通过染后染色法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记的RNA进行荧光可视化

本文展示的Mango标记凝胶成像方法具有良好的稳健性，预计在灵敏度和特异性方面可进一步简单拓展。通过将Mango标记添加至目标RNA，该方法可简便地实现对具有重要生物学功能的RNA及RNA复合物的常规纯化。RNA正被发现与越来越多的疾病相关，因此这种后标记技术为RNA的追踪与可视化提供了一种简便快速的方法。

在将凝胶从一处转移至另一处时需格外小心，因为凝胶较为脆弱，容易断裂。制备30毫升变性凝胶时，首先应根据目标RNA选择合适浓度的聚丙烯酰胺，并搭配相应的溴酚蓝和二甲苯蓝染料，以确保条带分离效果良好。然后，按照表一将溶液A、B和C混合，并加入APS和TEMED。

立即将凝胶溶液倒入合适的凝胶制备装置中。插入所需的梳子，并让凝胶聚合约30分钟。用1×TBE溶液填充电泳槽，并小心移去梳子。

小心地提起凝胶，并将其安装到凝胶装置上，使用长尾夹固定。在上样前，用注射器抽吸去除加样孔中的液体。通过向目标RNA样品中加入2X变性凝胶上样缓冲液，制备1X RNA样品。

使用PCR仪将样品在95摄氏度加热5分钟。随后，使用凝胶加样枪头将冷却后的样品加入到每个孔的底部。在室温下电泳，确保电压足够低，以免导致凝胶装置的玻璃板破裂。

根据手稿，在一个足够宽的洁净玻璃容器中配制1X凝胶染色液，确保凝胶能够完全放入其中。加入足量的1X凝胶染色液，使凝胶置于摇床中时能被溶液完全覆盖。电泳结束后，从装置中取出凝胶，切去加样孔以及凝胶的一角，以帮助确定凝胶的方向。

然后，小心地将凝胶转移至1X凝胶染色液中。进行成像时，小心倒出染色液，并用清水快速冲洗凝胶。最后，小心地将凝胶转移至成像仪的托盘上。

用玻璃移液管在凝胶上滚动，以去除截留的气泡和多余的液体，然后进行凝胶成像。芒果适配体一、二、三、四在尿素浓度高达约1摩尔时仍显著抵抗变性。

20至40分钟的染色时间足以达到凝胶荧光的最大强度。更长的时间不适用于本研究中使用的小分子RNA，因为它们会开始从凝胶中扩散出来。荧光分析表明，在尿素存在下，Mango适体一、二和三的折叠速度比适体四更快。

在没有尿素的情况下，折叠速度明显更快，这与预期一致。染色后检测方法的灵敏度通过每种Mango变体在天然和变性凝胶中均显示出对应于正确折叠RNA的单一条带得以体现，其中变性凝胶的灵敏度略低。天然凝胶的定量结果在约一个数量级范围内呈对数线性关系，其中Mango一、二和四号的线性表现优于Mango三号。

变性凝胶的定量结果线性更好，提示变性凝胶中尿素的存在可能在将适配体置于 TO1 生物素染色液时，提供更均一的折叠方式。与 SG 染色相比，使用 TO1 生物素染色可在总 RNA 存在的情况下检测到 Mango 标记的 RNA。请注意确保凝胶染色容器足够大以容纳凝胶，否则凝胶可能发生折叠。

RNA 样品将从一个地方转移至另一个地方。与变性凝胶类似，该方法也可用于天然凝胶。在低温室中以较低功率电泳，以维持天然条件。