基于质谱的蛋白质组学分析中眼微血管的样品制备

制备适用于高质谱兼容性的样品，对眼组织样本进行全面的蛋白质组学分析，对于阐明健康与疾病状态下相关的分子机制和信号通路至关重要。本文所述的工作流程为严格样品制备步骤提供了一种简单而稳健的方法，特别适用于眼微血管等微量样本的分析。尽管本研究的主要目标是建立适用于眼血管的质谱兼容性方法，但该工作流程亦可广泛应用于各类细胞和组织样本。

通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为识别和分离选定的短后睫状动脉（SPCA）分支具有挑战性。新鲜的猪眼连同视神经和眼外组织，需在动物死亡后立即从当地屠宰场获取。将眼球置于含有冰冻克雷布斯-亨塞莱特缓冲液的解剖槽中。

使用一把锋利的Mayo剪刀仔细剪除周围肌肉和组织。用手术刀做切口，并用锋利的Mayo剪刀沿眼球赤道平面剪开，直至将眼球分离为前半部和后半部。使用标准型镊子尽可能去除眼球后半部的玻璃体。

使用解剖针小心地将眼球后半部分固定后，用学生型Vannas弹簧剪轻轻剪除视神经周围的结缔组织，以暴露其下方的球后血管系统。用5号精密镊子和Vannas囊膜剪将视动脉旁段及远端短后睫状动脉连同周围结缔组织一并分离。随后用超细尖镊子和剪刀轻柔去除动脉段上的结缔组织，再将分离出的动脉用预冷的PBS冲洗，以去除污染物和血液残留物。

将两只眼睛的动脉组织合并以获得一个生物学重复样本，然后使用分析天平称重。向每个离心管中加入0.5毫米和1毫米的氧化锆珠混合物，随后加入组织蛋白提取试剂。接着，将样本管放入搅拌式匀浆器中进行匀浆。

将计时器设为两分钟，速度调至六档，开始匀浆。运行结束后检查样品是否完全匀浆，并在每次运行间隙将样品置于冰上。重复该循环，直至样品完全匀浆。

将匀浆液小心地用移液器转移至新的微量离心管中。在4°C条件下，以10,000 × g离心20分钟，使不溶性蛋白质沉淀。小心地用移液器吸取上清液（含可溶性蛋白质），避免接触沉淀层，并转移至新的微量离心管中。

向每份沉淀样品中加入 200 微升提取缓冲液 2A 和 5 微升蛋白酶抑制剂混合物。然后用移液器反复吹打悬浮沉淀。使用超声波匀浆器将沉淀完全匀浆。

将振幅设置为60，循环次数设为1。使用由钛制成的探头，适用于小体积样品的匀浆。将探头浸入冰上的沉淀物与提取缓冲液混合物中，然后按下启动按钮。

超声处理样品直至沉淀团块完全均质化，每次超声之间暂停数秒。通过肉眼观察确认是否完全均质化。用移液器反复吹打匀浆液数次，以确保无团块残留。

本实验步骤使用截留分子量为三千道尔顿的离心过滤装置。将截留分子量为三千道尔顿的滤膜插入微量离心管中。取 200 µL 样品匀浆加入一个过滤装置，再向同一过滤装置中加入 200 µL 去离子水。

盖紧后，将滤过装置放入离心机，在4°C条件下以14,000 ×g离心15分钟。离心结束后，将含有浓缩样品的滤过装置与含有滤液的微量离心管分离，并弃去滤液。通过向滤过装置中加入400 µL去离子水重新溶解浓缩物。

重复过滤三次后，小心地将净化后的样品浓缩液用移液枪转移至洁净的微量离心管中。按照文本方案中的说明制备一维凝胶电泳样品，并用移液枪充分混匀。将样品置于干式恒温仪中，在 70 摄氏度加热 15 分钟，随后冷却至室温。

使用移液器小心地每孔上样50微克样品，同时加入预染蛋白质标准品作为分子质量标记。在175伏恒定电压下电泳约60分钟。电泳结束后，用凝胶刮刀小心地从玻璃板中取出凝胶，并将凝胶转移至凝胶染色盒中。

按照文本方案中所述步骤对凝胶进行固定和染色。为获得最佳整体效果，将凝胶在染色液中振荡过夜。小心倾去染色液，加入200毫升去离子水，随后将凝胶在水中振荡至少七至八小时，以清除背景。

使用洁净的新微型刀片从凝胶中切下蛋白条带。将条带切成小块，并小心地将凝胶小块转移至1.5毫升微量离心管中。加入500微升含有100毫摩尔/升碳酸氢铵和乙腈的脱色溶液。

将样品在室温下孵育30分钟，期间偶尔振荡。小心用移液器吸出脱色液。目视检查各管是否有残留染色，若凝胶小块仍呈蓝色，则重复此步骤。

加入约 400 微升新配制的 DTT 溶液，在 56 摄氏度孵育 30 分钟。用移液器弃去还原溶液后，加入约 400 微升新配制的 IAA 溶液，在室温避光条件下孵育 30 分钟。用移液器移除烷基化缓冲液并弃去。

在室温下加入 500 微升纯乙腈，作用 10 至 15 分钟，直至凝胶颗粒收缩并变为不透明。用移液器吸去乙腈，并在通风橱中将凝胶颗粒晾干 5 至 10 分钟。然后，向每根试管中加入 50 微升胰蛋白酶溶液，完全覆盖凝胶颗粒，并将试管置于 4 摄氏度下孵育。

30分钟后，如有必要，加入足量的胰蛋白酶缓冲液以完全覆盖胶粒。将样品在37摄氏度下孵育过夜。进行肽段提取时，小心地用移液器将提取的肽段溶液从管中转移至干净的微量离心管中。

在离心真空浓缩仪中将上清液干燥。向每管含有胶粒的样品中加入100微升提取缓冲液，振荡孵育30分钟。用移液器将上清液转移至含有相应条带提取肽段的同一微量离心管中，并在真空离心浓缩仪中干燥。

按照文本方案中所述步骤进行多肽纯化及液相色谱-电喷雾电离串联质谱（MS/MS）分析。此处展示了使用每种去垢剂提取的样品中的总蛋白量。蛋白得率最高的是使用组织蛋白提取缓冲液提取的组织，其次是DDM、CHAPS、ASB-14，而乙腈（ACN）和三氟乙酸（TFA）提取的蛋白得率最低。

一致地，组织蛋白提取缓冲液提取的样品中鉴定出的总蛋白数量也最高，且与总得率的变化趋势相同。此处展示了SPCA在经过优化的样品制备和纯化步骤前后，一维凝胶电泳蛋白谱图的比较。总体而言，在第三泳道中观察到明显的拖尾现象以及蛋白条带分离效果差。

该图谱表明，样品中可能含有提取试剂以及脂质和细胞碎片等污染物。然而，将SPCA样品分离为上清液和沉淀后，再采用优化方案处理，可获得理想的单向凝胶电泳图谱。这种针对眼微血管组织快速、稳定且高效的蛋白质提取优化方法，也可轻松应用于其他基于组织的样品。

图中显示了小鼠脑组织和心脏组织样本上清液与沉淀物的蛋白质谱。在进行该操作时，需注意确保样本充分匀浆，彻底分离上清液与沉淀物，并去除污染物及提取试剂。该技术建立后，为实验性与转化性眼科学领域的研究人员提供了重要途径，使其能够利用猪眼作为模型，深入探索眼血管系统的蛋白质组。