Name: 自由生育小鼠的长期感觉冲突 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 学习在自由行为小鼠中建立持续性感觉冲突的方法，用于研究长期学习机制。该方案通过头部固定装置造成视觉与前庭输入失配，结合体内外实验降低研究成本，为神经科学领域提供标准化研究手段。

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感谢 Patrice Jegouzo 在头部装置和头固定装置的开发与生产方面提供的帮助。我们还感谢 P. Calvo、A. Mialot 和 E. Idoux 在此前版本装置及 VVM 方案开发过程中给予的帮助。
本工作由法国国家空间研究中心（Centre National des Etudes Spatiales）、法国国家科学研究中心（CNRS）和巴黎笛卡尔大学（Université Paris Descartes）资助。J. C. 和 M. B. 获得法国国家研究局（ANR-13-CESA-0005-02）的支持。F. F. B. 和 M. B. 获得法国国家研究局（ANR-15-CE32-0007）的支持。

所有动物实验均遵循巴黎笛卡尔大学的动物管理规定。
1. 装置组装
注意：本方案中使用的装置是一种头盔状结构，通过植入的头部固定杆固定在小鼠颅骨上。
<ol>
	<li>使用3D打印机和白色不透明聚乳酸（PLA）塑料，根据此处提供的设计和规格文件（见材料表）打印装置和头固定柱。 
	注意：装置的尺寸见图1，头固定柱的尺寸见图2。</li>
	<li>需测试条纹装置以及假处理装置（图2A11）。为获得条纹模型，使用黑色指甲油在装置外表面绘制宽度为3 mm的垂直条纹。假处理条件无需对打印的装置进行任何修改。</li>
</ol>
2. 头部固定装置植入手术
本方案中使用的所有材料均在补充信息的材料列表中有详细说明。步骤 2.7–2.9 使用植入试剂盒中提供的生物材料（见材料表）。请确保使用无菌器械，并将手术和恢复区域分设在不同区域。熟练掌握后，植入操作约需 30 分钟。
<ol>
	<li>手术开始前30分钟，为镇痛目的，皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg），然后将动物放回其原饲养笼中。 
	注意：布托啡诺的镇痛作用可持续约12小时，远超过手术结束时间。根据我们的经验，小鼠不会表现出与此操作相关的任何痛苦迹象&#160;，但建议在术后24小时追加一次0.05 mg/kg剂量的布托啡诺。&#160;</li>
	<li>使用2.5%-3%异氟烷气体在麻醉舱内对动物进行麻醉。等待3分钟后，通过观察舱内小鼠的呼吸情况和是否无活动来判断其是否已充分麻醉。将小鼠转移至带有加热垫的手术台上的鼻罩中，并通过趾间夹捏测试确认无回缩反射后，将异氟烷浓度下调至1.5%。</li>
	<li>使用电动剃刀剃除小鼠头部的毛发。为获得无菌环境，先用碘溶液擦拭剃毛区域，随后用70%酒精擦拭，重复此过程两次。</li>
	<li>在头部皮下注射盐酸利多卡因（2%，2 mg/kg）以实现局部麻醉，并等待5分钟使其起效。为防止因眼睛干燥造成损伤，使用眼科用兽用软膏覆盖小鼠的眼睛。</li>
	<li>用一对钝头镊子夹住小鼠头后部的皮肤，再用钝头剪刀（或手术刀）做一条长约1.5 cm的纵向切口，以暴露颅骨。</li>
	<li>借助手术刀轻刮骨膜。注意不要用力过猛，因为如果颅骨开始轻微出血，可能会影响头固定柱的稳固固定。</li>
	<li>在颅骨中央滴加一滴绿色活化剂。这可通过增加骨通透性来增强骨水泥的固定效果。</li>
	<li>准备骨水泥：将一勺（植入套件中提供）聚合物与五滴单体和一滴催化剂混合。使用刷子将足量的水泥混合物涂抹于颅骨上的人字缝（lambda）与前囟（bregma）标志之间；</li>
	<li>迅速以从人字缝向囟门方向滑动的动作将头固定柱放置在水泥上。放置头固定柱后，在其下部周围再次涂抹更多水泥，以确保其牢固粘附于颅骨。为保证固定效果，务必充分涂抹水泥，并在继续下一步操作前确保其已完全干燥。 
	注意：采用此固定方法后，头固定柱不会脱落，可支持长期、重复的实验；在我们的操作中，头固定柱脱落率&#60;10%。</li>
	<li>按粉末与液体的比例配制树脂混合物，使其达到均匀顺滑的质地。将树脂涂布于之前涂抹骨水泥的区域以及头固定柱周围，以保护其表面。</li>
	<li>等待3分钟使树脂干燥，然后使用单丝缝线缝合耳后部的皮肤。用棉签在手术区域涂抹稀释后的碘溶液（10%-20%）。 
	注意：确保皮肤未与树脂粘连。</li>
	<li>关闭麻醉装置，并将动物置于红色保温灯下，以防低体温。在笼底放置湿润的食物和&#160;水凝胶或其他凝胶状水源。在动物恢复意识前不得离开其无人看管。一旦动物完全从手术中恢复（通常在术后30分钟至1小时内），立即将其放入由三至四只小鼠组成的群体笼中，以促进社会互动。</li>
</ol>
3. 装置固定
<ol>
	<li>手术后 48 小时，将定制的头部装置固定在头基座上。
	<ol>
		<li>使用一对 1.2 mm 的螺丝和螺丝刀（1.3 mm 六角），将条纹装置上的孔与头基座上的孔对齐，放入螺丝并拧紧固定。为实现假手术条件，将装置倒置，使装置背面（图 1A）朝向前脑方向，将装置上的孔与头基座上的孔对齐。 
		注意：建议由两名操作人员完成此步骤，一人用单手小鼠固定器握住小鼠，另一人将装置固定到头基座上。若由单人操作固定，可在小鼠处于气体麻醉状态下放置装置。</li>
		<li>检查装置是否牢固固定，无法被动物自行移除，并确认装置未直接压迫小鼠鼻部，以免引起疼痛、呼吸困难或皮肤损伤。 
		注意：还需确保装置对称地安装在小鼠面部，使双眼完全被头部装置覆盖。检查动物是否未表现出任何异常疼痛或痛苦的迹象。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装置留在小鼠身上 14 天。</li>
</ol>
4. 动物护理与监测
<ol>
	<li>回到笼中后，小鼠会表现出某些行为异常。起初，动物可能会呈俯卧状态，并尝试用前肢移除装置，但这种行为通常在1小时后停止。在接下来的数小时内，动物通常会出现难以在笼内定向以及取食和饮水困难的情况。因此，在植入后的48小时内应密切监测小鼠，并将食物和水直接放置在笼底，以方便其获取。</li>
	<li>在实验方案进行期间持续记录小鼠的体重。在植入后立即称量小鼠体重，之后每隔24小时称量一次。需特别关注佩戴条纹装置的小鼠，因为它们在前48小时内通常会出现体重下降（1–2 g），但在此初始阶段过后即恢复正常的增重速度（参见 图2B11).</li>
	<li>两天后，小鼠应恢复其正常的生理功能。根据动物设施中所使用的系统，设备可能会妨碍动物接触食物和水。应确保动物在进食和饮水时无不适，或相应调整供给系统。 
	注意：动物佩戴该装置数天后产生的头部活动范围不受该装置影响（参见 图211）（即., 产生的头部运动范围仍与自然头部运动相似。</li>
	<li>为进一歩确保小鼠的福利，需进行每日监测并应用定性评分量表（表1在整个实验方案实施期间的幸福感。</li>
	<li>如果出现以下一种或多种情况，需将小鼠从当前实验方案中剔除：
	<ol>
		<li>总分超过4分的小鼠必须立即从实验中剔除（参见 表1）无论评分如何，若小鼠在6天后仍未恢复至初始体重，必须终止实验。</li>
		<li>如果头固定装置未正确安装，例如触碰时头杆晃动或有部件开始脱落，则会导致头杆从鼠头脱离，进而中断学习过程，因此需要每日进行检查。</li>
		<li>当小鼠在实验流程的任何阶段发生头固定装置脱落时，由于该脱落会伴随颅骨出血，重新植入手术的成功率极低，不建议尝试。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 移除装置
<ol>
	<li>学习期结束后（本方案中为14天），按照与固定装置相同的说明移除设备（第3节）。一旦移除装置，立即对小鼠进行实验测试，例如视频眼动图检测，或例如 体外 如先前所述的电生理学方法11. 
	注意：一旦移除装置，小鼠将重新暴露于标准的、视觉无障碍环境中。因此，应在移除装置后立即开展旨在检测该装置学习效应的实验。</li>
</ol>
6. 眼动视频记录会话
注意：视频眼动记录实验用于记录动物在黑暗中旋转时产生的眼动（前庭-眼反射，VOR），或在动物静止时通过旋转其周围环境来诱发的眼动（视动反射，OKR）。每只小鼠均在适应性处理前后分别进行这两种反射的测试。有关视频眼动记录装置的更多细节，请参见先前发表的报告12,13。&#160;为了使小鼠适应限制性记录条件，在开始记录的前一天，将动物置于转台中央的管子上，持续10分钟，期间不进行任何测试。
<ol>
	<li>通过将螺钉插入头固定装置，将小鼠固定在转台上。在动物周围放置一个屏幕穹顶，并关闭房间内除视动投影仪以外的所有灯光。 
	注意：视频眼动图记录需要动物保持静止且眼睛睁开。如果小鼠不能自主保持眼睛睁开，或在记录过程中眼部状况恶化，请中断记录会话，并将动物放回笼中。可在至少休息12小时后再次尝试。</li>
	<li>启动全视野OKR刺激（白点图案投影），并在顺时针和逆时针两个方向上以多种不同速度进行记录。记录一结束，立即移除穹顶。</li>
	<li>为了能够在完全黑暗中记录前庭眼反射（VOR），在眼睛上滴加一滴2%匹鲁卡品14。等待至少5分钟使其起效，然后用棉签轻轻擦除。匹鲁卡品可使瞳孔在整个测量过程中保持恒定的收缩状态，从而实现对黑暗中眼动的准确定量分析。</li>
	<li>关闭房间内所有灯光，并在转台上加盖一个盒子，使动物处于完全黑暗环境中。通过围绕垂直轴进行不同频率和/或不同速度的正弦角旋转，启动水平前庭眼反射（VOR）。</li>
	<li>记录会话结束后，将小鼠放回配有红外灯适当照明的笼子中。热量可防止因匹鲁卡品对小鼠身体产生的继发性血管扩张效应所导致的低体温。 
	注意：由于动物处于束缚状态，单次记录会话不得超过90分钟。如需进行额外测试会话，两次会话之间应让动物休息24小时。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述的长期感觉扰动由自由活动小鼠中产生的视觉-前庭不匹配所引起。为植入小鼠佩戴14天的装置，需使用市售手术套件进行一次简单且短暂的手术。小鼠在头颅固定装置植入术后不到1小时内即可恢复，且未表现出任何相关痛苦迹象。随后，在本方案的应用示例中，采用视频眼动图技术测量前庭眼反射（VOR）和视动眼反射（OKR）。然而，这种由装置诱导的长期学习方案也可应用于多种实验，例如体外电生理学1、神经元成像以及各种行为检测。该技术的开发理念受到在人类和猴子中使用的棱镜方法的启发。然而，该技术有所不同，因为它损害而非改变视觉，因此（在当前形式下）构成一种极端的视觉-前庭不匹配情况。作者认为，所提供的技术信息可能有助于设计类似棱镜功能的装置版本，或进一步开发特定特征限制性装置16。
由轻质（0.9 g）聚乳酸塑料制成，该头部装置设计为适配年轻成年小鼠的头部，可保护其吻部，同时在侧面留有足够空间，使动物能够进行理毛行为。该装置的前部暴露吻端，以允许进食和理毛行为的正常进行。装置呈轻微不透明状，使动物无法清晰感知周围环境，但仍能接受光强刺激。条纹组与假手术组的植入均经过测试，以确保所观测到的效应主要源于条纹装置在自主运动期间产生的高对比度视觉信号所引起的视-前庭不匹配，而非本体感觉改变（即, 设备施加于小鼠头部和颈部的重量。
实验结果显示，佩戴条纹装置的小鼠在学习期后前庭眼反射（VOR）增益显著降低了50%；然而，不同个体间的绝对增益值仍可能存在差异。假手术组小鼠未表现出VOR增益的显著变化，表明VOR的降低是由感觉冲突引起，而非运动功能障碍所致。此外，幼年小鼠（&#60;P26）的VOR和视动性眼震（OKR）增益值低于成年动物17。因此，在实验设计中必须考虑动物年龄因素。最后，前述的小鼠排除标准（第4.5节）是至关重要的步骤，应严格遵循，以确保动物福利并获得可靠的结果。
与其它类型的VOR/OKR适应性训练方案相比，本方案的一个优势是在学习阶段为实验人员节省了大量时间。迄今为止，小鼠的VOR适应性研究通常采用头部固定的方式，并在旋转转台上对动物进行训练6,8,18,19，这种方法耗时较长，尤其当需要训练大量动物时更为明显。本方案可同时训练多只动物，显著节省时间。此外，在这些经典实验中，训练通常每天限制在1小时以内，导致存在较长的潜在遗忘期，从而使适应过程成为学习与遗忘交替进行的迭代过程，具有不同的动力学特征20。而本方案中，装置的头部固定设计可实现持续不间断的学习。另一个优势在于，由于学习阶段是在动物自由活动、头部不受限的条件下产生的，小鼠能够通过主动产生的多种自然头部运动进行学习。而在经典方案中，动物被头部固定后被动地随转台旋转，因此学习仅发生在特定刺激条件下（单一频率、单一速度）21，无法反映自然状态下的头部运动范围。值得注意的是，前庭系统在运动由个体主动产生或外界施加时，对运动的编码方式有所不同10；因此，这两种情况下触发的细胞机制也可能存在差异。
总体而言，所述方法适用于对自由活动的小鼠在发生视觉冲突和/或视-前庭不匹配后出现的长期感觉适应进行体内/体外联合研究。感觉冲突是运动病的已知诱因，而运动病研究领域近年来已开始广泛应用小鼠模型22,23。最近的研究表明，使用该装置引起的感觉增益适应可在小鼠暴露于诱发性刺激时提供对运动病的保护作用15。因此，本方案可用于揭示感觉冲突适应背后的细胞机制，并有助于开发抗运动病的治疗方法。

感觉冲突（例如视觉冲突）存在于日常生活中，比如佩戴眼镜时，或在整个生命周期中（发育成长、感觉敏锐度变化等）。由于神经环路解剖结构明确、感觉输入易于控制、运动输出可量化，并且具有精确的量化方法1，凝视稳定反射已被广泛用作多种物种中运动学习的模型。在人类和猴子中，前庭-眼反射（VOR）的适应性通常通过让受试者佩戴棱镜数天来进行研究2,3,4,5。由于啮齿类动物模型能够结合行为学与细胞水平实验，我们开发了一种新方法，利用类似头盔的装置在自由活动的小鼠中建立长期的感觉冲突。该方法借鉴了人类和非人灵长类的研究范式，通过诱发前庭输入与视觉输入之间的不匹配（即视-前庭不匹配，VVM），导致VOR增益下降。
在啮齿类动物中诱导前庭眼反射（VOR）增益下调适应的经典方案，通常包括将头部固定的动物置于转台上，同时使视觉场与之同相旋转。这种范式会引发视觉-前庭冲突，导致VOR产生反效果。长期适应方案则需在连续数天内重复执行该程序6,7,8。因此，当需要测试大量动物时，传统方法耗时极长。此外，由于动物头部被固定，学习过程主要局限于单一频率/速度，且训练呈不连续性，中间穿插着持续时间不一的试验间间隔6。最后，经典方案采用的是被动学习模式，因为前庭刺激并非由动物自主运动主动产生，而这一因素对前庭信息处理具有显著影响9,10。
上述实验限制被本文介绍的创新方法所克服。所需手术方法简单，所用材料均可从商业途径 readily 获得。唯一依赖较昂贵材料的部分是行为量化；然而，该方案的基本原理可用于任何实验，从in vitro研究到其他学习行为研究。总体而言，通过在数天内诱导暂时性视觉障碍和视-前庭冲突，该方法可轻松应用于任何涉及感觉干扰或运动学习的研究。

<table><tbody><tr><td>3D 打印机</td><td>Ulimaker, USA</td><td>S5</td><td></td></tr><tr><td>钝头剪刀</td><td>FST</td><td>14079-10</td><td></td></tr><tr><td>Catalyst V</td><td>Sun Medical, Japan</td><td>LX22</td><td>Parkell 生物材料，Kit n&amp;deg;S380</td></tr><tr><td>Dentalon Plus</td><td>Heraeus</td><td>37041</td><td></td></tr><tr><td>眼动追踪系统及软件</td><td>Iscan</td><td>ETN200</td><td></td></tr><tr><td>绿色活化剂</td><td>Sun Medical, Japan</td><td>VE-1</td><td>Parkell 生物材料，Kit n&amp;deg;S380</td></tr><tr><td>单体</td><td>Sun Medical, Japan</td><td>MF-1</td><td>Parkell 生物材料，Kit n&amp;deg;S380</td></tr><tr><td>Ocrygel</td><td>TvmLab</td><td>10779</td><td>眼科兽用软膏</td></tr><tr><td>聚合物 L 型透明（粘固剂）</td><td>Sun Medical, Japan</td><td>TT12F</td><td>Parkell 生物材料，Kit n&amp;deg;S380</td></tr><tr><td>Sketchup</td><td>Trimble</td><td></td><td>用于生成设备可打印设计文件的 3D 建模软件</td></tr><tr><td>转台</td><td></td><td></td><td>非市售产品</td></tr></tbody></table>

自由活动小鼠中的长期感觉冲突

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

长期感觉冲突方案是研究运动学习的宝贵手段。本方案通过使小鼠持续暴露于视觉与前庭输入之间的感觉不匹配，为研究小鼠的长期学习提供了稳定的实验条件。小鼠头部固定佩戴装置，在饲养笼中自由活动期间持续经历这种感觉冲突。因此，该方案可便捷地实现对视觉系统及多感觉整合在较长时间尺度上的研究，而这种研究在其他条件下难以实现。除了降低在自然行为小鼠中开展长期感觉学习实验的成本外，该方法还便于结合体内（in vivo）与体外（in vitro）实验。在本研究示例中，采用视频眼动记录技术量化前庭眼反射（VOR）和视动眼反射（OKR）在学习前后的变化。暴露于这种长期视觉-前庭感觉冲突的小鼠表现出明显的VOR增益下降，但OKR变化较小。本文详细报告了装置组装、动物护理及反射测量的具体步骤。

以下图示展示了小鼠佩戴条纹装置或假装置进行为期两周适应性方案后的实验结果。图3展示了记录过程中观察到的原始轨迹示例。通过比较轨迹可见，VVM方案后VOR反应减弱（图3A，条纹装置佩戴前 vs. 佩戴后）。假装置组小鼠在适应性处理后的VOR保持不变（图3A，假装置佩戴前 vs. 佩戴后）。佩戴条纹装置的小鼠其OKR（图3B）与VVM方案前以及假装置组小鼠相比无明显差异。图4展示了在0.5 Hz固定频率和40度/秒条件下，条纹装置组与假装置组小鼠在VVM方案前后平均VOR增益的量化示例。佩戴条纹装置后小鼠的增益显著降低，而假装置组小鼠的增益无显著变化。不同速度/频率下VOR减小效应的研究结果已有文献报道（Carcaud 等11 和 Idoux 等15）。
<img alt="圆柱形结构的设计与尺寸示意图，显示横截面测量值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：头部装置的尺寸示意图，单位为毫米。视图：(A) 后视图，(B) 侧视图，(C) 底视图，以及 (D) 俯视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="机械部件示意图，静态平衡，尺寸为3x3x1.6，孔距为2.6。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：带尺寸标注的头固定装置示意图（单位：毫米）。 在植入手术中固定该轻质（0.2 g）聚乳酸塑料头固定装置，可在视频眼动图记录期间将适配装置锁定至小鼠头部，并将动物固定于转台上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="前庭眼反射（VOR）和视动性眼反应（OKR）图；动态眼动追踪分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：VOR和OKR刺激期间眼动的原始轨迹示例。（A，左）左图：在0.5 Hz、40 °/s条件下进行的VOR；（B，右）以10 °/s恒定速度顺时针方向进行的视动性刺激（黑线），分别显示佩戴条纹状或假性（紫色）装置前（绿色线）和佩戴后（黄色线）的结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="VOR与OKR增益比较图表；条纹条件与假刺激条件在14天内的数据分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图 4：条纹状或假装置适应后的前庭眼反射（VOR）和视动性眼反射（OKR）增益平均值示例。 增益根据条纹装置（n = 10）和假手术装置（n = 6）在不同刺激条件下的时间（天）进行绘制 40°/秒 和 0.5 赫兹用于前庭眼反射（左侧），以及 10 °顺时针方向用于OKR（右眼）。在时间尺度上，“之前”日表示适应前的前一天，“第0天”表示移除装置的当天。误差线代表标准差，***p &lt; 0.001，无显著性差异。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>评分</td>
			<td>体重变化</td>
			<td>外观表现</td>
			<td>行为</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>无变化或体重增加</td>
			<td>正常</td>
			<td>无痛苦迹象，活动正常</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>体重减轻 &lt;10%</td>
			<td>缺乏理毛行为</td>
			<td>活动能力受损或笼内定位障碍</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>体重减轻 10%-20%</td>
			<td>脱水</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>体重减轻 &gt;20%</td>
			<td>伤口</td>
			<td>神经性抽动（如抓挠、啃咬）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：健康状况评估的定性评分标准。 列出了在实验过程中需评估的各项定性参数。体重变化、外观和行为三项评分的总和不应超过4分。
补充文件 1. Device.stl。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/Device.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2. Headpost.stl。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/Headpost.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案通过让小鼠长期佩戴固定装置，产生持续的感觉冲突，适用于研究长期学习的实验。小鼠在饲养笼中自由活动时，视觉与前庭输入之间会持续存在感觉不匹配。

长期感觉冲突方案是研究运动学习的宝贵手段。本方案可产生持续的感觉冲突，用于……

本实验方案的总体目标是为自由活动小鼠的长期学习研究建立一种持久的感觉冲突。该方法降低了感觉学习实验的成本和时间，便于结合体内与体外实验。在确认麻醉小鼠对脚趾夹捏无反应后，使用一对钝头镊子夹住其头部后方的皮肤，并用剪刀做一个1.5 cm的纵向切口以暴露颅骨。用手术刀轻轻刮擦骨膜，并在颅骨中部滴加一滴绿色活化剂以增加骨组织通透性。随后，取一勺植入套件中的聚合物，与五滴单体和一滴催化剂混合，将足量的水泥混合物涂抹于颅骨的枕点（lambda）与冠点（bregma）之间。采用从枕点向冠点拂刷的动作，迅速将头固定柱放置于水泥上，并在固定柱的下部周围重新涂抹额外的水泥，以确保头固定柱牢固地粘附在颅骨上。在水泥干燥的同时，将树脂粉末与树脂液体混合至均匀一致的质地，并将所得树脂混合物涂于已干燥的水泥表面及头固定装置周围。待树脂干燥三分钟后，使用Vicryl 4-0缝线缝合耳后皮肤，并用棉签将10%至20%的碘溶液涂抹于切口处。随后将动物置于红光下，持续监测直至完全恢复。手术后48小时，将条纹装置上的孔与头固定装置上的孔对齐，使用1.3 mm六角螺丝刀和两枚1.2 mm螺丝将装置固定在头固定装置上。我们建议在第二名操作人员协助下将装置固定到头固定装置上，以避免头固定装置被撕脱或动物被螺丝刀损伤。为设置假手术对照条件，需将装置倒置，使装置背面朝向前脑方向，并将装置上的孔与头固定装置上的孔对齐。确认设备已牢固固定，不会被动物自行移除，并且设备不会直接对鼻部施加压力，以免引起疼痛、呼吸困难或皮肤损伤。由于小鼠在佩戴设备的最初48小时内可能出现某些行为异常，因此在此期间应密切观察动物状况，并提供易于获取的食物和饮水，直至动物适应设备。在植入设备后立即称量小鼠体重，之后每24小时称重一次，直至实验结束，需特别关注佩戴条纹设备的小鼠。为了记录装置适配动物的感觉反应，将第一只小鼠通过拧入头固定杆的螺丝固定在转盘上，并在动物周围放置一个屏幕穹顶。关闭房间内除光遗传学投影仪以外的所有灯光，然后以顺时针和逆时针两个方向的多种不同速度，开始全视野刺激条件下的光遗传反射记录。记录一结束，立即移除穹顶并打开灯光。为了在完全黑暗中记录前庭-眼反射，将一滴2%的匹鲁卡品滴入动物的眼睛，并等待至少五分钟，然后用棉签轻轻擦去药膏。再次关闭所有灯光，并将一个盒子罩在转台上，以确保动物处于完全黑暗的环境中。在开始水平前庭-眼反射测试之前，使用围绕垂直轴的不同频率和/或不同速度的正弦角旋转。当第二次记录会话结束后，将小鼠放回笼中，并在红外灯下进行监测，直至小鼠完全从匹鲁卡品的继发性血管扩张效应中恢复。在佩戴假装置或条纹装置两周后，假装置组小鼠的前庭眼反射反应在适应后保持不变，而佩戴条纹装置的小鼠则表现出显著受损的反射反应。在视觉-前庭不匹配方案前后，于固定频率0.5赫兹和40度/秒条件下量化平均前庭眼反射增益，结果显示佩戴条纹装置的小鼠增益显著降低，而假装置组小鼠未表现出明显的增益变化。然而，佩戴条纹装置的小鼠的视动反射与其在视觉-前庭实验方案实施前的反射情况以及假手术动物所表现出的反射情况相当。务必每天监测小鼠，确保装置在小鼠身上位置正确，且不妨碍其日常活动。在此操作之后，可进行体外电生理记录或神经元成像，以鉴定鞍区适应机制，或开展行为学检测，以研究不同的反射输出。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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