电刺激室的构建与应用, 促进间充质茎间质细胞体外成骨分化

在这里，我们展示如何使用常见的六壁培养板建立一个电刺激室，以及如何使用它来刺激中质干细胞的骨质分化。该室易于建造，且不昂贵，可多次试验重复使用。经室内电刺激预处理后，中质干细胞可用于改善骨组织工程治疗的结果。

该腔室还可用于研究其他细胞类型和电敏感细胞行为，如迁移、增殖、膜电位变化、凋亡和小心依恋。在六孔板盖中，标记并钻两个直径一毫米的孔，相距25毫米，靠近六口井的外缘。接下来，将铂丝切成12个五厘米长的部分。

手动将每个五厘米的截面弯曲成 L 形，使一端长 3 厘米，另一端长 2 厘米。然后，将镀银的电线切成两个 35 厘米长。将铂丝较长的弯曲端插入钻孔，使一到两毫米的外盖突出。

使用钳子弯曲它。之后，用超导电胶水将铂金丝固定在盖孔中，让它们干燥约六个小时。为了准备阴极，焊接所有六根铂金线从盖子突出的尖端到一根镀银的电线。

要准备阳极，请将剩余的六根铂金导线焊接到其他镀银电线上。随后，在六个阳极阴极铂电极对之间的电路中添加 LED 以确认功能。在每个 LED 下放置一块黑色绝缘胶带，以防止将培养板中的电池暴露在 LED 指示灯下。

接下来，将电线端子块连接器粘合到六井板盖的左上角，将两根镀银的导线连接到输入端子。然后，从第二个六井板盖的左上角切出一个 20 毫米的 20 毫米的方形部分，以容纳第一个盖上的端子块连接器。盖上第一个盖子，配备电极，用第二个盖子盖上，用胶带将它们盖在一起。

将两根标准绝缘铜线的一端连接到导线连接器的输出端子，将另一端连接到香蕉公连接器。按下前面面板上的开关按钮，打开电源。按下按钮 1 激活通道 1。

之后，按按钮四设置电压。将负载输出设置为 2.5 伏。然后按 Enter。

在用E茎处理细胞的当天，在70%乙醇溶液中对电极进行消毒30分钟。然后，在安全柜中的紫外线下干燥它们，再干 30 分钟。在层流罩中，用装有电极的盖子盖住包含培养的 MSC 的六井板，确保电极完全浸入介质中。

然后，将带电池的盖有六井板转移到培养箱中，将其导线连接到电源。接下来，将电源设置为 2.5 伏负载输出，用 E 茎处理细胞一小时。刺激后，断开电源，从培养箱中取出 E 茎室。

在无菌条件下，用标准的六井板盖更换装有电极的盖子。随后，将细胞返回到培养箱，并过夜。首先用 PBS 清洁电极，然后用 70% 乙醇溶液清洁电极。

然后，用细砂纸清洁电极表面积聚的腐蚀产物。连续六天重复E茎处理。在第四天，在应用电刺激之前，在无菌条件下，通过吸入1.5毫升的培养剂，代之以1.5毫升的预热、新鲜的骨源分化介质，来改变培养培养媒介。

连续七天应用电刺激后，再维持培养中的细胞七天，每三到四天交换一次培养。治疗完成后，在显微镜下分析细胞形态变化。评估电刺激对MSC骨源分化的影响，测量钙沉积、碱性磷酸酶活性和骨源标记基因表达，如其他地方所述。

为了评估每毫米电刺激100毫伏对MSC骨源分化的影响，通过评估形态变化和钙沉积，在培养的第14天，通过电刺激治疗的细胞，以及未处理的细胞。在用电刺激治疗的细胞中，细胞形态和钙沉积的显著变化可见7天和14天。在培养的第三天、第七天和第14天对骨源标记基因表达变化进行了详细的分析。

在培养的第七天，RunX2在经过电刺激治疗的细胞中明显高于7天。而Cola1表达明显高于在治疗7天的细胞，测量在培养的第14天。在培养的第三天、第七天和第14天，骨蓬丁的表达在电刺激细胞中显著增加。

Osterix 表达在控制细胞中一直不存在，在暴露于电刺激的细胞中，只在培养的 7 天和 14 天时才看到。电刺激室相对容易建造。但是，在处理铂金电线时以及清洁和消毒电极时，必须特别小心。

单独或安装在脚手架材料上的预处理电的细胞可以植入动物模型，以研究电刺激的正效如何持续在体外。这项技术提供了一个简单而有力的工具，用于研究电刺激调节细胞功能的机制。这种知识可以在再生医学细胞中提供。