在三维水凝胶中测量全细胞基质金属蛋白酶及代谢活性

3D 培养使得利用标准生物学检测方法测量细胞功能变得更加困难。本方案通过使用荧光传感器和标准酶标仪，无需额外的样品处理步骤即可检测细胞及体细胞活性。该方案可实现多种新应用，包括高通量药物筛选。

此外，可将荧光传感器更换为其他类型的传感器，以检测不同的蛋白酶或细胞功能。实验前需仔细规划，提前完成水凝胶制备的所有计算，并准备好所有仪器和试剂，以尽量缩短细胞处于悬浮状态的时间。首先，配制含1%活性炭处理的胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、10单位/毫升青霉素和10微克/毫升链霉素的检测培养基。

请勿使用含酚红的培养基，因其会产生较强的荧光干扰。为制备阳性对照，将细菌胶原酶 I 型以 10 和 1000 微克/毫升的浓度加入检测培养基中。接着，将试剂加入 1.5 mL 离心管中，配制水凝胶前体溶液。

每次加入组分后务必涡旋混匀。然后将溶液分装至多个1.5 mL离心管中，用于不同实验条件。为将细胞包埋于水凝胶中，首先制备单细胞悬液：用10 mL PBS洗涤一皿10 cm的A375黑色素瘤细胞。

然后，向培养皿中加入0.05%胰蛋白酶，以消化细胞。在37°C和5%二氧化碳条件下孵育培养皿3分钟。孵育结束后，用血细胞计数板对细胞进行计数。

接下来，将细胞悬液在314 ×g条件下离心3分钟。吸除培养基，用PBS缓冲液重悬细胞，体积约为最终包封密度的三倍。再次计数细胞，以确保细胞浓度准确。

然后，根据所需的接种密度，将PBS中悬浮的细胞加入各管水凝胶前体溶液中，并通过反复吹打混匀。对于对照条件，仅加入PBS并涡旋混匀。接着，将10微升水凝胶前体溶液加入无菌黑色圆底96孔板每个孔的中央。

目视检查水凝胶在孔内的位置。在聚合前，可使用移液枪头调整未居中的水凝胶。为使水凝胶前体溶液聚合，将培养板置于强度为4毫瓦每平方厘米的紫外光下照射三分钟。

接下来，向所有含有包封细胞的孔中加入 150 µL 检测培养基，并向阳性对照孔中加入 150 µL 胶原酶溶液。向培养板外周孔中加入 150 µL PBS 缓冲液，以减少孵育过程中的蒸发。使用微孔板读数仪在包封后立即（0 小时）测量培养板的荧光强度。

选择不透明白色96孔板，设置激发波长为494纳米，发射波长为521纳米的检测程序。随后，将孔板置于5%二氧化碳环境中，37摄氏度孵育18小时。然后，向所有实验组和对照组的每孔中加入代谢活性检测试剂，试剂添加体积比为1:10（v/v）。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育6小时。最后，在包封后24小时测定培养板的荧光强度。选择不透光96孔板方案，以494纳米为激发波长，521纳米为发射波长，检测MMP活性。

为测量代谢活性，选择560纳米激发波长和590纳米发射波长。本研究中，当荧光原传感器暴露于相应的蛋白酶时，淬灭剂与荧光团分离，荧光信号增强。对孵育后的水凝胶与细菌胶原酶I型进行荧光检测的结果显示，阴性对照组（无胶原酶）产生的信号最低。

尽管当胶原酶浓度达到每毫升1000微克或更高时产生最高的检测信号，但信号此时开始趋于平缓。计算得出的工作范围为每毫升约0.16至474微克胶原酶。在包封后立即检测不同密度包封的A375黑色素瘤细胞系的荧光读数，结果显示在各种接种密度下荧光值均较低，与不含细胞的对照凝胶相似，符合预期。

包封后24小时，基质金属蛋白酶（MMP）活性与接种密度呈正比，且当接种密度达到或超过每毫升100万个细胞时，处于工作范围的限值内。A375细胞系的代谢活性检测结果也与细胞接种密度呈正比。通过将MMP活性归一化为代谢活性后，在接种密度大于每毫升200万个细胞时，每个细胞的MMP活性无显著差异。

正确的移液技术非常重要。这包括预先润湿吸头，以准确量取黏性溶液。此外，将水凝胶前体溶液置于孔板孔的中央，对于通过酶标仪获得准确测量结果至关重要。

为了确定本研究中检测到的基质金属蛋白酶（MMP）活性所涉及的具体MMP种类，可采用蛋白质印迹（western blot）或PCR等表达分析方法。使用活细胞时，必须遵循适当的生物安全程序，采用无菌技术，并在生物安全柜中操作。紫外光具有危害性，应使用防护罩保护操作者，且不得直视光源。