三维水凝胶中全球细胞基质金属蛋白酶和代谢活性的测定

使用标准生物测定，3D培养使得测量细胞功能更加困难。该协议使用荧光传感器和标准微孔板读取器，无需进一步样品处理即可测量细胞和躯体活动。该协议支持许多新的应用，包括高通量药物筛选。

此外，荧光传感器可以与不同的传感器交换，以测量其他蛋白酶或细胞功能。必须提前仔细计划实验，完成水凝胶制备的所有计算，并设置所有设备和试剂，以尽量减少电池悬浮时间。首先，用1%木炭剥离胎儿牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、每毫升青霉素10个单位和每毫升10微克的链霉素准备检测介质。

不要使用酚红色介质，因为酚红色介质具有更多的荧光干扰。为了进行积极的控制，将细菌胶原酶一型添加到测定介质中，浓度为每毫升10微克和1000微克。接下来，通过将试剂添加到1.5 mL管中，准备水凝胶前体溶液。

确保每个组件添加后有涡流。然后根据不同的条件将溶液分成多个 1.5 mL 管。要将细胞封装在水凝胶中，首先用 10 mL PBS 清洗 10 厘米的 A375 黑色素瘤细胞，准备单个细胞悬浮液。

然后，在菜中加入0.05%的三辛，使细胞增平。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育该菜，三分钟。孵育后，用血细胞计计算细胞。

接下来，将细胞溶液在314倍G下离心三分钟。以大约三倍于最终封装密度的三倍，在PBS缓冲液中吸进培养培养介质，重新暂停细胞。再次计算细胞，以确保准确的细胞浓度。

然后，根据所需的播种密度，将PBS中的悬浮细胞添加到水凝胶前体溶液的每个管中，然后通过上下移液混合。对于受控条件，仅添加 PBS 和涡流。接下来，移液器10微升水凝胶前体溶液进入每井中间的无菌、黑色、圆底96井板。

目视检查水凝胶在井中的放置情况。非中心水凝胶可以在聚合前使用移液器尖端重新定位。要聚合水凝胶前体溶液，请以每平方厘米 4 毫瓦的速度将板暴露在紫外线下，为期三分钟。

接下来，将150微升的测定介质添加到所有含有封装细胞的孔中，将150微升的胶原酶溶液添加到正对照井中。在板外孔中加入150微升PBS缓冲液，以减少孵化期间的蒸发。使用微孔板读卡器在零小时测量板的荧光强度，立即进行封装后。

选择具有 494 纳米激励和 521 纳米发射波长的不透明 96 井板协议。接下来，在37摄氏度的2氧化碳中孵育板，18小时。然后添加代谢活性试剂，每井的体积比为1至10，适合所有条件和控制。

在37摄氏度，5%的二氧化碳中孵育板，6小时。最后，测量板的荧光强度在24小时，后封装。选择具有 494 纳米激励和 521 纳米发射波长的不透明 96 井板协议，用于 MMP 活动。

要测量代谢活性，请选择 560 纳米激励和 590 纳米发射波长。在这项研究中，当荧光传感器暴露在适当的蛋白酶中时，淬火剂和荧光团被分离，荧光增加。使用细菌胶原酶类型1对孵育水凝胶进行荧光测量表明，检测信号最低是由负对子产生，没有胶原酶。

当信号开始稳定时，最高检测到的信号产生每毫升1000微克的胶原酶或以上。计算的工作范围约为每毫升胶原酶0.16至474微克。A375黑色素瘤细胞系的荧光读数在封装后封装在一系列密度中，在种子密度中较低，与没有细胞的控制凝胶类似。

封装后 24 小时，MMP 活性与播种密度成正比，播种密度为每 mL 100 万个或大于 100 万个细胞，在工作范围范围内。A375细胞系的代谢活性测量，也与细胞播种密度成正比。通过将MMP活性正常化为代谢活性，在播种密度大于每mL200万细胞时，每个细胞的MMP活性没有显著差异。

正确的移液技术很重要。这包括预润湿提示，以实现精确体积的粘性解决方案。此外，将水凝胶前体溶液居中井内，对于板读卡器实现精确测量至关重要。

要识别有助于此处测量的 MMP 活动的特定 MMP，可以使用表达式检测（如西部印迹或 PCR）。使用活细胞需要适当的生物安全程序、无菌技术和生物安全柜。紫外线是危险的，使用屏蔽来保护用户，并且不要直接看光线。