基于性光谱的眼微血管蛋白质组学样品制备
2019年2月22日
眼微血管床的蛋白质组特征是深入了解人类许多眼部病理的关键。本研究展示了一种有效、快速、稳健的方法, 用于利用猪短的后睫毛动脉作为基于质谱的蛋白质组学分析的模型血管, 从小血管中提取蛋白质和制备样品。
制备高质量的质谱学兼容样品，对眼样进行全面的蛋白质组分析，对于阐明与健康和疾病有关分子机制和信号通路至关重要。所述工作流程代表一种简单而稳健的方法，用于严格样品制备步骤，专门用于分析质量有限的样品，如眼微血管。虽然这项研究的主要目的是建立一个与MS兼容的眼血管方法，但所述工作流程可以广泛应用于各种基于细胞和组织的样本。
一般来说，对这种方法的新鲜人可能难以辨认，因为识别和隔离选定的短后侧动脉或SPCA分支可能具有挑战性。新鲜猪眼，连同视神经和外眼组织，立即从当地的屠宰场获得验尸。将眼球放在含有冰冷克雷布斯-亨塞莱特缓冲液的解剖室中。
用一把锋利的梅奥剪刀小心地切开周围的肌肉和组织。用手术刀做切口，用一把锋利的梅奥剪刀沿着赤道平面切割地球，直到眼睛被分成前半部分和后半部分。使用一对标准图案钳从眼睛的后半部分取出尽可能多的玻璃体。
使用解剖针小心地固定眼睛的后半部分，轻轻切开视神经周围的结缔组织，用一双学生Vannas弹簧剪刀露出潜在的逆光杆。用一对五型精密钳子和Vannas帽切除术剪刀将伞状和侧短后侧动脉与周围的结缔组织隔离开来。在冰冷PBS中冲洗隔离动脉以去除污染物和血液残留物之前，使用额外的细尖钳和剪刀轻轻去除动脉部分的结缔组织。
从两只眼睛汇集动脉，获得一个生物复制，然后使用分析平衡称量样本。在每个管上，加入0.5和1毫米氧化硅珠的混合物，然后加入组织蛋白提取试剂。现在，将样品管装入搅拌机均质器中。
将计时器设置为两分钟，将速度级别设置为 6，并开始均质化。运行后，检查样品完全均质，并在每次运行之间将样品留在冰上。重复循环，直到样品完全均质。
小心移液器均质化成新鲜的微离心管。将样品在10，000次G下离心20分钟，在4摄氏度下产生不溶性蛋白质。小心移液含有可溶性蛋白质的上清液，无需接触颗粒层，并转移到新鲜的微离心管中。
在每个颗粒样品中加入200微升的萃取缓冲液2A和5微升蛋白酶抑制剂鸡尾酒。然后，用移液器多次悬浮颗粒。使用超声波均质器使颗粒完全均质。
将振幅设置为 60，然后循环设置为 1。使用钛制成的探针，该探针适用于体积小的样品的均质化。将探针浸入冰的颗粒和萃取缓冲液混合物中，然后按下启动按钮。
对样品进行声波化，直到颗粒团完全均匀，每次声波两次之间暂停几秒钟。目视检查完全均质。将均质与移液器混合几次，以确保没有团块。
使用离心过滤装置，具有三千克当吨截止时间。将三千龙的截止过滤器单元插入微离心管中。将200微升样品均质添加到一个过滤装置中，并将200微升的去维化水加入同一过滤器。
安全封盖后，将过滤装置放入离心机中，在4摄氏度下旋转14，000次G，旋转15分钟。离心后，将含有样品浓缩物的过滤装置与含有滤液的微离心管分离，丢弃滤液。通过将400微升的去化水加入过滤单元来重组浓缩物。
重复过滤三次后，小心地将清洁的样品浓缩物移液到干净的微管中。准备文本协议中列出的一维凝胶电泳样本，并很好地与移液器混合。在干块加热器中加热样品 70 摄氏度 15 分钟，冷却至室温。
使用移液器，以及预着色的蛋白质标准作为分子质量标记，小心地加载每车道 50 微克样品。在 175 伏的恒定电压下运行凝胶约 60 分钟。在运行结束时，使用凝胶刀小心地从盒式板中去除凝胶，然后将凝胶转移到凝胶染色盒中。
执行凝胶的固定和染色，如文本协议中所述。摇动染色溶液中的凝胶过夜，以获得最佳的整体效果。小心地将染色溶液去掉，然后用200毫升的去维化水代替，然后在水中摇动凝胶至少7至8个小时以清除背景。
使用干净的新微切片将蛋白质带从凝胶中切除。将带子切成小块，小心地将凝胶片转移到1.5毫升微离心管中。加入含有100毫摩尔碳酸氢铵和醋酸酯的500微升脱盐溶液。
在室温下孵育样品30分钟，偶尔摇晃。小心地移液出脱污溶液。目视检查是否有残留污渍的管，如果凝胶片仍为蓝色染色，请重复此步骤。
加入约400微升新鲜准备的DTT溶液，并在56摄氏度下孵育30分钟。使用移液器丢弃还原溶液后，加入约 400 微升新鲜准备的 IAA 溶液，并在室温的黑暗中孵育 30 分钟。用移液器拆下alkylating缓冲液并丢弃。
在室温下加入500微升整齐的乙酰酸盐10至15分钟，直到凝胶片收缩并变得不透明。将乙酰丙酮移出，在发动机罩下风干凝胶片 5 至 10 分钟。然后，移液器50微升的三辛溶液进入每个管，以完全覆盖凝胶片，并在4摄氏度下孵育管。
30 分钟后，添加足够体积的 trypsin 缓冲液，如有必要，可完全覆盖凝胶片。在37摄氏度下孵育样品过夜。要执行肽提取，请小心地将提取的肽溶液从管子中移液，并转移到干净的微管中。
在离心真空蒸发器中干燥上一个液。将100微升的萃取缓冲液加入每个管中，用凝胶片进行孵化30分钟。将上一液移入同一微管中，根据各自的带子，将提取的肽放入相同的微管中，并在真空离心机中干燥。
按照文本协议中所述，继续进行肽纯化和液相色谱-电喷雾电离MS/MS分析。此处描述了用每种洗涤剂提取的样品中的蛋白质总量。产量最高的来自用组织蛋白提取缓冲液提取的组织，其次是DDM、CHAPS、ASB-14，以及从ACN和TFA中提取的最低产量。
一致地，所鉴定的总蛋白质也是组织蛋白提取缓冲液提取样品中最高的，与总产量的趋势相同。此处显示的是 SPCA 的一维凝胶电泳蛋白配置文件的比较，在经过优化的样品制备和清洁步骤之前和之后。总体而言，在第三车道观察到蛋白质带的涂片度高和分离不良。
此配置文件表明，样品可能含有萃取试剂，以及污染物，如脂质和细胞碎片。然而，SPCA样品被分离成上经剂和颗粒，然后根据优化的协议，导致模范的一维凝胶电泳轮廓。从眼微纤维中提取快速、稳健、高效的蛋白质的优化方法也可以很容易地应用于其他基于组织的样品中。
此处显示的是上清液的蛋白质图和大脑中和心脏组织样本的颗粒。在尝试此程序时，重要的是要记住使样品完全均质化，将上清液与颗粒分离，并去除污染物和萃取试剂。该技术开发后，为实验和转化眼科领域的研究人员以猪眼模型为模型，彻底探索眼血管的蛋白质组铺平了道路。
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概述
本研究重点关注眼部微血管床的蛋白质组特征，这对于理解眼部疾病至关重要。利用猪短后脉络膜动脉作为模型，它提出了一种快速且稳定的蛋白质提取方法，适用于基于质谱的蛋白质组分析。
关键研究组成部分
研究领域
- 蛋白质组学
- 眼部生物学
- 眼部病理的分子机制
背景
- 理解眼部微血管对于阐明健康和疾病机制至关重要。
- 适用于质谱的样品对于全面的蛋白质组分析至关重要。
- 所开发的工作流程可以应用于各种基于细胞和组织的样品。
所用方法
- 从猪短后脉络膜动脉提取蛋白质
- 使用均质机和离心机进行样品制备
- 一维凝胶电泳用于蛋白质分离
主要结果
- 成功的眼部血管分离和制备方法。
- 生产适合质谱的高质量样品。
- 展示了该方法对其他生物样品的通用性。
结论
- 该研究建立了一种可靠的眼部微血管蛋白质组分析方法。
- 本研究对眼部生物学研究和眼部疾病的理解做出了重大贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust sample preparation is critical for reliable proteomic analysis of mass-limited ocular microvessels, enabling mechanistic de-risking in target validation for ophthalmic drug discovery. This workflow supports predictive confidence by ensuring reproducible protein extraction from supernatant and pellet fractions, facilitating downstream biomarker identification and pathway analysis. The method’s adaptability to other tissue-based samples enhances enterprise reuse across discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating protein signaling pathways in ocular vascular beds.
- Operational Value: Provides standardized protein extraction from supernatant and pellet, reducing variability in target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery and mechanistic de-risking through high-quality MS-compatible samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization using cleaned protein extracts.
- Operational Value: Ensures reproducibility via centrifugal filter cleaning and gel electrophoresis steps.
- Scalability: Enables platform reuse across tissue types, supporting consistent compound screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving ocular microvessel proteome integrity for translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through consistent sample preparation.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by minimizing sample loss in mass-limited analyses.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing and pathway clarification in ocular vasculatures, supporting lead identification through reliable proteomic profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking via protein extraction from supernatant and pellet fractions.
- Screening: Ensures assay readiness through contaminant removal and standardized protein quantification.
- Analytics: Generates quantitative peptide outputs for label-free LC-MS/MS analysis, enabling condition comparisons.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving ocular vascular proteome integrity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other tissue-based samples, positioning it as a reusable capability across discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high-yield, reproducible protein extraction from mass-limited samples.
- Operational Value: Standardization and scalability via centrifugal filter cleaning and reproducible gel electrophoresis.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false negatives in target validation assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via reliable proteomic data from ocular microvessels.
Implementation Considerations
- Expertise in microsurgical isolation of ocular microvessels and protein extraction techniques.
- Instrumentation including homogenizers, centrifuges, ultrasonic processors, and LC-MS/MS systems.
- Cross-team standardization of sample cleaning and fractionation protocols.
- Adaptation considerations for varying tissue densities and protein yields across model systems.
- Practical limitations include sample loss during multiple filtration steps and dependency on complete homogenization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
Isolation of Short Posterior Ciliary Arteries
2:17
Sample Preparation
3:43
Pellet Digestion
4:40
Sample Cleaning and Buffer Exchange
5:40
One-dimensional Gel Electrophoresis (1DE)
6:50
In-gel Tryptic Digestion
9:23
Results: Comparison of Protein Extraction Efficacy and Robustness and Representative 1DE Gel Analysis
10:51
Conclusion
