1·cm-1）、25 mM三磷酸腺苷（ATP，5,000 M-1·cm-1）和10 mM三磷酸尿苷（UTP，10,000 M-1·cm-1）；所有消光系数均在260 nm处测定。 
		注意：液体或粉末状NTP储备液可商业购得。若由粉末配制母液，需使用1 M NaOH小心调节pH至终pH 7.9。将储备液分装至1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存。</li>
		<li>通过混合25.6 mL 1 M Tris-HCl、14.4 mL 1 M Tris碱、26 mL 1 M MgCl2、10 mL 10% Triton X-100和0.637 g亚精胺，配制100 mL 10倍T7转录缓冲液储备液。加入ddH2O定容至100 mL。 
		注意：应使用校准的pH计确认1倍溶液的终pH为7.9。10倍溶液应经无菌过滤后，分装保存于-20 °C。</li>
		<li>按以下步骤进行转录反应。
		<ol>
			<li>加入以下试剂，使用10倍T7转录缓冲液储备液和ddH2O（来自步骤4.2.2）配制终浓度为1倍T7转录缓冲液的体系，并包含1倍NTP、10 mM二硫苏糖醇（DTT）、1 μM T7正义链序列（序列见第4节注释）、1 μM经凝胶纯化的Mango DNA序列（步骤2.1）以及T7 RNA聚合酶（1 U/µL）。</li>
			<li>涡旋混匀，短暂离心，于37 °C孵育2小时，或直至溶液变浑浊且管底出现白色沉淀。50 µL转录反应经凝胶纯化后应获得约50 µL ~50 µM的RNA。加入等体积2倍变性染料，于-20 °C保存，待进行凝胶纯化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>参照DNA寡核苷酸凝胶纯化部分的步骤4.1.2–4.1.8，对所得RNA进行凝胶纯化，仅将样品替换为RNA。 
		注意：RNA极易被RNase降解，因此所有操作步骤中必须始终佩戴手套和洁净实验服。确保所有样品均使用一次性塑料器皿制备和储存，以防止RNase污染；使用前用热肥皂水仔细清洗玻璃板，用ddH2O充分冲洗，并借助挤压瓶喷洒乙醇帮助干燥。</li>
		<li>取1 μL最终RNA样品，使用液滴式分光光度计测定260 nm处的吸光度。根据最近邻法确定的消光系数计算RNA浓度，并用ddH2O将样品浓度调整至10 μM以便使用。将RNA样品于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Escherichia coli 总粗提核酸提取 
	注意：以下方案为示例。本方案使用在E. coli中由质粒内源表达的Mango I标记的6S RNA，该质粒的诱导表达方法在其他文献中有详细描述4。
	<ol>
		<li>本研究中，分别准备500 mL经诱导的pEcoli-RNA Mango和pEcoli-T1质粒转化的细胞（在OD600nm为1时进行诱导）。离心收集细胞沉淀，并于-80 °C保存备用。</li>
		<li>按以下步骤进行RNA提取。
		<ol>
			<li>取0.5 mL经诱导的pEcoli细胞沉淀，加入500 μL平衡酚。涡旋混匀，溶液将变为乳白色。于最大转速离心2分钟以分离各层。</li>
			<li>吸取上层（略带黄色）液体，并通过加入等体积酚、离心和吸取上层的操作重复步骤4.3.2.1，共进行5次（或直至中间不透明的白色层消失，仅剩两层清晰液体）。</li>
			<li>将经酚提取的水相与等体积氯仿混合，涡旋振荡，然后于最大转速离心2分钟。</li>
			<li>吸取水相，加入NaCl至终浓度300 mM。加入2.5倍体积乙醇沉淀核酸，涡旋混匀，短暂离心，于-20 °C沉淀至少30分钟。</li>
			<li>在台式离心机中于4 °C、15.6 x 1,000 x g离心30分钟收集沉淀。小心弃去上清液，将沉淀重悬于100 μL ddH2O中。</li>
			<li>在此步骤中加入DNase I消化步骤，参照引用的方案11操作，以获得总RNA。 
			注意：需剧烈涡旋，直至沉淀在ddH2O中完全溶解。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 凝胶后染色
<ol>
	<li>按照步骤 1.1.3 中的配方制备 1× 凝胶染色液，并将其加入一个足够宽的洁净玻璃容器中，以便凝胶能轻松放入。 
	注意：带卡扣盖的硼硅酸盐玻璃容器非常适合此用途。</li>
	<li>向容器中加入足量的 1× 凝胶染色液，确保液体完全覆盖凝胶，并在将容器置于轨道摇床上时能漫过凝胶表面。 
	注意：容器必须足够大，使凝胶能够自由移动，同时容器内需有足量缓冲液以完全浸没凝胶。</li>
	<li>当天然或变性凝胶电泳完成后（分别见第 2 或第 3 部分），从电泳装置中取出凝胶并切除加样孔。为便于后续分析时确定方向，可切去凝胶的一角作为标记。</li>
	<li>小心地将凝胶转移至步骤 5.2 中准备好的 1× 凝胶染色液中。 
	注意：凝胶较为脆弱，易断裂，转移时需格外小心。染色过程中应始终盖上容器盖子，以防污染凝胶。</li>
	<li>将凝胶置于轨道摇床上，以 100 rpm 的速度在室温下振荡 30 分钟。 
	注意：确保凝胶不会折叠重叠，否则 RNA 可能从凝胶中扩散出来，导致凝胶其他区域被错误标记。</li>
</ol>
6. 在凝胶中成像芒果标记的 RNA
<ol>
	<li>小心倾去成像缓冲液。用清水快速冲洗凝胶，确保留有足够液体使凝胶在容器中保持轻微流动性。</li>
	<li>小心将凝胶转移至成像仪上。可通过轻轻提起凝胶边缘，将其放置于成像仪托盘中；或者缓慢将凝胶倒入托盘内。确保凝胶下方无气泡，且无过多液体残留。可用移液器轻轻滚压凝胶表面以去除多余液体。 
	注意：使用纸巾吸除多余液体。</li>
	<li>采集凝胶图像，检测激发波长510 nm至发射波长535 nm之间的荧光信号（例如，成像仪中设置为520 nm波长的绿色荧光检测模式）。确保仪器参数已完全优化，并严格遵循所用仪器的操作说明。</li>
</ol>

<ol><li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore%3A+A+Bright%2C+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li>
<li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656(2018).</li>
<li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications%3A+Fluorophore-binding+RNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li>
<li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li>
<li>Trachman, R. J. III, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).</li>
<li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li>
<li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , in review (2018).</li>
<li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li>
<li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol%3AChloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).</li>
<li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain%3A+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li>
</ol>

Mango 荧光系统正在申请专利。

Mango 荧光标记的一个显著优势在于，单个标记可实现多种用途。这些适配体具有高亮度和高亲和力，不仅可用于细胞内成像2，还可用于体外 RNA 或核糖核蛋白复合物（RNP）的纯化4。因此，凝胶成像以一种直接的方式进一步拓展了 Mango 标记的多功能性。Mango 凝胶成像的灵敏度略低于 Northern 印迹法14，但无需耗时且繁琐的膜转移和探针杂交步骤，即可轻松检测到 60–120 fmol 的 RNA 样品。该检测效率与先前报道的小 RNA 在凝胶中基于杂交探针的检测效率相当15。尽管其他荧光生成型适配体技术——特别是 RNA Spinach——具有更高的灵敏度和特异性9，但目前尚无其他方法能同时具备 Mango 适配体系统所拥有的高亮度和高亲和力，这使得单一 RNA 标记可用于细胞成像、RNP 纯化，以及现在的凝胶成像。
该凝胶染色实验方案...

Mango 是一种RNA标记系统，由四个小型荧光RNA适体组成，这些适体可紧密（纳摩尔级结合）结合噻唑橙的简单衍生物（TO1-生物素，图1A）1,2,3。结合后，该配体的荧光强度根据具体适体的不同可增强1,000至4,000倍。Mango系统的高亮度（其中Mango III的亮度超过增强型绿色荧光蛋白eGFP）结合RNA Mango适体的纳摩尔级结合亲和力，使其既可用于RNA复合物的成像，也可用于其纯化2,4。
Mango I5、II6 和 III7 的X射线结构已获得高分辨率解析，这三种适体均利用RNA四链体结构结合TO1-生物素（图1B–D）。这三种适体的紧凑核心均通过紧凑的衔接基序与外部RNA序列隔离。Mango I和II均采用一种柔性的类似GNRA环的衔接结构，将其Mango核心连接至任意RNA双链（图1B、C）。相比之下，Mango III则利用一种刚性的三链体基序将其核心连接至任意RNA螺旋（图1D，紫色残基），而Mango IV的结构目前尚未明确。由于这些适体的配体结合核心均通过螺旋衔接结构与外部RNA序列分离，因此它们很可能均可被简单地整合到多种RNA中。已有研究成功将细菌6S调控RNA（Mango I）、酵母剪接体组分（Mango I）以及人源5S RNA、U6 RNA和一种C/D型scaRNA（Mango II和IV）以这种方式标记2，8，表明许多生物RNA均可利用RNA Mango适体系统进行标记。
变性凝胶和非变性凝胶常用于RNA研究。变性凝胶通常用于判断RNA大小或RNA加工情况，但在例如Northern印迹等情况下，通常需要多个缓慢且连续的步骤才能获得图像。尽管其他RNA荧光适体（如RNA Spinach和Broccoli）已成功用于凝胶成像9，但迄今为止，尚无任何荧光适体系统具备Mango系统所拥有的高亮度和高亲和力，因此探索Mango系统的凝胶成像能力具有重要意义。在本研究中，我们探讨了RNA Mango系统是否可简单地拓展应用于凝胶成像，因为TO1-Biotin的激发和发射波长（分别为510 nm和535 nm）适用于大多数荧光凝胶扫描仪器中常见的eGFP通道进行成像。
本文介绍的胶后染色方案可快速、特异性地检测天然态和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶中的Mango标记RNA分子。该染色方法包括将凝胶浸泡在含有钾离子和TO1-Biotin的缓冲液中。RNA Mango适体基于G-四链体结构，而钾离子是稳定此类结构所必需的。利用由最小Mango编码DNA模板转录的RNA（见方案部分），通过这一简单的染色流程，我们可在天然凝胶中检测到低至62.5 fmol的RNA，在变性凝胶中可检测到125 fmol的RNA。与常用的非特异性核酸染料（见材料表，下文简称SG）相比，即使样品中含有高浓度的总未标记RNA，我们仍能清晰识别出Mango标记的RNA。

<table><tbody><tr><td>用于30 mL PAGE凝胶的0.8 mm厚14孔梳子</td><td>LabRepCo</td><td>11956042</td><td></td></tr><tr><td>101-1000 &amp;micro;L&amp;nbsp; 提示</td><td>Fisher</td><td>02-707-511</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &amp;micro;L 低保留率&amp;nbsp; 提示</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-143</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（40%，19:1）</td><td>生物试剂</td><td>BP1406-1</td><td>急性毒性</td></tr><tr><td>丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（40%，29:1）</td><td>Fisher</td><td>BP1408-1</td><td>急性毒性</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Anachemia</td><td>02116-380</td><td></td></tr><tr><td>铝箔背衬的薄层色谱板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1164840001</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0700</td><td>有害的</td></tr><tr><td>BL21细胞</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>酸性磷酸酶</td><td>B-2940</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝钠盐</td><td>Sigma</td><td>B8026-25G</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>酸性磷酸酶</td><td>C3300</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma Aldrich 醇类</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐</td><td>酸性磷酸酶</td><td>E-4320</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>商业&amp;nbsp;</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>平胶加样提示</td><td>Costar</td><td>CS004854</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11076</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳装置安装好间隔条和梳子</td><td>LabRepCo</td><td>41077017</td><td></td></tr><tr><td>带塑料盖的玻璃培养皿</td><td>Pyrex</td><td>1122963</td><td>应足够大以容纳你的胶块</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Anachemia</td><td>43567-540</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Anachemia</td><td>464140468</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuanTL</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>29000605</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>酸性磷酸酶</td><td>P-2940</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>坩埚</td><td>4903-01</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>酸性磷酸酶</td><td>S-2830</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BDH</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>轨道旋转器</td><td>Lab-Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Invitrogen</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>圆形凝胶上样吸头</td><td>Costar</td><td>CS004853</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>坩埚</td><td>8120-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>坩埚</td><td>8180-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBRGold</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>ABM</td><td>E041</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7024-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>TO1-3PEG-Biotin 氟染料</td><td>ABM</td><td>G955</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9496-100</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Fisher</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青</td><td>Sigma</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.500</td><td></td></tr></tbody></table>

通过染后染色法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记的rna进行荧光可视化

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

天然聚丙烯酰胺凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶分别常规用于表征核糖核蛋白（RNP）复合物的迁移行为以及测定RNA的大小。由于许多凝胶成像技术依赖非特异性染料或昂贵的荧光探针，因此亟需灵敏、具有分辨能力且经济的凝胶成像方法。RNA Mango核心序列是一类较小的（19–22 nt）序列基序，当被任意RNA茎结构封闭时，可简便且低成本地添加至目标RNA上。这些Mango标签能够以高亲和力和特异性结合一种称为TO1-Biotin的噻唑橙类荧光配体，该配体在结合后荧光信号可增强数千倍。本文展示了Mango I、II、III和IV可用于在凝胶中以高灵敏度特异性成像RNA。在含有钾离子和20 nM TO1-Biotin的成像缓冲液中浸泡30分钟，即可检测到天然凝胶中低至62.5 fmol的RNA以及变性凝胶中低至125 fmol的RNA。我们通过在复杂的总细菌RNA混合物背景下对带有Mango标签的6S细菌RNA进行成像，验证了Mango标记系统的特异性。

短芒果标记的RNA的制备方法如方案部分所述。假设在变性条件下由于凝胶中含有尿素，荧光信号最难观测，因此我们首先研究了芒果适配体对尿素的耐受性，尿素是一种核酸变性剂。我们发现，芒果适配体在尿素浓度高达约1 M时仍具有显著的抗变性能力（图2A）。在向变性凝胶中添加染色液之前，凝胶中尿素的终浓度为6 M。因此，加入足量的染色液将尿素浓度降低至1 M，将最有利于四种适配体均呈现完全的芒果荧光。实际操作中，染色方案所达到的效果略低于此最优状态，但若需要，可通过增加染色液体积或在染色过程中更换一次染色液的简便方法加以纠正。
将Mango标记的RNA构建体在变性凝胶中电泳后，通过在8%变性凝胶中加入三种不同量的Mango III来优化染色时间，以获得最大凝胶荧光信号（图2B）。时间进程显示，染色液浸泡5分钟后即可清晰观察到荧光信号。Mango III构建体的最大荧光信号在染色20–40分钟后达到，此...

本文介绍一种灵敏、快速且具有高分辨能力的凝胶后染色方法，可用于对带有RNA Mango适体I、II、III或IV标记的RNA进行成像，适用于天然或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶。在完成标准PAGE电泳后，可使用TO1-Biotin对带有Mango标签的RNA进行简便染色，并利用常见的荧光成像仪进行分析。

通过染后染色法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记的RNA进行荧光可视化

天然和变性聚丙烯酰胺凝胶常规用于表征核糖核蛋白（RNP）复合物的迁移率以及测定RNA大小，……

本文展示的Mango标记凝胶成像方法具有良好的稳健性，预计在灵敏度和特异性方面可进一步简单拓展。通过将Mango标记添加至目标RNA，该方法可简便地实现对具有重要生物学功能的RNA及RNA复合物的常规纯化。RNA正被发现与越来越多的疾病相关，因此这种后标记技术为RNA的追踪与可视化提供了一种简便快速的方法。在将凝胶从一处转移至另一处时需格外小心，因为凝胶较为脆弱，容易断裂。制备30毫升变性凝胶时，首先应根据目标RNA选择合适浓度的聚丙烯酰胺，并搭配相应的溴酚蓝和二甲苯蓝染料，以确保条带分离效果良好。然后，按照表一将溶液A、B和C混合，并加入APS和TEMED。立即将凝胶溶液倒入合适的凝胶制备装置中。插入所需的梳子，并让凝胶聚合约30分钟。用1×TBE溶液填充电泳槽，并小心移去梳子。小心地提起凝胶，并将其安装到凝胶装置上，使用长尾夹固定。在上样前，用注射器抽吸去除加样孔中的液体。通过向目标RNA样品中加入2X变性凝胶上样缓冲液，制备1X RNA样品。使用PCR仪将样品在95摄氏度加热5分钟。随后，使用凝胶加样枪头将冷却后的样品加入到每个孔的底部。在室温下电泳，确保电压足够低，以免导致凝胶装置的玻璃板破裂。根据手稿，在一个足够宽的洁净玻璃容器中配制1X凝胶染色液，确保凝胶能够完全放入其中。加入足量的1X凝胶染色液，使凝胶置于摇床中时能被溶液完全覆盖。电泳结束后，从装置中取出凝胶，切去加样孔以及凝胶的一角，以帮助确定凝胶的方向。然后，小心地将凝胶转移至1X凝胶染色液中。进行成像时，小心倒出染色液，并用清水快速冲洗凝胶。最后，小心地将凝胶转移至成像仪的托盘上。用玻璃移液管在凝胶上滚动，以去除截留的气泡和多余的液体，然后进行凝胶成像。芒果适配体一、二、三、四在尿素浓度高达约1摩尔时仍显著抵抗变性。20至40分钟的染色时间足以达到凝胶荧光的最大强度。更长的时间不适用于本研究中使用的小分子RNA，因为它们会开始从凝胶中扩散出来。荧光分析表明，在尿素存在下，Mango适体一、二和三的折叠速度比适体四更快。在没有尿素的情况下，折叠速度明显更快，这与预期一致。染色后检测方法的灵敏度通过每种Mango变体在天然和变性凝胶中均显示出对应于正确折叠RNA的单一条带得以体现，其中变性凝胶的灵敏度略低。天然凝胶的定量结果在约一个数量级范围内呈对数线性关系，其中Mango一、二和四号的线性表现优于Mango三号。变性凝胶的定量结果线性更好，提示变性凝胶中尿素的存在可能在将适配体置于 TO1 生物素染色液时，提供更均一的折叠方式。与 SG 染色相比，使用 TO1 生物素染色可在总 RNA 存在的情况下检测到 Mango 标记的 RNA。请注意确保凝胶染色容器足够大以容纳凝胶，否则凝胶可能发生折叠。RNA 样品将从一个地方转移至另一个地方。与变性凝胶类似，该方法也可用于天然凝胶。在低温室中以较低功率电泳，以维持天然条件。

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生物化学

通过后染色方法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记RNA的荧光可视化

荧光法检测病毒RNA 原位 杂交（FISH）

在本视频中，我们演示了一种使用荧光探针对聚丙烯酰胺凝胶进行银染的方法，以实现对总蛋白的可视化。...

荧光银染：一种用于可视化聚丙烯酰胺凝胶中总蛋白的技术

在本视频中，我们展示了一种变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，用于分离磷酸化的RNA分子与其非磷酸化形式。RNA分子经荧光标记，以便在凝胶上通过激光检测。...

用于RNA分析的变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种分离荧光标记的磷酸化RNA寡核苷酸与其非磷酸化对应物的技术

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位...

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

该方法通过将凝胶浸泡在SYBR Green...

基于蓝光照射诱导甲臜沉淀的DNA染色方法

本文介绍了一种详细的实验方案，阐述了一种用于聚丙烯酰胺凝胶中总蛋白检测的新型荧光染色技术。该方案采用一种对银离子特异的荧光增强探针，可检测...

聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的荧光银染法

本文介绍一种依赖脱氧核酶（DNAzyme）的RNA切割实验方案。该方法可实现对RNA...

DNA酶依赖性分析rRNA的2'-O-甲基化

该方案介绍了两种测定荧光RNA适体Spinach2和Broccoli动力学特性的方法。第一种方法描述了如何测量荧光适体的动力学参数 体外...

测定 体外 荧光RNA适体的细胞内激活动力学

微阵列聚合物分析（MAPP）是一种用于生物样本中糖类成分分析的高通量技术。...

用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物谱型分析（MAPP）

本文介绍了在长链RNA的末端位置进行双色标记，并通过将其包裹在磷脂囊泡中实现表面固定，从而应用于单分子FRET全内反射荧光显微镜检测。结合这些技术可实现对RNA动态行为在单分子水平上的精确可视化与分析。...

长RNA的荧光末端标记与封装用于单分子FRET-TIRF显微镜观察

了解使用TO1-Biotin后染色法在聚丙烯酰胺凝胶中对Mango标记RNA进行荧光可视化的快速灵敏技术。该方法简化了生物重要RNA及其复合物的追踪与纯化流程，为RNA相关疾病研究提供有力工具。

通过染后染色法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记的RNA进行荧光可视化

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