Name: 平滑肌细胞近系追踪小鼠晚期动脉粥样硬化病变细胞成分的定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习使用免疫荧光染色技术对小鼠晚期动脉粥样硬化病变进行细胞成分定量分析。该标准化方案涵盖组织解剖、灌注固定、切片染色及ImageJ单细胞计数，为血管疾病研究提供可重复的实验流程。

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感谢匹兹堡大学生物成像中心（由美国国立卫生研究院资助项目1S10OD019973-01支持）&#160;提供的协助。本研究由美国心脏协会授予D.G.的科研发展基金15SDG25860021资助。R.A.B. 受美国国立卫生研究院F30 HL136188基金资助。

动物繁殖、饲养和操作程序已获得弗吉尼亚大学和匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. SMC谱系示踪小鼠的构建
<ol>
	<li>将 Myh11-Cre/ERT2 雄性小鼠28（Jackson Laboratory；#019079）与 R26R-EYFP 雌性小鼠（Jackson Laboratory；#006148）杂交，以获得 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/+ 雄性小鼠。</li>
	<li>将 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/+ 雄性小鼠与 ApoE-/- 雌性小鼠（Jackson Laboratory；#002052）杂交，对后代进行交配并经基因分型筛选，最终获得用于繁殖的 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/+ ApoE-/- 雄性小鼠和 R26R-EYFP+/+ ApoE-/- 雌性小鼠。剪取同窝小鼠尾尖组织进行基因分型。所有雄性小鼠应为 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/+ ApoE-/- 基因型，可用于实验（图1A）。 
	注意：基因分型方案可在 Jackson Laboratory 网站获取。Myh11 Cre/ERT2 转基因位于 Y 染色体上，因此雌性小鼠无法使用。也可采用其他谱系示踪系统，但截至目前，该系统仍是动脉粥样硬化中平滑肌细胞命运图谱研究最可靠的谱系示踪策略。</li>
</ol>
2. 平滑肌细胞谱系示踪小鼠的饮食与处理
<ol>
	<li>让雄性 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/+ ApoE-/- 小鼠在6至8周龄期间接受一系列1 mg他莫昔芬注射，以永久标记Myh11+ 平滑肌细胞（SMC）并追踪其命运（图1A）。
	<ol>
		<li>将花生油加热至55 °C。</li>
		<li>将他莫昔芬加入预热的花生油中，配制成10 mg/mL的溶液，并在55 °C下孵育至他莫昔芬完全溶解。</li>
		<li>每只小鼠腹腔注射0.1 mL浓度为10 mg/mL的他莫昔芬溶液，共进行十次注射，持续两周。 
		注意：他莫昔芬属于生物危害物质，操作时必须小心谨慎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>末次他莫昔芬注射后5至7天，将普通饲料更换为高脂饲料（例如西方饮食；42% kcal来自脂肪；总胆固醇含量0.2%），持续喂养18周，以诱导形成晚期动脉粥样硬化病变，这些病变稳定出现在多个血管区域，包括主动脉弓、主动脉根部、头臂动脉和腹主动脉。</li>
	<li>在高脂饮食喂养18周后，开始进行治疗干预，持续所需的时间（图1B）。 
	注意：例如，我们在高脂饮食第18至26周期间，每周进行一次腹腔注射抗IL-1β抗体或同型匹配的IgG对照。</li>
	<li>在组织采集前8至16小时撤除食物，使小鼠禁食，以便准确测定血浆胆固醇和甘油三酯水平。</li>
</ol>
3. 头臂动脉（BCA）的采集
<ol>
	<li>动物安乐死应遵循动物护理与使用委员会（ACUC）的要求和规定。通过二氧化碳（CO2）窒息法对实验小鼠实施安乐死，持续约5分钟，并通过脚趾夹捏法确认死亡。</li>
	<li>称量小鼠体重并采集血液。
	<ol>
		<li>称量小鼠体重</li>
		<li>用70%乙醇喷洒小鼠腹侧</li>
		<li>通过胸腔左侧将连接1 mL注射器的25G针头插入心室，进行心脏穿刺。可采集0.1至1 mL血液。</li>
		<li>通过冲洗注射器将血液转移至EDTA真空采血管中，并将试管置于摇床或旋转器上作用10–15分钟。</li>
		<li>将血液转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以250 × g离心10分钟。用移液器及合适的吸头小心吸取上层血浆相，转移至新管中。在测定胆固醇和甘油三酯前，储存于-20 °C。 
		注意：全血可用于其他研究，包括血细胞计数以及细胞因子或免疫细胞谱型等其他血液成分分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用剪刀在腹部中线处皮肤做约2 cm切口，牵拉皮肤以暴露腹腔。沿胸骨方向切开腹膜，注意不损伤组织。沿腋中线在胸腔两侧各做一切口，注意避免损伤心脏和肺脏。</li>
	<li>用镊子提起胸骨，剪开膈肌以部分暴露心脏。若心脏不易接触，可适当剪除部分肋骨以到达右心房。</li>
	<li>使用重力灌注系统对小鼠进行灌注（图2A）。安装重力灌注系统，使灌注液压力相当于小鼠平均血压（图2B）。该系统可确保灌注的一致性，同时维持血管形态并清除红细胞。 
	注意：作为参考，C57Bl6小鼠的生理血压范围为120 mmHg（平均收缩压）至70 mmHg（平均舒张压）29,30。平均收缩压和舒张压可能因小鼠遗传背景不同而有所差异。
	<ol>
		<li>将23或25G蝶形针连接至重力灌注系统，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗针头，以排出管路中的空气。将针头插入左心室并固定。使用虹膜剪在右心房或升主动脉处做一小切口（&#60; 2 mm）。</li>
		<li>先用5 mL PBS灌注，随后用10 mL 4%多聚甲醛（PFA）溶液灌注，最后再用5 mL PBS灌注。PBS和4% PFA溶液均使用室温。</li>
		<li>采集目标组织（如肝脏、肺、脾脏），并将其置于4% PFA溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暴露头臂干动脉（BCA）
	<ol>
		<li>去除颈部皮肤和唾液腺，清洁操作区域。</li>
		<li>使用剪刀沿胸骨中线向下剪开，穿过胸骨柄。操作时注意剪刀应紧贴胸骨后方，以避免损伤位于胸骨下方的血管结构。用镊子向两侧牵拉肋骨，充分打开胸腔。颈总动脉应部分可见。</li>
		<li>用精细镊子牵拉肌肉和结缔组织，并去除脂肪组织，直至右侧颈总动脉、头臂干动脉、锁骨下动脉分叉处及主动脉弓完全暴露，并与周围结缔组织和脂肪分离（图2C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取下头臂干动脉（BCA）
	<ol>
		<li>用镊子夹住右侧颈总动脉分叉下方，于镊子上方做初始切口（图2D）。</li>
		<li>保持夹持颈总动脉的同时，切断锁骨下动脉。最后两处切口位于主动脉弓上，分别在头臂干动脉的两侧（图2D）。</li>
		<li>采集其他感兴趣的血管组织（如腹主动脉、包含主动脉根部的心脏上部）。</li>
		<li>将BCA及其他组织置于4% PFA溶液中，在室温下固定过夜。 
		注意：在整个研究过程中，固定时间应保持一致。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织处理与切片
<ol>
	<li>将组织从4% PFA中取出，并放入已标记的组织包埋盒中（图3A）。在包埋盒中使用泡沫垫以确保组织保持原有方向，并在处理过程中不从包埋盒中脱落（图3B）。关闭包埋盒后，将其浸入70%乙醇中，直至进行组织处理（24至72小时）。
	<ol>
		<li>对BCA及其他用于组织学和免疫荧光染色的组织进行如下处理（以使用真空渗透功能的组织处理机进行常规过夜程序为例）：室温下用10%中性缓冲福尔马林处理30分钟（2次），30 °C下用75%乙醇处理60分钟（1次），30 °C下用90%乙醇处理60分钟（1次），30 °C下用95%乙醇处理60分钟（1次），30 °C下用100%乙醇处理60分钟（3次），30 °C下用二甲苯处理60分钟（3次），62 °C下用石蜡处理80分钟（3次）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将BCA垂直包埋，使主动脉弓最靠近蜡块表面（图3C）。</li>
	<li>使用旋转式切片机对石蜡块进行切片（厚度为10 µm），直至暴露出包埋的组织。</li>
	<li>当组织可见时，取一片切片在显微镜下观察以确定位置。若主动脉弓仍可见，则每次连续切取最多十片10 µm切片，并在每个间隔取一片进行观察。</li>
	<li>当主动脉弓已完全切完且头臂动脉可见时，调整蜡块方向，使组织完全垂直于切片刀刃。</li>
	<li>以10 µm厚度对BCA进行切片。此后，所有切片均连续收集，每张载玻片上放置三片切片，直至达到锁骨下动脉分叉处（图3D）。 
	注意：为便于后续进行z轴堆叠共聚焦图像采集及单细胞计数，必须以10 µm厚度对BCA进行切片。该厚度可确保在整个横切面深度范围内，对单个细胞核与其胞质或膜染色之间的关联性进行严格且无干扰的评估。</li>
</ol>
5. 免疫荧光染色
注意：对动脉粥样硬化病变的完整表征包括对形态学参数、斑块稳定性或不稳定性指标以及细胞成分的评估，但这些内容不是本方案的重点。病变形态、胶原含量和斑块内出血可分别通过Movat7,17、PicroSirius Red7,31和Ter119染色进行分析7,18。本文将描述分析病变细胞成分的实验方案。
<ol>
	<li>在通风橱内，室温下将切片依次放入以下溶液中孵育：二甲苯 5 分钟（2 次）、100% 乙醇 5 分钟（2 次）、95% 乙醇 5 分钟（2 次）、70% 乙醇 5 分钟（2 次），以及去离子 H2O（diH2O）5 分钟（2 次）2O）5分钟（2次）。</li>
	<li>根据制造商说明书，将载玻片在抗原修复液中孵育。
	<ol>
		<li>使用柠檬酸为基础的抗原修复液（参见 材料表），将3 mL溶液稀释于320 mL去离子水中2O. 将切片放入染色缸中，并用配制好的抗原修复液加满至顶部。</li>
		<li>在载玻片架的空槽中放入空白载玻片，以确保均匀加热。用盖子盖上容器，使抗原修复液在不蒸发的情况下沸腾。</li>
		<li>将载玻片置于微波炉中，以约675–700瓦加热20分钟。定期检查载玻片，并用去离子水补充蒸发的液体2确保切片始终浸没在抗原修复液中。</li>
		<li>室温下在溶液中静置冷却载玻片1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将6 g鱼皮明胶（FSG）溶解于1 L磷酸盐缓冲液（PBS）中。PBS/FSG用作洗涤缓冲液。用PBS/FSG配制含10%正常血清的封闭液。 
	注意：鱼皮明胶（Fish Skin Gelatin, FSG）用于配制封闭缓冲液。FSG 不含可与哺乳动物抗体发生交叉反应的血清蛋白，从而可最大限度地减少背景噪音。然而，在使用生物素检测系统时，应优先选择其他封闭剂，因为 FSG 含有内源性生物素。所用正常血清的类型取决于所使用的二抗。当使用驴源性二抗时，应选择正常马血清用于封闭及抗体稀释。</li>
	<li>在室温下将切片置于 PBS 中孵育 5 分钟。使用疏水笔在组织切片周围画圈。在室温下用封闭缓冲液 PBS/FSG/正常血清覆盖切片，孵育 1 小时。在组织封闭期间，用 PBS/FSG/正常血清配制一抗溶液。</li>
	<li>在湿盒中，用 PBS/FSG/正常血清稀释的一抗于 4 °C 过夜孵育。每张载玻片上的一个切片应与 IgG 对照抗体混合物在与一抗相同浓度下孵育，以对照一抗的特异性。</li>
	<li>室温下按以下步骤洗涤载玻片：PBS/FSG 溶液洗涤 5 分钟（3 次），然后 PBS 洗涤 5 分钟（1 次）。</li>
	<li>孵育荧光染料标记的二抗（参见 材料表）以及用于细胞核复染的DAPI，用PBS/FSG/正常血清稀释后，室温孵育1小时。避光保存切片。</li>
	<li>按照第5.6步所述清洗载玻片。</li>
	<li>使用适用于荧光的封片剂封片（参见 材料表).</li>
</ol>
6. 共聚焦显微镜
注意：使用共聚焦显微镜和z轴层扫采集对于单细胞计数至关重要。
<ol>
	<li>设定整个研究中将使用的采集参数：图像分辨率（1024×1024 或 2048×2048 像素）；光路和通道数，其取决于所选的二抗组合；扫描速度（推荐扫描速度：7-8）；以及微分干涉差（DIC）通道。</li>
	<li>利用经一抗和IgG对照染色的切片，为每个单独的通道设置检测器灵敏度、激光功率和偏移量。IgG对照用于最小化背景信号。</li>
	<li>设定z轴堆栈采集的上、下位置。预先确定采集堆栈的厚度和数量。这些参数在整个研究过程中应保持一致。 
	注意：我们建议采集8到10个厚度为1 µm的堆栈。在整个研究过程中，成像堆栈的数量应保持一致。</li>
	<li>对所有通道（包括DIC）下经一抗和IgG对照染色的组织切片进行成像。</li>
	<li>至少为一张图像标注比例尺，以便在单细胞计数过程中进行图像校准。</li>
</ol>
7. 单细胞计数
<ol>
	<li>安装并打开 ImageJ。如有必要，请在 ImageJ 网站的 下载 &#62; 输入/输出 部分下载 插件，以便根据共聚焦显微镜生成的图像格式打开相应的图像文件。</li>
	<li>在 ImageJ 中打开图像文件。</li>
	<li>使用 6.6 步骤生成的图像中的参考比例尺对图像进行标定。</li>
	<li>使用 DIC 通道勾画出用于单细胞计数的兴趣区域（图 4）。 
	注意：每次只能勾画一个区域。根据实验问题的不同，单细胞计数可在整个病变区域（见 7.3.1）和/或病变的某个亚区域中进行。例如，对纤维帽区域的分析（见 7.3.2）尤为重要，因为其细胞组成是评估病变破裂倾向的重要指标。
	<ol>
		<li>根据 DIC 图像上可见的管腔边界（图 4A；白色箭头）和内弹性膜（图 4A；黄色箭头）勾画出病变区域。</li>
		<li>若分析纤维帽区域，确定距离管腔 30 µm 的边界并进行描记（图 4B-D）。 
		注意：纤维帽区域通常定义为位于管腔下方、富含 ACTA2+ 细胞和胶原的区域（图 4B）。ACTA2+ 细胞和胶原的富集在维持病变稳定性中起关键作用。先前研究表明，在高脂饮食喂养 18 至 26 周的 SMC 谱系示踪 ApoE-/- 小鼠中，富含 ACTA2+ 细胞的纤维帽区域平均厚度约为管腔下方 30 µm（图 4C）。因此，精确表征基因操作或药物处理对纤维帽区域细胞组成的影响具有重要意义。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开 通道工具 面板（图像 &#62; 颜色 &#62; 通道工具），并对不同染色通道进行伪彩着色（图 5A；框 1）。</li>
	<li>合并颜色通道（图像 &#62; 颜色 &#62; 合并颜色）（图 5A；框 2）。所有通道应显示在同一图像上（图 5B）。使用 通道工具 面板（图 5A；框 1）开启或关闭各个颜色通道。</li>
	<li>设置计数工具。
	<ol>
		<li>右键单击工具栏中的 计数 图标（图 5C；框 1），选择 多点工具。</li>
		<li>双击同一图标以打开 点工具 面板（图 5C；框 2）。</li>
		<li>选择用于标记细胞的符号类型和大小。</li>
		<li>勾选 显示全部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仅在 通道工具 面板中开启 DAPI 通道，并选择计数器通道 0（图 5C；框 3）。点击各个细胞核以进行标记（例如，图 5C-D 中的黄色点）。滚动 z 层切片，对兴趣区域内所有被染色的细胞核进行计数。事件数量将在 点工具 面板中的计数器通道下方显示（图 5C；框 4）。</li>
	<li>开启另一个染色通道（例如 eYFP 染色），选择计数器通道 1，点击 DAPI 与该染色信号共定位的细胞。对于胞质染色，应选择在整个细胞核深度范围内染色信号完全包围细胞核的细胞（需检查多个 z 层切片）。</li>
	<li>通过更改染色组合并选择新的计数器通道，重复上述步骤以计数目标细胞群体。每种点的颜色代表不同的细胞群体（图 5D）。结果可表示为细胞数量占总 DAPI 阳性细胞数的比例，或细胞数量与区域面积的比值。</li>
</ol>

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<li>Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+cells+involved+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).</li>
<li>Chappell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Proliferation+of+a+Subset+of+Differentiated%2C+yet+Plastic%2C+Medial+Vascular+Smooth+Muscle+Cells+Contributes+to+Neointimal+Formation+in+Mouse+Injury+and+Atherosclerosis+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models.</a> Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).</li>
<li>Newman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irradiation+abolishes+smooth+muscle+investment+into+vascular+lesions+in+specific+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds.</a> JCI Insight. 3 (15), (2018).</li>
<li>Dobnikar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-relevant+transcriptional+signatures+identified+in+individual+smooth+muscle+cells+from+healthy+mouse+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels.</a> Nature Communications. 9 (1), 4567(2018).</li>
<li>Misra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+beta3+regulates+clonality+and+fate+of+smooth+muscle-derived+atherosclerotic+plaque+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 2073(2018).</li>
<li>Majesky, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Smooth+Muscle+Cells+Generate+a+Subpopulation+of+Resident+Vascular+Progenitor+Cells+in+the+Adventitia+Regulated+by+Klf4%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4.</a> Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).</li>
<li>Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Previously+differentiated+medial+vascular+smooth+muscle+cells+contribute+to+neointima+formation+following+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Cell%22%5BJournal%5D)">Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury.</a> Vascular Cell. 6, 21(2014).</li>
<li>Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+progenitors+are+primed+to+muscularize+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension.</a> Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).</li>
<li>Bentzon, J. F., Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracking+of+origin+and+fate+of+smooth+muscle+cells+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).</li>
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<li>Durgin, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell-specific+deletion+of+Col15a1+unexpectedly+leads+to+impaired+development+of+advanced+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).</li>
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<li>Lin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx2+Deletion+in+Smooth+muscle+Cells+Inhibits+Vascular+Osteochondrogenesis+and+Calcification+but+not+Atherosclerotic+Lesion+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation.</a> Cardiovascular Research. , (2016).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Bioscience+Research+Reporting%3A+The+ARRIVE+Guidelines+for+Reporting+Animal+Research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research.</a> PLoS Biology. 8 (6), 1000412(2010).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Nishioka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+inadequate+compensatory+enlargement+to+development+of+human+coronary+artery+stenosis%3A+An+in+vivo+intravascular+ultrasound+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).</li>
<li>Pasterkamp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+Arterial-Wall+Shrinkage+May+Contribute+to+Luminal+Narrowing+of+Human+Atherosclerotic+Femoral+Arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries.</a> Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).</li>
<li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+and+characterization+of+atherosclerotic+lesions+in+the+murine+aortic+sinus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus.</a> Journal of Visual Experiments. (82), 50933(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管数十年来在动脉粥样硬化研究方面取得了大量科研进展和技术突破，但将科学发现转化为临床治疗手段的历程却令人失望34,35。这一现象部分可归因于动物模型、实验设计以及病变分析之间的差异。本文中，我们描述了一种实验流程，该流程用于通过谱系示踪小鼠分析晚期动脉粥样硬化病变中的细胞组成7。该方法可对细胞命运图谱绘制和表型鉴定进行精细研究，而这两者正是受晚期动脉粥样硬化病变中潜在机制调控的关键参数。
SMC谱系示踪小鼠模型是一种强大的工具，可准确追踪该谱系的命运及其表型变化，以及其在动脉粥样硬化发病机制中的作用。他莫昔芬诱导的Cre-loxP系统能够在动脉粥样硬化启动之前，对表达MYH11的成熟血管SMC进行标记。利用该系统获得的有力证据表明，动脉粥样硬化斑块具有高度可塑性，血管SMC可发生表型转换，失去其收缩表型及SMC特异性标志物，并出现增殖、迁移，甚至转分化为类似巨噬细胞的细胞<sup class="xr...

动脉粥样硬化是全球范围内导致发病和死亡的首要原因，是大多数冠状动脉疾病、外周动脉疾病和卒中的根本病因。晚期冠状动脉粥样硬化可导致严重并发症，包括心肌梗死，其致死率约占全球人口死亡总数的16%1,3。由于其对公共健康的严重影响，科研界已投入大量努力以阐明推动动脉粥样硬化进展的机制，并开发新的治疗策略。然而，与其他临床领域相比，心血管疾病临床试验的获批可能性（LOA）率处于最低水平（I期仅为8.7%）3。这一现象部分可归因于动脉粥样硬化给有效药物研发带来的诸多障碍，包括其几乎普遍存在的特性、临床隐匿性进展以及显著的疾病异质性。此外，临床前动物研究设计欠佳也是导致临床转化失败的原因之一。具体而言，我们认为在可能的情况下，有必要开展干预性研究以评估治疗策略的有效性。同时，迫切需要建立标准化的病变分析流程，包括通过命运图谱（fate mapping）和表型分析对晚期动脉粥样硬化病变的细胞组成进行深入表征。
绝大多数动脉粥样硬化研究集中于预防性模型，即在疾病发生和进展之前，对健康的年轻小鼠进行药物治疗或基因操作（基因敲除或基因敲入）。这些研究已发现大量在动脉粥样硬化发展过程中起作用的基因和信号分子。然而，其中大多数靶点未能成功转化为对人类有效的治疗方法。事实上，将一种疗法在健康年轻小鼠中的效果外推至已患有晚期动脉粥样硬化病变的老年患者，是十分困难的。因此，在临床前实验流程中引入干预性研究，可能更准确地反映新疗法的相关性和有效性。这一观点得到了有力证据的支持：在采用预防策略4,5,6或干预策略7时，抑制促炎性细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）所产生的效应存在显著差异。预防性研究与干预性研究之间的差异表明，在动脉粥样硬化发展的不同阶段，涉及不同的细胞过程，也凸显出预防性研究可能不足以充分模拟临床实际情况。
美国心脏协会近期发表了一项科学声明，详细阐述了动物动脉粥样硬化研究在实验设计、操作标准化、数据分析和报告方面的推荐规范8。该声明强调了当前领域内主要技术的优势与局限性。例如，主动脉的en face苏丹IV染色常被用作初步检测手段。尽管en face苏丹IV染色在评估整体斑块负荷方面是一种合适的方法，但它无法区分早期脂肪条纹病变与更晚期的进展性病变。因此，对en face染色结果的解读往往具有模糊性和表面性9。通过组织横切面的细致分析，结合血管、病变和管腔大小等形态学参数，并对病变稳定性指标进行定量，能够更准确地理解实验干预的效果。
最后，人类组织病理学研究提示，与病变大小本身相比，细胞组成是预测斑块破裂更佳的指标，其中平滑肌细胞（SMC）较少而巨噬细胞较多的病变更易发生破裂10,11。这些观察结果基于传统用于细胞鉴定的标志物染色（例如，SMC 使用 ACTA2，巨噬细胞使用 LGALS3 或 CD68）。然而，由于包括 SMC、内皮细胞和髓系细胞在内的多种细胞谱系具有可塑性，这些标志物的表达在动脉粥样硬化病变中并不严格局限于单一细胞类型12。特别是，在过去十年之前，由于 SMC 在受损或病变血管中会发生去分化并抑制其谱系特异性标志基因表达（这一过程称为表型转换），因此几乎无法明确鉴定动脉粥样硬化病变中的 SMC13。这一 SMC 鉴定的局限性已通过谱系示踪技术的发展得以克服7,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24。该技术通过使用由 SMC 特异性启动子驱动 Cre 重组酶表达（例如 Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23,24、Acta225,26 和 SM22α14,16）并结合报告基因（如荧光蛋白、β-半乳糖苷酶）的激活，实现对 SMC 及其后代的永久标记，从而追踪其在动脉粥样硬化进展过程中的命运及表型演变[详见 Bentzon 和 Majesky 2018 年综述27]。Speer 等人14在最早利用 SMC 谱系示踪技术研究胚胎发育之外过程的研究之一中，使用 SM22α Cre R26R LacZ 谱系示踪模型，提供了 SMC 可调节其表型并在血管钙化过程中转分化为软骨样细胞的证据。尽管这些研究开创了 SMC 谱系示踪的先河，但存在一定模糊性：在疾病状态下任何非 SMC 表达 SM22α 的细胞也会被报告系统标记。这一局限性已通过他莫昔芬诱导型 Cre ERT/LoxP 系统的发展和应用得以克服，该系统实现了细胞标记的时间控制。细胞标记仅在给予他莫昔芬期间发生，并且仅限于在给药时表达驱动 Cre ERT 的细胞类型特异性启动子的细胞，从而避免了在疾病进展过程中因其他细胞类型激活 Cre 而导致的非特异性示踪。在动脉粥样硬化的 SMC 谱系示踪研究中，与荧光报告基因联用的他莫昔芬诱导型 Myh11-Cre/ERT2 转基因（如 eYFP7,15,17,18,21、mTmG19,25、Confetti20,22,23 用于克隆扩增研究）已显示出卓越的标记效率和特异性，并已被近期多项研究用于绘制动脉粥样硬化病变中 SMC 群体的命运图谱。重要的是，这些研究揭示了以下几点：1）在晚期动脉粥样硬化病变中，80% 的 SMC 不表达任何常规 SMC 标志物（ACTA2、MYH11），因此若无谱系示踪技术，这些细胞将被错误识别17；2）部分 SMC 亚群表达其他细胞类型的标志物，包括巨噬细胞标志物或间充质干细胞标志物16,17,19；3）SMC 通过寡克隆扩增方式进入并定植于动脉粥样硬化病变，且 SMC 克隆保留了向不同表型群体转换的可塑性20,23。综上所述，目前明确的是，平滑肌细胞在动脉粥样硬化病变中表现出显著的表型多样性，其表型转换的性质决定了它们在病变发生发展中可能发挥有益或有害的作用。这些发现为靶向晚期动脉粥样硬化中 SMC 促动脉粥样硬化表型转换提供了极具前景的全新治疗途径。
本文提出了一种用于分析晚期小鼠动脉粥样硬化病变的标准化方案，包括动物解剖、包埋、切片、染色以及锁骨下-头臂动脉病变定量的系统性方法。为了确定白细胞介素-1β（Interleukin-1β）抑制对平滑肌细胞（SMC）命运和表型的影响，我们使用了SMC谱系示踪的ApoE-/-小鼠，在给予西方饮食喂养18周后，每周注射抗IL-1β抗体或同型匹配的IgG对照。

<table><tbody><tr><td>16% 甲醛水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>组织灌注与固定</td></tr><tr><td>23G 蝶形针</td><td>Fisher</td><td>BD367342</td><td></td></tr><tr><td>25G 针头</td><td>Fisher</td><td>14-821-13D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>A1 共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>ACTA2-FITC 抗体（小鼠）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Alexa-647 抗山羊抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-21447</td><td>二抗</td></tr><tr><td>抗原修复液（基于柠檬酸）</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td>抗原修复溶液</td></tr><tr><td>普通饲料</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.7012</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td>任意 50 × 24 mm 盖玻片</td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>细胞核荧光复染</td></tr><tr><td>驴源 Alexa-488 抗兔抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>二抗</td></tr><tr><td>驴源 Alexa-555 抗大鼠抗体</td><td>Abcam</td><td>ab150154</td><td>二抗</td></tr><tr><td>不含钙和镁的 10X DPBS</td><td>Gibco</td><td>14200166</td><td>用于溶液稀释和洗涤的 PBS，用去离子水稀释至 1X</td></tr><tr><td>包埋盒</td><td>Fisher</td><td>15-182-701D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 真空采血管</td><td>Fisher</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>泡沫垫</td><td>Fisher</td><td>22-222-012</td><td></td></tr><tr><td>冷水鱼皮明胶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体（山羊）</td><td>abcam</td><td>ab6673</td><td>一抗</td></tr><tr><td>山羊 IgG 对照</td><td>Vector Labs</td><td>I-5000</td><td>IgG 对照</td></tr><tr><td>高脂饲料</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>计算机程序 https://imagej.nih.gov/ij/&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LGALS3 抗体（大鼠）</td><td>Cedarlane</td><td>CL8942AP</td><td>一抗</td></tr><tr><td>LSM700 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>载玻片，Superfrost Plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td>Fisher</td><td>30-538-35</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG 对照</td><td>Vector Labs</td><td>I-2000</td><td>IgG 对照</td></tr><tr><td>NIS 元素成像软件</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于 z 轴层扫图像采集的成像软件</td></tr><tr><td>正常马血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>疏水笔</td><td>Fisher</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>花生油</td><td>Sigma</td><td>P2144</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>封片介质&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>兔 IgG 对照</td><td>Vector Labs</td><td>I-1000</td><td>IgG 对照</td></tr><tr><td>大鼠 IgG 对照</td><td>Vector Labs</td><td>I-4000</td><td>IgG 对照</td></tr><tr><td>RUNX2 抗体（兔）</td><td>Abcam</td><td>ab192256</td><td>一抗</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 ml 注射器</td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher</td><td>X55K-4</td><td></td></tr><tr><td>Zen 成像软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td>用于 z 轴层扫图像采集的成像软件</td></tr></tbody></table>

平滑肌细胞谱系示踪小鼠中晚期动脉粥样硬化病变的细胞组成定量分析

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

动脉粥样硬化仍是全球死亡的首要原因，尽管已有大量临床前研究描述了具有前景的治疗靶点，但新的干预手段仍然难以实现。这在一定程度上可能是因为目前的研究主要依赖于临床前预防模型，即研究基因操作或药物治疗对动脉粥样硬化发生发展的影响，而非针对已形成的疾病进行干预。此外，由于常采用浅表性病变分析方法，且缺乏对病变中细胞群体的系统表征，这些研究的结果往往存在混淆。为帮助克服这些转化医学中的障碍，我们建议更多地采用干预模型，并通过免疫荧光染色结合共聚焦显微镜技术，在单细胞水平上深入分析细胞组成的变化。为此，本文描述了一种在小鼠干预模型中测试潜在治疗药物的实验方案，包括系统性的动物解剖、包埋、切片、染色以及对锁骨下-头臂动脉病变的定量分析方法。此外，鉴于晚期动脉粥样硬化病变中细胞表型的高度异质性，我们强调了使用细胞特异性的可诱导谱系示踪小鼠系统的重要性，并阐述了如何利用该系统对动脉粥样硬化病变中的细胞群体进行无偏倚的表征。综上所述，这些策略可帮助血管生物学家更准确地模拟治疗干预，更深入地分析动脉粥样硬化疾病，有望提高临床试验的成功率。

Myh11-Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe-/- 小鼠在6至8周龄期间注射他莫昔芬，随后喂食高脂饮食。在高脂饮食喂养18周后，将小鼠分为两组，每组8只，每周分别给予10 mg/kg的鼠源单克隆抗IL-1β抗体或同型匹配的IgG对照抗体，持续8周（图1）7。随后处死小鼠，并用4%多聚甲醛-PBS溶液灌注。头臂动脉按上述方法解剖、处理并切片（图2 和 图3）。
使用靶向谱系示踪报告基因（YFP）和表型标志物（ACTA2、LGALS3、RUNX2）的抗体进行免疫荧光染色后，采用共聚焦显微镜对胸主动脉（BCA）横切面厚度为8-10 µm的区域成像。分别采集每种单独染色、DAPI（细...

我们提出了一种标准化方案，用于表征晚期小鼠动脉粥样硬化病变的细胞组成，包括对易发动脉粥样硬化的平滑肌细胞谱系示踪小鼠的臂头动脉进行系统性动物解剖、组织包埋、切片、染色及分析的方法。

动脉粥样硬化仍然是全球死亡的首要原因，尽管已有无数的临床前研究描述了具有前景的治疗靶点，但新的……

本方案有助于研究人员通过免疫荧光染色建立标准化的实验流程，以对相似群体进行表型特征分析。利用该技术，研究人员可严格分析复杂疾病组织的相似组成，并对目标细胞类型的表型进行定性和定量分析。本次实验操作由本实验室的技术员 Sidney Mahan 演示。为准备获取动物的头臂动脉，沿中腋线切开胸腔至胸骨，注意不要损伤腹腔组织。注意不要损伤心脏和肺部，沿中腋线在胸腔进行两处切口。然后切开膈肌，以部分暴露心脏。为进行小鼠灌注，安装重力灌注系统，使灌注液的压力相当于小鼠平均血压，以确保灌注过程稳定并维持血管形态。随后，用5毫升室温磷酸盐缓冲液（PBS）、10毫升4%室温多聚甲醛以及额外5毫升室温PBS对动物进行灌注。将23或25号蝶形针连接至重力灌注系统，并先用PBS流经针头以排出管路中的空气，然后再将针头插入左心室。固定针头后，使用虹膜剪在右心房处做一个小于两厘米的切口。将目标组织收集到新鲜的4%多聚甲醛中。为暴露头臂动脉，使用剪刀沿胸骨正中线切开胸骨柄，并用镊子拉开肋骨两侧，充分打开胸腔。接下来，将动物置于解剖显微镜下，以部分观察颈总动脉，使用精细镊子分离肌肉、结缔组织和脂肪，直至右侧颈总动脉、无名动脉、锁骨下动脉分叉处及主动脉弓完全从周围的结缔组织和脂肪中清理并分离出来。随后，用镊子夹住右侧颈总动脉分叉下方，并在镊子上方做第一处切口。继续保持夹持颈总动脉，通过锁骨下动脉做第二处切口，最后在无名动脉两侧的主动脉弓处完成第三和第四处切口。随后，收集其他感兴趣的血管组织，并将头臂动脉及其他组织置于4%多聚甲醛溶液中，室温下固定过夜。对于头臂动脉的免疫荧光染色，使用切片机对石蜡包埋的组织样本进行连续切片，每片厚度为10 µm，直至通过光学显微镜确认已切至主动脉弓区域并可见头臂动脉。调整组织块的方向，使其完全垂直于切片机刀片，每张玻片上连续切取三片厚度为10 µm的头臂动脉组织切片，直至达到锁骨下动脉分叉处为止。当收集完所有切片后，在通风橱中用二甲苯浸洗组织样本两次，每次五分钟，随后按所示进行五分钟的乙醇梯度浸洗，再用去离子水浸洗两次，每次五分钟。接着，根据标准操作流程将载玻片置于抗原修复液中孵育，并在微波炉中加热20分钟。室温下冷却一小时后，使用疏水笔围绕每个组织切片区画圈。在室温下用封闭缓冲液封闭非特异性结合位点，孵育一小时。孵育结束后，在4°C条件下，用目标一抗混合物或同型匹配的IgG对照抗体对组织样本避光孵育过夜。次日早晨，将切片用PBS洗涤三次，每次五分钟；随后加入合适的荧光标记二抗混合物以及DAPI，在室温下孵育一小时，以实现对细胞核的染色观察。然后，使用适用于荧光显微镜的封片剂将盖玻片封固在载玻片上。对于标记组织切片的共聚焦显微镜成像，需利用经IgG对照和一抗染色的切片来设定每个独立通道的检测器灵敏度、激光功率和偏移值。接着，设定z轴层扫采集的上限和下限位置，并确定成像的层厚及层数。当所有图像采集完成后，在 ImageJ 中打开图像，打开通道工具面板，并对不同的染色通道进行伪彩着色。合并颜色通道，所有通道应在同一图像上可见。在通道工具面板中打开或关闭各个颜色通道，右键单击计数图标以选择多点工具。双击计数图标可打开点工具面板，并选择用于计数细胞的标记类型和大小。勾选“显示全部”，并在通道工具面板中仅开启 DAPI 通道。然后，选择计数通道零，点击需要标记的单个细胞核，并滚动浏览z轴层叠图像，以计数感兴趣区域内所有被染色的细胞核。定量的单细胞事件数量将在下方的点工具面板中显示。当所有细胞核均被标记后，开启另一个染色通道，并选择计数通道一，标记那些显示DAPI与抗体染色共定位的细胞。对于细胞质染色，应选择在细胞核全层深度范围内、细胞核周围均有染色信号的细胞，必要时需检查多个z轴层扫描图像。结果可表示为染色阳性细胞数占DAPI阳性细胞总数的比例，或表示为感兴趣区域内每单位面积的细胞数量。如示例所示，使用靶向表型标志物的抗体进行免疫荧光染色，可同时获取各单个标志物的染色图像、微分干涉相差图像，从而界定感兴趣区域，用于单细胞计数。随后可使用 ImageJ 对单个细胞进行计数，以确定不同平滑肌细胞来源群体的丰度。例如，对这些代表性横切面中纤维帽区域的单细胞计数分析显示，在经抗 IL-1β 抗体处理的小鼠与经同型匹配的 IgG 对照处理的小鼠之间，纤维帽区域的细胞组成存在显著差异。事实上，抑制 IL-1β 与 YFP 阳性平滑肌细胞的减少以及半乳糖凝集素-3 阳性细胞的增加相关。此外，观察到YFP阳性且主动脉平滑肌α肌动蛋白阳性的平滑肌细胞数量减少。而在两个锁骨下-头臂动脉位置，平滑肌细胞来源的YFP阳性且半乳糖凝集素-3阳性的巨噬细胞相对数量均显著增加。值得注意的是，IL-1β的抑制并未影响病变内成骨/成软骨细胞的总体数量，也未影响平滑肌细胞来源或巨噬细胞来源的软骨细胞所占比例。本方案旨在通过标准化组织采集、处理与切片以及单细胞计数等关键步骤，提高动脉粥样硬化病变分析的严谨性和可重复性。该方案可用于分析其他易发生动脉粥样硬化病变的血管区域，包括主动脉和主动脉根部。

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