平滑肌细胞谱系示踪小鼠中晚期动脉粥样硬化病变的细胞组成定量分析

本方案有助于研究人员通过免疫荧光染色建立标准化的实验流程，以对相似群体进行表型特征分析。利用该技术，研究人员可严格分析复杂疾病组织的相似组成，并对目标细胞类型的表型进行定性和定量分析。本次实验操作由本实验室的技术员 Sidney Mahan 演示。

为准备获取动物的头臂动脉，沿中腋线切开胸腔至胸骨，注意不要损伤腹腔组织。注意不要损伤心脏和肺部，沿中腋线在胸腔进行两处切口。然后切开膈肌，以部分暴露心脏。

为进行小鼠灌注，安装重力灌注系统，使灌注液的压力相当于小鼠平均血压，以确保灌注过程稳定并维持血管形态。随后，用5毫升室温磷酸盐缓冲液（PBS）、10毫升4%室温多聚甲醛以及额外5毫升室温PBS对动物进行灌注。将23或25号蝶形针连接至重力灌注系统，并先用PBS流经针头以排出管路中的空气，然后再将针头插入左心室。

固定针头后，使用虹膜剪在右心房处做一个小于两厘米的切口。将目标组织收集到新鲜的4%多聚甲醛中。为暴露头臂动脉，使用剪刀沿胸骨正中线切开胸骨柄，并用镊子拉开肋骨两侧，充分打开胸腔。

接下来，将动物置于解剖显微镜下，以部分观察颈总动脉，使用精细镊子分离肌肉、结缔组织和脂肪，直至右侧颈总动脉、无名动脉、锁骨下动脉分叉处及主动脉弓完全从周围的结缔组织和脂肪中清理并分离出来。随后，用镊子夹住右侧颈总动脉分叉下方，并在镊子上方做第一处切口。继续保持夹持颈总动脉，通过锁骨下动脉做第二处切口，最后在无名动脉两侧的主动脉弓处完成第三和第四处切口。

随后，收集其他感兴趣的血管组织，并将头臂动脉及其他组织置于4%多聚甲醛溶液中，室温下固定过夜。对于头臂动脉的免疫荧光染色，使用切片机对石蜡包埋的组织样本进行连续切片，每片厚度为10 µm，直至通过光学显微镜确认已切至主动脉弓区域并可见头臂动脉。调整组织块的方向，使其完全垂直于切片机刀片，每张玻片上连续切取三片厚度为10 µm的头臂动脉组织切片，直至达到锁骨下动脉分叉处为止。

当收集完所有切片后，在通风橱中用二甲苯浸洗组织样本两次，每次五分钟，随后按所示进行五分钟的乙醇梯度浸洗，再用去离子水浸洗两次，每次五分钟。接着，根据标准操作流程将载玻片置于抗原修复液中孵育，并在微波炉中加热20分钟。室温下冷却一小时后，使用疏水笔围绕每个组织切片区画圈。

在室温下用封闭缓冲液封闭非特异性结合位点，孵育一小时。孵育结束后，在4°C条件下，用目标一抗混合物或同型匹配的IgG对照抗体对组织样本避光孵育过夜。次日早晨，将切片用PBS洗涤三次，每次五分钟；随后加入合适的荧光标记二抗混合物以及DAPI，在室温下孵育一小时，以实现对细胞核的染色观察。

然后，使用适用于荧光显微镜的封片剂将盖玻片封固在载玻片上。对于标记组织切片的共聚焦显微镜成像，需利用经IgG对照和一抗染色的切片来设定每个独立通道的检测器灵敏度、激光功率和偏移值。接着，设定z轴层扫采集的上限和下限位置，并确定成像的层厚及层数。

当所有图像采集完成后，在 ImageJ 中打开图像，打开通道工具面板，并对不同的染色通道进行伪彩着色。合并颜色通道，所有通道应在同一图像上可见。

在通道工具面板中打开或关闭各个颜色通道，右键单击计数图标以选择多点工具。双击计数图标可打开点工具面板，并选择用于计数细胞的标记类型和大小。勾选“显示全部”，并在通道工具面板中仅开启 DAPI 通道。

然后，选择计数通道零，点击需要标记的单个细胞核，并滚动浏览z轴层叠图像，以计数感兴趣区域内所有被染色的细胞核。定量的单细胞事件数量将在下方的点工具面板中显示。当所有细胞核均被标记后，开启另一个染色通道，并选择计数通道一，标记那些显示DAPI与抗体染色共定位的细胞。

对于细胞质染色，应选择在细胞核全层深度范围内、细胞核周围均有染色信号的细胞，必要时需检查多个z轴层扫描图像。结果可表示为染色阳性细胞数占DAPI阳性细胞总数的比例，或表示为感兴趣区域内每单位面积的细胞数量。如示例所示，使用靶向表型标志物的抗体进行免疫荧光染色，可同时获取各单个标志物的染色图像、微分干涉相差图像，从而界定感兴趣区域，用于单细胞计数。

随后可使用 ImageJ 对单个细胞进行计数，以确定不同平滑肌细胞来源群体的丰度。例如，对这些代表性横切面中纤维帽区域的单细胞计数分析显示，在经抗 IL-1β 抗体处理的小鼠与经同型匹配的 IgG 对照处理的小鼠之间，纤维帽区域的细胞组成存在显著差异。事实上，抑制 IL-1β 与 YFP 阳性平滑肌细胞的减少以及半乳糖凝集素-3 阳性细胞的增加相关。

此外，观察到YFP阳性且主动脉平滑肌α肌动蛋白阳性的平滑肌细胞数量减少。而在两个锁骨下-头臂动脉位置，平滑肌细胞来源的YFP阳性且半乳糖凝集素-3阳性的巨噬细胞相对数量均显著增加。值得注意的是，IL-1β的抑制并未影响病变内成骨/成软骨细胞的总体数量，也未影响平滑肌细胞来源或巨噬细胞来源的软骨细胞所占比例。

本方案旨在通过标准化组织采集、处理与切片以及单细胞计数等关键步骤，提高动脉粥样硬化病变分析的严谨性和可重复性。该方案可用于分析其他易发生动脉粥样硬化病变的血管区域，包括主动脉和主动脉根部。