小鼠颅面组织和未切除骨骼的组织制备及免疫染色
2019年5月10日
在这里,我们提出了一个详细的协议,以小鼠颅面组织为例,通过免疫染色来检测和量化颅面形态形成/发病机制期间的蛋白质水平。此外,我们描述了一种制备和冷冻方法,从幼鼠的未分化硬组织免疫染色。
在这里，我们提出了我们简单的协议，用于在分节材料上的蛋白质上进行免疫荧光检测。此方法不需要抗原检索。我们将使用鼠标头，包括未计算硬组织。
该技术的主要优点是跳过硬组织抗原检索和脱钙。这些导致免疫污染效果的质量良好。这种方法还节省了时间和人工。
此方法也适用于其他组织，并适当修改。为了从未计算的组织中制作好部分，进一步解剖目标组织以修剪周围的组织，如有必要，在低温保护前两天，在四摄氏度下用 10%EDTA 处理样品。可视化演示对该方法的过程进行了详细而清晰的说明。
首先，为每只怀孕小鼠准备一个10厘米和几个3.5厘米的含有PBS的盘子和一个含有两毫升4%PFA的培养板，每个井内都有4%PFA的培养板，并把它们全部放在冰上。要解剖怀孕小鼠的胚胎，用钳子抓住安乐死小鼠腹部中心下方的皮肤，只切开皮肤，然后轻轻拉皮，将其从下腹部肌肉壁分离。按照相同的皮肤切口线，切入腹腔。
取出含有一串胚胎的子宫。然后，通过轻轻切开子宫壁来去除胚胎，子宫壁将去除外质组织，如蛋黄囊和安尼翁。切割并分离头部，从每个胚胎，用钳子将每个头部转移到一个包含4%PFA的12井板的单独井中。
在四摄氏度下孵育四小时以修复。在 4 摄氏度的 PBS 中冲洗头部，轻轻摇动 12 小时。要冷冻保护头部，请用钳子将其转移到新的 12 井板中，其中含有 PBS 中 30%蔗糖的两毫升。
在四摄氏度下轻轻的搅拌孵育，直到头部沉入菜底。要嵌入低温保护头，请将它们转移到含有最佳切割温度化合物的模具中，并平衡几分钟。使用钳子，调整样品的位置和方向，使样品的修剪侧朝向嵌入模具的底部。
然后，将模具放在干冰上进行冷冻，并存放在零下80摄氏度的塑料袋中，直到准备进行冷冻。对于产后组织，在切除安乐死三周至三个月大的小鼠的皮肤和脂肪组织后，切开并隔离头部，取出粘结物。然后，修复和冷冻保护头部，就像用胚胎头做。
以与 OCT 中的胚胎头类似的方式嵌入 8% 明胶中，并将 Cryomolds 放在零下 80 摄氏度的塑料袋中，直到冷冻。设置适当的低温恒温。将样品放在低温室中约 30 分钟，以与低温恒温均衡。
将带样品的块从 Cryomold 中拆下，然后用 OCT 滴将其安装到试样夹头上并冻结，确保样品的修剪侧远离夹头并朝向操作员。将块安装夹头装载到低温器对象支架上。调整刀片支架，使铲刀角度相对于样品保持 3 到 5 度。
将 10 微米部分收集到涂层显微镜幻灯片上。将部分留在室温下，直到完全干燥，然后将它们储存在零下80摄氏度。首先进行染色，从零下80摄氏度的零下80摄氏度中拿出滑梯，并在室温下保持一小时，以空气干燥部分。
在0.1%PBST中冲洗幻灯片三次，每次五分钟，洗净十进制，并渗透部分。在每个幻灯片中加入 200 微升的阻消溶液，并在室温下孵育 30 分钟。然后，在不冲洗幻灯片的情况下移除阻塞解决方案。
在每张幻灯片中加入100微升的原抗体稀释，并在4摄氏度下孵育。在室温下，用 PBS 冲洗幻灯片三次，每次冲洗 10 分钟。加入100微升的二次抗体稀释在阻消溶液中，并在室温下孵育一小时，免受光线影响。
在室温下用PBS冲洗三次，每次冲洗10分钟，仍然防止光线。要安装幻灯片，请在每张幻灯片上添加两滴带 DAPI 的防褪色介质，盖上盖玻片，并在 4 摄氏度下存储，直到准备好成像。控制胚胎的正面骨骼对pSmad1/5/9、下游BMP信号因子和细胞增殖标记Ki67呈阳性。
然而，在神经波峰特异性，组成激活BMPR1A突变胚胎，然而，pSmad1/5/9水平增加，而Ki67水平下降。此外，在突变胚胎的正面骨骼中观察到的凋亡细胞比控制胚胎的细胞多。明胶嵌入头部的冠状冷冻清晰显示来自鼻骨和鼻组织tdTomato盒的GFP信号和RFP信号，表明明胶不会干扰荧光信号。
当这些部分被免疫污为SOX9或Osterix和E11/波多普兰素，优质部分从大多数三个星期的硬组织获得。另一方面，用三个月大的样本，只在一些硬组织，包括股骨、鼻组织和头骨的血管隔间，包括鼻腔缝合线和头部周围的骨头中，只获得了高质量的部分。SOX9阳性细胞特别在生长板的软骨细胞和股骨和鼻隔膜的关节中检测。
在三周大的切口中，SOX9在分血细胞中被发现。奥斯特里克斯和E11双染色结果表明，在骨细胞中检测到奥斯特里克斯，而E11在股骨和头部骨骼的骨细胞中检测到。在三周的切口中，奥斯特利克斯在细胞质中呈阳性，而E11在卵泡中质细胞中呈阳性。
请不要用 4%PFA 过度修复样品。对于未计算硬组织在明胶中的分块，最佳温度为零下25摄氏度，更低。按照这个程序，荧光水平可以量化，如我们的协议中描述的。
这些测量将提供翔实的数据，以显示不同组之间蛋白质相对水平的差异。在它的发展之后，这项技术为双重或三重染色铺平了道路，以获得不同蛋白质的共表达模式。4%PFA 是危险的。
它可能导致皮肤过敏、严重眼损伤、器官损伤或癌症。请使用个人防护设备，处理后彻底清洗皮肤。
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概述
本文介绍了一种用于检测小鼠颅面组织切片中蛋白质的免疫荧光检测协议。该方法消除了抗原提取和脱钙的需要，简化了免疫染色过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 免疫学
背景
- 颅面形态发生和发病机制是关键的研究领域。
- 了解蛋白质水平可以提供对发育过程的洞察。
- 传统方法通常需要大量的准备工作，可能耗时较长。
- 该协议旨在简化过程，同时保持质量。
研究目的
- 提供一种可靠的方法来检测颅面组织中的蛋白质水平。
- 提高免疫染色技术的效率。
- 促进颅面发育及相关疾病的研究。
使用的方法
- 在小鼠颅面组织切片上进行免疫荧光检测。
- 未脱钙硬组织的制备和冷冻切片。
- 避免抗原提取步骤。
- 应用免疫染色技术来评估蛋白质水平。
主要结果
- 该协议成功检测到蛋白质，无需脱钙。
- 免疫染色结果具有高质量和可重复性。
- 与传统技术相比，该方法节省了时间和劳动力。
- 它为研究颅面形态发生提供了一个有用的工具。
结论
- 该协议为颅面研究中的蛋白质检测提供了一种简化的方法。
- 它提高了免疫染色的效率，使其对研究人员来说更加便捷。
- 该方法有助于更好地理解颅面发育。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables efficient protein detection in craniofacial tissues by eliminating antigen retrieval and decalcification steps, reducing time and labor in preclinical target validation workflows. It supports mechanistic de-risking by providing reliable spatial protein expression data in disease-relevant systems, facilitating go/no-go decisions in early discovery. The method enhances assay standardization and reproducibility for downstream screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific protein localization in craniofacial morphogenesis models.
- Operational Value: Reduces procedural complexity by avoiding antigen retrieval and decalcification, accelerating target validation timelines.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking via high-quality immunostaining of key markers like pSmad1/5/9 and Ki67 in BMP signaling pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized cryosections suitable for quantitative immunofluorescence screening of protein expression changes.
- Reproducibility: Enables consistent section quality from undecalcified hard tissues, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Scalability: Compatible with gelatin embedding for long-term storage and batch processing of tissue samples.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to craniofacial pathogenesis models, allowing assessment of protein expression alterations in mutant embryos.
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining antigen integrity without harsh treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables quantification of fluorescence levels to inform go/no-go decisions based on protein expression thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research, supporting hypothesis testing and pathway clarification in craniofacial biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by detecting spatial protein expression patterns in embryonic and postnatal tissues.
- Screening: Enables assay standardization through consistent cryosectioning and immunostaining of hard and soft tissues.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence readouts that allow comparison of protein levels across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving tissue morphology and antigenicity in undecalcified samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein detection across multiple tissue types with protocol adaptations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through reliable detection of proliferation and apoptosis markers.
- Operational Value: Improves standardization and reduces variability by eliminating antigen retrieval steps.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by decreasing hands-on time and accelerating data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative protein expression data for decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cryoprotection, and immunofluorescence techniques.
- Dependent on cryostat and fluorescence microscopy infrastructure for sectioning and imaging.
- Necessitates standardization of blocking, antibody incubation, and washing protocols across teams.
- Requires adaptation of embedding media (OCT vs. gelatin) based on tissue age and hardness.
- Limited by antibody specificity and quantification challenges noted in the source material.
