一种利用深度测序辅助的裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe自发抑制子筛选方法

本方案描述了一种简单且高效的抑制子筛选方法，用于鉴定裂殖酵母中具有生长缺陷的突变体中的抑制子突变。传统的诱变方法使用有毒化学物质或紫外线，可在单个细胞内产生多个突变。相比之下，本方案无需使用诱导突变的方法，即可在单个细胞中富集单一的抑制子突变体。

按照文本方案中所述，首先进行菌株构建与准备。向96孔聚苯乙烯微孔板的每个孔中加入200微升液体培养基。使用无菌接种工具，取少量已制备的菌落，并将每个菌落分别悬浮于含有液体培养基的独立孔中。

在含有200微升相同培养基的每行微孔板中设置一个空白孔。现在，在连接自动微孔板读数仪的微孔板读数软件上建立检测程序。将温度设置为30摄氏度，并设置一个持续24小时的动力学程序，读数频率为每2分钟一次。

这将使每孔在24小时内获得总计721次读数。将振荡设置为连续快速轨道振荡。将光学读数设置为在600纳米波长下测量光散射，以测定光密度，并将读光模式设置为从板底部读取。

24 小时后，记录最终的空白光密度读数，并使用文本方案中的公式确定将每个样品稀释至光密度为 0.1 所需的体积。为了批量处理各实验孔中用于稀释的体积，可将酶标仪软件中的数据导出，并使用电子表格软件将相同的公式作为函数插入。每隔 24 小时，使用与第 0 天相同的培养基，根据该公式将每个样品稀释至光密度为 0.1。

务必使用公式将所有孔的稀释浓度调整至光密度为0.1，包括那些生长缺陷可能已开始出现部分恢复的孔。保存每天生成的所有生长曲线。

注意任何表现出生长速度增加的单个菌落，其判断依据为最终光密度显著高于同基因背景的其他菌落群体，或其生长曲线与野生型菌落相似。该检测通常需要约7至14天。所有步骤均须在无菌条件下进行。

在酶标仪检测的最后一天，一些液体培养物的生长速率明显恢复，可能是由于获得了抑制突变，从而缓解了亲本突变的表型。为保存表型恢复的培养物，将250 µL液体培养物转移并混匀至含有250 µL 50%甘油的冻存管中。用液氮速冻细胞，并将菌株长期保存于-80 °C环境中。

为了确认抑制突变是一种可遗传的遗传元件，可采用标准的遗传杂交方法，将您选定的突变P细胞与选定的突变S细胞进行杂交。当两种具有互补交配型的单倍体细胞混合并处于氮饥饿条件下时，它们可形成合子，进而发生孢子形成，产生包含四个孢子的四分体。在减数分裂过程中，亲本的遗传物质将按照孟德尔遗传规律发生分离。

孢子形成后，可将同一四分体中的单个孢子分离，并在培养板上垂直观察到形成四个独立的菌落。使用显微操作针将孢子逐个均匀地放置在培养板上。分离后，将细胞置于30°C培养箱中培养数天，直至菌落出现。

如果抑制突变是一种可遗传的遗传元件，则该杂交应产生四分体，其中两个菌落具有亲本菌株的生长缺陷表型，另外两个菌落具有抑制菌株的恢复性生长速率。从同一遗传杂交中挑选三个具有抑制表型的菌落和三个具有亲本表型的菌落，按照文本方案中的详细步骤进行基因组DNA提取和测序。随后按照文本中的说明进行生物信息学分析，以鉴定抑制突变。

使用酶标仪对单个菌落的生长曲线在初始时间点及随后六天内进行连续监测记录。正如预期，野生型菌落在整个实验过程中其生长曲线未表现出明显变化。值得注意的是，四个具有 elf1 基因缺失背景的菌落以及一个 fal1 基因缺失的菌落，其生长特性发生了显著转变，从生长缓慢转变为不同程度的生长状态，接近于野生型菌落的生长水平。

引人注目的是，所有 clr6 突变体在实验结束时均表现出一致的表型恢复，生长速度加快。通过位点定向诱变的标准实验方案，实验室中重新构建了两个鉴定出的非同义突变，即 cue2 突变和 rpl2702 突变。将 Cue2 elf1 双突变体和 rpl2702 elf1 双突变体分别与相应的 elf1 缺失突变株进行杂交。

遗传杂交实验表明，所鉴定的抑制突变能够有效抑制elf1基因缺失突变体生长缓慢的表型，且具有可遗传性。在对96孔板进行日常稀释时，必须将所有孔稀释至相同浓度，以避免出现人为的生长恢复现象。该方法能够以高通量方式分离抑制突变，从而加速发现数百个在裂殖酵母及其他微生物中尚未被充分表征的基因。

该方法可用于分离所有具有导致生长缺陷突变且能在液体培养基中大量培养的微生物的抑制子。在裂殖酵母中鉴定抑制子突变可能有助于发现酵母与人类之间高度保守通路中与疾病相关基因，尤其是在涉及与人类通路重叠的情况下具有潜在意义。