Name: 三维水凝胶中全球细胞基质金属蛋白酶和代谢活性的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学习利用荧光传感器和微孔板读数仪在PEG水凝胶三维培养中测定细胞基质金属蛋白酶活性与代谢活性的方法。该技术无需额外样品处理，适用于高通量药物筛选。

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作者感谢美国俄亥俄癌症研究中心（Ohio Cancer Research, OCR）对本研究的资助，以及沙特阿拉伯利雅得国王沙特大学（King Saud University, KSU）对第一作者的资助支持。&#160;荧光肽传感器的分子量测定得到了俄亥俄州立大学校园化学仪器中心质谱与蛋白质组学设施的技术支持，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法进行检测。

1. 水凝胶组分的制备
<ol>
	<li>按照文献所述方法合成荧光蛋白酶可降解肽8，使用荧光素作为荧光分子，dabcyl 作为淬灭剂。将肽溶解于 DMSO 中，浓度为 10 mM，并以小份（约 30 µL）分装后储存于 -80 °C 冰箱中，以避免反复冻融循环。 
	注意：这些肽也可商业购买。本方案要求肽序列具有 C 末端半胱氨酸，以便共价整合到水凝胶聚合物网络中。</li>
	<li>按照文献所述方法制备 8 臂 40 kDa 聚乙二醇胺（PEG）-降冰片烯（NB）17。使用 1H NMR 验证端基官能化程度高于 90%。将 PEG-NB 溶解于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为 25% w/v，并以小份（约 300 µL）分装后储存于 -80 °C 冰箱中。 
	注意：带有降冰片烯官能化的 PEG 也可商业购买。</li>
	<li>按照文献所述方法合成光引发剂锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸盐（LAP）18。将 LAP 溶解于无菌水中，浓度为 68 mM，并以小份（约 300 µL）分装后储存于 -80 °C 冰箱中。 
	注意：可选用 Irgacure（2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮）作为替代光引发剂。LAP 和 Irgacure 均可商业购买。</li>
	<li>将 MMP 可降解肽交联剂（KCGPQG↓IWGQCK）和细胞黏附肽（CRGDS）分别溶解于无菌水中，浓度分别为 200 mM 和 100 mM，并分别以小份（约 300 µL 和约 30 µL）分装后储存于 -80 °C 冰箱中。</li>
</ol>
2. 检测培养基的制备
<ol>
	<li>为基质金属蛋白酶（MMP）检测制备热灭活、炭吸附处理的胎牛血清（FBS）： 
	注意：FBS 中的蛋白酶在 MMP 检测中可能产生较高的背景信号；因此，建议对检测用培养基中的 FBS 进行热灭活和活性炭处理。
	<ol>
		<li>将100 mL FBS在55 °C加热30分钟以灭活。 
		注意：此处使用了100 mL胎牛血清（FBS），分装后于-20 °C保存，以备后续使用。可根据需要使用更小体积。</li>
		<li>加入0.25% w/v的活性炭和0.025% w/v的葡聚糖至少量FBS（约5 mL）中，搅拌至形成悬浊液。然后加入剩余的FBS，在55 °C下搅拌30分钟。</li>
		<li>离心，1,962 x g 在 4 °C 下孵育 20 分钟。然后将上清液转移至另一容器中。</li>
		<li>重复步骤 2.1.2，但在 37 °C 下进行，随后进行步骤 2.1.3。使用 0.45 µm 滤器对上清液进行过滤除菌，然后使用 0.2 µm 滤器再次过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用添加了1%去炭吸附胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、10 U/mL青霉素和10 µg/mL链霉素的培养基配制检测用培养基。 
	注意：建议使用不含酚红的培养基，因其荧光干扰较小。检测培养基中还可添加胰岛素、生长因子等其他成分。. 只要吸光度和荧光光谱峰不与传感器（494 nm/521 nm）重叠，即可添加。</li>
	<li>在检测培养基中将细菌胶原酶I型稀释至10和1,000 µg/mL，作为阳性对照。</li>
</ol>
3. 水凝胶制备与细胞包封
<ol>
	<li>制备水凝胶前体溶液。
	<ol>
		<li>按以下顺序将试剂加入一个1.5 mL离心管中，每加入一种组分后均需涡旋混匀：20 mM 8臂40 kDa PEG-NB、12.75 mM交联剂MMP可降解肽、17.8 mM NaOH、1 mM CRGDS、2 mM LAP和0.25 mM荧光型MMP可降解肽。 
		注意：表1列出了水凝胶前体溶液的组分、储备液浓度、工作浓度、体积计算公式以及配制120 µL水凝胶前体溶液所需的体积，该体积足以进行10个水凝胶的实验。为补偿移液过程中溶液的损失，总体积应增加20%。商业化的肽通常以酸性盐酸溶液形式提供，因此需加入NaOH以使最终pH达到7。最终溶液的pH应由用户自行确认。</li>
		<li>将水凝胶前体溶液分装至多个1.5 mL离心管中，每种实验条件对应一管。 
		注意：建议设置若干不含细胞的水凝胶作为对照条件。阴性对照可用于评估荧光传感器的非特异性降解，可将一种水凝胶条件与载体对照或仅实验培养基（若无处理因素）共同孵育。阳性对照及用于不同实验间校准时，可将水凝胶与已知能切割荧光传感器的蛋白酶共同孵育。例如，本实验中使用了两种浓度的细菌胶原酶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞包埋于水凝胶中。
	<ol>
		<li>根据所用细胞类型制备单细胞悬液。例如，用10 mL PBS洗涤一个10 cm培养皿中的A375黑色素瘤细胞，使用0.05%胰蛋白酶消化，并在37 °C、5% CO2 条件下孵育3分钟，随后用血细胞计数板计数以确定总细胞数。</li>
		<li>将细胞悬液在314 x g条件下离心3分钟，吸除培养基，然后用PBS重悬细胞，浓度约为实验所需最高接种密度的三倍。例如，本实验中使用密度为21 x 106个细胞/mL的细胞悬液，以达到最终包埋密度为7 x 106个细胞/mL。</li>
		<li>再次计数细胞，以确保细胞浓度准确。</li>
		<li>根据所需的接种密度（本例中为0.25、0.5、1、2、3、4、5、6和7 x 106个细胞/mL），向各管水凝胶前体溶液中加入相应量的细胞悬液和PBS。对于不含细胞的实验组，则用PBS代替细胞悬液。 
		注意：所有实验组的最终水凝胶前体溶液体积应保持一致，以确保水凝胶组分与PBS的比例恒定。含有细胞的离心管不得涡旋，应通过剧烈吹打混匀前体溶液，同时避免产生气泡。</li>
		<li>将10 µL水凝胶前体溶液加入无菌黑色圆底96孔板的各个孔中，加样时确保移液枪头位于每孔中央。</li>
		<li>将96孔板置于强度为4 mW/cm2的紫外光（UV）下照射3分钟，以引发水凝胶前体溶液聚合。 
		注意：所用紫外灯（UVL-56手持式紫外灯，UVP，Upland，CA）发射波长较长的UV-A光（365 nm），不会影响细胞活性。</li>
		<li>除不含包埋细胞的阳性对照组外，向所有孔中加入150 µL检测培养基；向阳性对照组中加入150 µL胶原酶溶液。</li>
		<li>向96孔板外周孔中加入150 µL PBS，以减少孵育过程中的蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. MMP 和代谢活性的测定
<ol>
	<li>封装后立即测量荧光，以建立基线荧光值并确保水凝胶聚合的均一性。使用荧光酶标仪读取平板，采用不透明96孔板程序，设置扫描区域为494 nm/521 nm（激发/发射波长）。此为0 h读数。</li>
	<li>将平板置于37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育18 h。</li>
	<li>向每孔加入代谢活性试剂（刃天青），体积比为1:10（v/v）。</li>
	<li>将平板继续在37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育额外6 h。 
	注意：此孵育时间可能因细胞类型不同而有所变化。</li>
	<li>在封装后24 h测量荧光。使用荧光酶标仪读取平板，采用不透明96孔板程序，设置扫描区域为494 nm/521 nm（激发/发射）用于检测基质金属蛋白酶（MMP）活性，560 nm/590 nm（激发/发射）用于检测代谢活性。</li>
</ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Physiological+Events+in+2D+vs.+3D+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halfway+between+2D+and+Animal+Models%3A+Are+3D+Cultures+the+Ideal+Tool+to+Study+Cancer-Microenvironment+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).</li>
<li>Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytically+Degradable+Hydrogels+with+a+Fluorogenic+Substrate+for+Studies+of+Cellular+Proteolytic+Activity+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration.</a> Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Chalasani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+of+Protease+Activity%3A+Assays+to+Screen+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches.</a> Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).</li>
<li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Protease+Activity+in+Living+Cells%3A+From+Two+Dimensions+to+Four+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions.</a> Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).</li>
<li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li>
<li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li>
<li>Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Metalloproteinases+in+Non-Neoplastic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178(2016).</li>
<li>Visse, R., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases%3A+structure%2C+function%2C+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry.</a> Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).</li>
<li>Vihinen, P., Kähäri, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+in+cancer%3A+Prognostic+markers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets.</a> International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).</li>
<li>Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrahydrocurcumin+inhibits+HT1080+cell+migration+and+invasion+via.+downregulation+of+MMPs+and+uPA1%5BTitle%5D)+AND+%22APHS+Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1.</a> APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).</li>
<li>Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin%2C+demethoxycurcumin+and+bisdemethoxycurcumin+differentially+inhibit+cancer+cell+invasion+through+the+down-regulation+of+MMPs+and+uPA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutritional+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).</li>
<li>Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+High-Throughput+Cell+Encapsulation+Platform+to+Study+Changes+in+Cell-Matrix+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).</li>
<li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+tethered+TGF-%CE%B21+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).</li>
<li>Sridhar, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cellularly+degradable+PEG+hydrogel+to+promote+articular+cartilage+extracellular+matrix+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%27+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+Validation+in+High+Throughput+Screening+-+from+Concept+to+Application%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application.</a> Drug Discovery and Development. , (2015).</li>
<li>Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIversen%2C+PW+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).</li>
<li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li>
<li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

三维体外细胞培养可模拟体内环境的诸多重要特征。然而，三维培养也使得细胞功能与信号转导的检测面临挑战，因为许多生物学检测方法需要回收细胞并获取大量细胞样本。因此，开发一种无需额外样品处理即可直接测量细胞功能的简易三维培养系统，将显著提升三维培养系统的实用性。本文所述的三维系统可适用于多种不同应用。荧光传感器的序列可进行调整以检测其他蛋白酶。例如，此前已使用可被基质金属蛋白酶 MMP-1、-2、-3、-7、-8 和 -9 切割的荧光可裂解传感器序列（GPQG↓IWGQK）来检测黑色素瘤在化疗药物作用下的 MMP 活性。22聚乙二醇（PEG）水凝胶系统的使用还可实现对细胞微环境的精确独立调控，包括水凝胶内的力学性能、可降解性以及基质黏附基团。本研究中所用的黏附分子RGD是一种源自纤连蛋白的序列，可介导整合素依赖性黏附。其他源自纤维蛋白原和层粘连蛋白的黏附分子，如RLD和IKVAV，也可被用于激活不同类型的整合素受体。例如，已有研究证明，改变黏附分子会影响主动脉瓣间质细胞（VIC）的伸长，这可能对主动脉瓣狭窄产生影响15水凝胶交联剂序列可调控水凝胶的...

三维（3D）培养系统通常能更真实地模拟 体内 相较于传统的二维（2D）培养系统，可参见几篇优秀的出版物1,2,3然而，由于细胞回收和后续样品处理的困难，利用三维（3D）培养系统检测细胞功能一直面临挑战。这一难题限制了在3D培养系统中对多种细胞功能的测定。为克服这一障碍，亟需开发能够便捷检测3D环境中细胞功能的新技术。其中一种解决方案是研制既能支持3D细胞培养又可集成传感器以检测细胞功能的材料。例如，已有多种水凝胶系统引入了荧光生成型蛋白酶可裂解基团，以实现对3D环境中蛋白酶活性的可视化检测。4,5,6,7尽管这些系统最初用于显微成像，但也可通过标准酶标仪适配用于全局基质金属蛋白酶（MMP）活性检测，从而能够在三维环境中便捷地测量细胞功能8.
基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌依赖性蛋白酶超家族，在正常组织稳态以及多种疾病中发挥关键作用。MMPs 可降解并重塑细胞外基质（ECM），切割细胞表面受体和细胞因子，并激活其他 MMPs9,10。MMPs 在伤口愈合等生理过程以及关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和癌症等疾病中均具有重要作用（详见文献9,10,11）。在癌症中，MMP 的高表达水平与肿瘤转移和预后不良密切相关12。此外，MMPs 通过促进癌细胞的侵袭和迁移推动肿瘤进展，而这些细胞过程本质上是三维现象13,14。因此，在包括基础生物学研究和药物筛选实验在内的多种背景下，人们对在三维培养体系中检测 MMP 活性的能力具有浓厚兴趣。
聚乙二醇（PEG）水凝胶因其高含水量、抗蛋白质吸附性以及可调控的特性，被广泛用于三维细胞培养。人们已将多种功能基团修饰到PEG水凝胶上以调控细胞行为，例如引入模拟细胞外基质（ECM）的多肽序列如RGD、RLD和IKVAV以促进细胞黏附，或直接偶联转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）等生长因子15,16。近年来，PEG水凝胶还被修饰上可检测细胞功能的传感多肽5,8。具体而言，使用修饰了荧光生成型基质金属蛋白酶（MMP）可降解多肽的PEG水凝胶系统，可在标准酶标仪上直接测量三维培养条件下细胞的MMP活性，且无需额外处理步骤。该系统还可与其他细胞功能检测方法兼容，包括代谢活性检测。本文描述了一种在修饰有荧光生成型MMP可降解多肽的三维PEG水凝胶中培养细胞并检测其MMP活性的实验方案，并展示了为优化该检测方法所需进行的初步实验结果。将人黑色素瘤细胞（A375）以不同接种密度包埋于荧光水凝胶中，以确定适用于该检测体系的有效接种密度范围。包埋24小时后，利用标准微孔板读板仪检测细胞的MMP活性和代谢活性。随后，将MMP活性归一化至代谢活性，以确定处于检测线性范围内的接种密度。最后，通过计算三复孔之间的板内变异系数（% CV）来评估实验结果的可重复性。该方法实现了简便快速的三维细胞培养，并可在最少样本处理的情况下轻松检测蛋白酶活性。

<table><tbody><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>活性炭&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3345</td><td></td></tr><tr><td>黑色圆底 96 孔板</td><td>Brand-Tech</td><td>89093-600</td><td></td></tr><tr><td>细胞黏附肽（CRGDS）</td><td>GenScript USA Inc.</td><td>定制合成</td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4876</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）&amp;nbsp;</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>荧光酶标仪&amp;nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Cytation 3</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MMP 可降解肽交联剂（KCGPQG&amp;darr;IWGQCK）</td><td>GenScript USA Inc.</td><td>定制合成</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318500</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>刃天青（Alamar Blue）</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯&amp;nbsp;</td><td>UVP</td><td>95-0006-02</td><td></td></tr></tbody></table>

在三维水凝胶中测量全细胞基质金属蛋白酶及代谢活性

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

三维（3D）细胞培养系统通常比传统的二维（2D）培养系统更接近地模拟体内（in vivo）细胞的响应和功能。然而，在3D培养中检测细胞功能往往更具挑战性。许多生物学检测需要回收细胞材料，而在3D培养中这一过程可能较为困难。解决这一挑战的方法之一是开发新型材料，使细胞功能的检测能够在材料内部直接进行。本文介绍了一种在96孔板格式中检测3D水凝胶内细胞基质金属蛋白酶（MMP）活性的方法。在该系统中，聚乙二醇（PEG）水凝胶被修饰上一种可被MMP切割的荧光探针。细胞MMP活性与荧光强度成正比，可使用标准的微孔板读数仪进行检测。与先前的24孔板版本相比，将该检测微型化至96孔板格式后，每个实验条件下的操作时间减少了50%，试剂用量减少了80%。该检测还可与其他细胞功能检测兼容。例如，本文展示了代谢活性检测，可在同一水凝胶中与MMP活性检测同时进行。本方法以包封于不同接种密度下的人黑色素瘤细胞进行验证，以确定适用于该检测工作范围的细胞包封密度。细胞包封24小时后，MMP活性和代谢活性的读数均与细胞接种密度成正比。尽管本文仅使用了一种荧光可降解底物进行演示，但该检测方法可适用于多种水凝胶体系及其他荧光传感器。此类检测为多种应用提供了一个实用、高效且易于操作的3D细胞培养平台。

本实验基于先前开发并表征的3D水凝胶培养系统，该系统经功能化修饰，整合了一种可被基质金属蛋白酶（MMP）切割的荧光传感器8。此处使用的荧光MMP传感器包含一段肽序列GPLAC(pMeOBzl)↓WARKDDK(AdOO)C（↓表示切割位点），该序列此前已优化，可被MMP-14和MMP-11高效切割19。该肽序列在切割位点两侧分别标记了荧光分子（荧光素）和淬灭分子（dabcyl）（图1）。当荧光传感器暴露于相应的蛋白酶时，荧光基团与淬灭基团分离，荧光信号增强。本研究将实验体系从24孔板微型化至96孔板格式，省略了细胞包封过程中的多个步骤，使实验所需时间减少50%。此外，由于每孔水凝胶体积由50 µL减少至10 µL，试剂消耗量减少了80%。同时，使用96孔板可同时检测20个条件（每个条件设三个重复），而24孔板仅能检测12个条件（每个条件设两个重复）。细胞包封过程的示意图见图2<...

本文介绍了一种将细胞包封并培养在功能化聚乙二醇（PEG）水凝胶中的实验方案，该水凝胶含有可被荧光基质金属蛋白酶（MMP）降解的肽段。通过标准的微孔板读数仪，可直接从水凝胶培养物中检测细胞的MMP活性及代谢活性。

三维（3D）细胞培养系统通常比传统的二维（2D）细胞培养系统更接近地模拟体内细胞的响应和功能……

3D 培养使得利用标准生物学检测方法测量细胞功能变得更加困难。本方案通过使用荧光传感器和标准酶标仪，无需额外的样品处理步骤即可检测细胞及体细胞活性。该方案可实现多种新应用，包括高通量药物筛选。此外，可将荧光传感器更换为其他类型的传感器，以检测不同的蛋白酶或细胞功能。实验前需仔细规划，提前完成水凝胶制备的所有计算，并准备好所有仪器和试剂，以尽量缩短细胞处于悬浮状态的时间。首先，配制含1%活性炭处理的胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、10单位/毫升青霉素和10微克/毫升链霉素的检测培养基。请勿使用含酚红的培养基，因其会产生较强的荧光干扰。为制备阳性对照，将细菌胶原酶 I 型以 10 和 1000 微克/毫升的浓度加入检测培养基中。接着，将试剂加入 1.5 mL 离心管中，配制水凝胶前体溶液。每次加入组分后务必涡旋混匀。然后将溶液分装至多个1.5 mL离心管中，用于不同实验条件。为将细胞包埋于水凝胶中，首先制备单细胞悬液：用10 mL PBS洗涤一皿10 cm的A375黑色素瘤细胞。然后，向培养皿中加入0.05%胰蛋白酶，以消化细胞。在37°C和5%二氧化碳条件下孵育培养皿3分钟。孵育结束后，用血细胞计数板对细胞进行计数。接下来，将细胞悬液在314 ×g条件下离心3分钟。吸除培养基，用PBS缓冲液重悬细胞，体积约为最终包封密度的三倍。再次计数细胞，以确保细胞浓度准确。然后，根据所需的接种密度，将PBS中悬浮的细胞加入各管水凝胶前体溶液中，并通过反复吹打混匀。对于对照条件，仅加入PBS并涡旋混匀。接着，将10微升水凝胶前体溶液加入无菌黑色圆底96孔板每个孔的中央。目视检查水凝胶在孔内的位置。在聚合前，可使用移液枪头调整未居中的水凝胶。为使水凝胶前体溶液聚合，将培养板置于强度为4毫瓦每平方厘米的紫外光下照射三分钟。接下来，向所有含有包封细胞的孔中加入 150 µL 检测培养基，并向阳性对照孔中加入 150 µL 胶原酶溶液。向培养板外周孔中加入 150 µL PBS 缓冲液，以减少孵育过程中的蒸发。使用微孔板读数仪在包封后立即（0 小时）测量培养板的荧光强度。选择不透明白色96孔板，设置激发波长为494纳米，发射波长为521纳米的检测程序。随后，将孔板置于5%二氧化碳环境中，37摄氏度孵育18小时。然后，向所有实验组和对照组的每孔中加入代谢活性检测试剂，试剂添加体积比为1:10（v/v）。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育6小时。最后，在包封后24小时测定培养板的荧光强度。选择不透光96孔板方案，以494纳米为激发波长，521纳米为发射波长，检测MMP活性。为测量代谢活性，选择560纳米激发波长和590纳米发射波长。本研究中，当荧光原传感器暴露于相应的蛋白酶时，淬灭剂与荧光团分离，荧光信号增强。对孵育后的水凝胶与细菌胶原酶I型进行荧光检测的结果显示，阴性对照组（无胶原酶）产生的信号最低。尽管当胶原酶浓度达到每毫升1000微克或更高时产生最高的检测信号，但信号此时开始趋于平缓。计算得出的工作范围为每毫升约0.16至474微克胶原酶。在包封后立即检测不同密度包封的A375黑色素瘤细胞系的荧光读数，结果显示在各种接种密度下荧光值均较低，与不含细胞的对照凝胶相似，符合预期。包封后24小时，基质金属蛋白酶（MMP）活性与接种密度呈正比，且当接种密度达到或超过每毫升100万个细胞时，处于工作范围的限值内。A375细胞系的代谢活性检测结果也与细胞接种密度呈正比。通过将MMP活性归一化为代谢活性后，在接种密度大于每毫升200万个细胞时，每个细胞的MMP活性无显著差异。正确的移液技术非常重要。这包括预先润湿吸头，以准确量取黏性溶液。此外，将水凝胶前体溶液置于孔板孔的中央，对于通过酶标仪获得准确测量结果至关重要。为了确定本研究中检测到的基质金属蛋白酶（MMP）活性所涉及的具体MMP种类，可采用蛋白质印迹（western blot）或PCR等表达分析方法。使用活细胞时，必须遵循适当的生物安全程序，采用无菌技术，并在生物安全柜中操作。紫外光具有危害性，应使用防护罩保护操作者，且不得直视光源。

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