Name: 利用目标筛选和非靶向筛选高分辨率质谱相结合的工作流程识别跨氟和多氟化学物种 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习利用高分辨率质谱结合目标筛选和非靶向筛选的工作流程，识别水样中的全氟和多氟烷基物质。该方法可同时定量已知PFAS并发现新型化合物，为环境监测提供全面分析方案。

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美国环境保护局通过其研究与发展办公室资助并管理了本文所述的研究。本文件已由美国环境保护局研究与发展办公室审查，并批准发表。本文所表达的观点属于作者个人观点，不一定代表美国环境保护局的观点或政策。本研究部分得到了橡树岭科学与教育研究所管理的国家暴露研究实验室博士后研究项目的资助，该项目由美国能源部与美国环境保护局之间的机构间协议 DW89992431601 支持。

1. 水样的采集
<ol>
	<li>PFAS 标准储备液的制备
	<ol>
		<li>在甲醇中配制含有目标化合物（例如 PFOA、PFOS、HFPO-DA）的 PFAS 标准混合液，浓度为 1 ng/µL。此为原生 PFAS 混合液。也可使用市售的混合标准品（如 PFAC Mix A 和 Mix B）。</li>
		<li>配制含有对应稳定同位素标记（SIL）PFAS 化合物的标准混合液（例如 13C4-PFOA、13C8-PFOS、13C3-HFPO-DA），浓度为 1 ng/µL。此为内标 PFAS 混合液。也可使用市售的混合标准品（如 MPAFC Mix A 和 Mix B）。 
		注：若目标 PFAS 无可用的稳定同位素标记版本，可使用结构和碳链长度相似的替代物（例如用 13C2-PFHxA 代替 HFPO-DA）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>现场空白（FB）和加标空白（SB）样品的制备
	<ol>
		<li>用 1,000 mL 已知不含 PFAS 的实验室去离子水（DI 水）填充两个洁净的高密度聚乙烯（HDPE）或聚丙烯（PP）瓶。 
		注意：PFAS 材料常具有未明确的毒性及/或致癌性。操作标准品或储备液时应避免经口或皮肤接触。</li>
		<li>向其中一个瓶子中加入适量 PFAS 标准混合液，使其最终浓度相当于预期样品浓度（例如 100 ng/L）。此样品为加标空白（SB）。</li>
		<li>向加标空白样品中加入 5 mL 35% 硝酸作为保存剂。</li>
		<li>将加标空白样品和未加标的现场空白样品一同带至采样地点，作为对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>现场采样 
	注：采样人员应佩戴腈手套，并尽可能从流动系统中采样。对于自来水样品，应在采样前让水流持续排放并达到平衡状态（2–3 分钟）。
	<ol>
		<li>在野外采样点，用洁净的 HDPE 或 PP 瓶采集 500–1,000 mL 水样。</li>
		<li>向样品瓶和现场空白瓶中各加入 5 mL 35% 硝酸保存剂。 
		注意：硝酸具有腐蚀性，且为强氧化剂</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品提取
注意：全氟和多氟烷基物质（PFAS）普遍存在且难以降解。确保所用溶剂均为最高纯度，并已检测确认含有极低水平的PFAS污染。在配制空白样品和待测样品前，应彻底清洗用于配制标准溶液的所有实验设备。
<ol>
	<li>样品预处理
	<ol>
		<li>将每个样品分别倒入已预先清洗的1 L HDPE量筒中，并记录精确体积。</li>
		<li>向空的样品瓶中加入10 mL甲醇，盖紧瓶盖，充分振荡，以冲洗瓶内吸附的PFAS。</li>
		<li>将测定后的水样与甲醇冲洗液一同倒回已冲洗过的瓶子中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量标准曲线
	<ol>
		<li>用不含PFAS的去离子水填充八个1 L的高密度聚乙烯/聚丙烯瓶。</li>
		<li>选择八个均匀分布的浓度，覆盖所需的定量范围。例如：10、25、50、100、250、500、750 和 1,000 ng/L，适用于 10–1,000 ng/L 的范围。</li>
		<li>向每个瓶子中加入适量的天然PFAS混合物，以达到2.2.2节中规定的最终PFAS浓度（例如，向1 L去离子水中加入100 µL PFAS混合物A = 100 ng/L）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内标加入法 
	注意：仅当除非靶向分析外还需要获得定量结果时，才必须添加稳定同位素标记的内标（IS）。
	<ol>
		<li>将IS PFAS混合物添加至各样品中，浓度近似校准曲线的中点（例如，250 µL IS PFAS混合物 = 250 ng/L）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤
	<ol>
		<li>使用GF/A玻璃纤维滤膜（47 mm，1.6 µm孔径）在温和负压下过滤样品，收集至预先清洗过的1 L HDPE真空抽滤瓶中。</li>
		<li>如果瓶中仍有颗粒物残留，用额外的去离子水冲洗并转移至滤膜中。将过滤后的水返回至样品瓶或新的容器中，用于固相萃取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固相萃取（SPE） 
	注意：此处所述的滤芯浓缩方法使用恒流活塞泵。也可采用真空多联泵等其他浓缩方法。20 或使用在线固相萃取-液相色谱-质谱联用技术17 设置是可行的，但本文不作讨论。
	<ol>
		<li>用25 mL甲醇活化弱阴离子交换（WAX）小柱。</li>
		<li>用额外的 25 mL 去离子水润洗 WAX 柱。</li>
		<li>将泵抽管置于过滤后的样品瓶中，并用相应的样品名称标记固相萃取小柱。</li>
		<li>以10 mL/min的稳定流速将500 mL样品水通过滤筒，弃去穿滤液。 
		注意：可根据预期的样本浓度浓缩更大或更小的体积。</li>
		<li>从活塞泵上取下用于洗脱的色谱柱。 
		注意：若使用同一泵浓缩额外的样品，在安装下一个用于平衡的萃取柱之前，应先用25 mL甲醇冲洗活塞泵。</li>
		<li>将固相萃取柱转移至真空 manifold，并连接外部玻璃储液罐。</li>
		<li>用4 mL 25 mM、pH 4.0的醋酸钠缓冲液在温和负压下冲洗固相萃取柱，弃去流出液。用4 mL中性甲醇洗涤固相萃取柱。 
		注意：如果预期存在特定的非离子极性分析物，可收集中性洗涤组分；否则，将其弃入废液。</li>
		<li>在每个固相萃取柱下方放置一个15 mL聚丙烯离心管以收集洗脱液。用4 mL含0.1%氢氧化铵的甲醇溶液洗脱样品。</li>
		<li>移除洗脱管，并在40 °C水浴中用干燥氮气流吹干，将洗脱液体积浓缩至500 – 1,000 µL。</li>
		<li>浓缩的样品提取物可在室温下储存，待分析前使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>靶向LC-MS/MS定量
	<ol>
		<li>将100 µL样品提取液用300 µL的2 mM乙酸铵缓冲液稀释至HPLC样品瓶中。</li>
		<li>根据制造商的说明校准并平衡高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）系统。 
		注意：由于大多数液相色谱系统中使用了含氟聚合物组件以及样品瓶隔垫，背景中的全氟和多氟烷基物质（PFAS）常被检出。在使用前应确认空白样品中的可检出水平可忽略不计。建议在可行的情况下对液相色谱系统进行改造，替换其中的聚四氟乙烯（Teflon）组件。建议使用分析级 &#34;滞留&#34; 建议使用位于液相色谱混合阀旁边的色谱柱29.</li>
		<li>准备一份分析工作列表，包括标准曲线、样品以及标准曲线的一个额外重复，用于评估运行过程中仪器的漂移情况。示例如下所示： 表1.</li>
		<li>使用针对目标化合物建立的液相色谱和质谱方法分析样品。示例液相色谱梯度如图所示 表2 质谱方法参数如图所示 表3 和 表4更详细的讨论可参见 McCord 等人的研究。21.</li>
		<li>使用分析物与内标物的峰面积比值对分析物浓度绘制标准曲线。采用以1/x加权的二次回归公式进行浓度预测。9.</li>
		<li>使用制备的标准曲线及每次测定的峰面积比（标准品峰面积/内标峰面积）对各样本中的靶向分析物进行定量。</li>
		<li>若浓度超出校准范围，需用添加了适当内标浓度的去离子水稀释原始样品，重新萃取以使浓度落入合适范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非靶向液相色谱-串联质谱数据采集
	<ol>
		<li>将100 µL样品提取液用300 µL的2 mM乙酸铵缓冲液稀释至HPLC样品瓶中。</li>
		<li>根据制造商说明校准并平衡高效液相色谱仪和高分辨率质谱仪。</li>
		<li>按照 2.6.2 中的方法制备分析工作列表。</li>
		<li>使用仪器软件，以数据依赖模式采集包含宽扫描 MS1 的 LC-MS 数据，用于获取 MS/MS。示例 LC 梯度如下 表5有关仪器设置的进一步讨论可参见 Strynar 等人的研究。30 和 Newton 等人31. 
		注意：为了提高 MS/MS 质量，可在完成 2.8.1–2.8.8 步骤的数据处理后，针对剩余特征中的部分目标离子列表，进行优先离子选择的数据依赖性分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非靶向数据处理 
	注意：数据分析可采用多种软件完成，此处所述方法并非针对任意数据集的唯一或最佳方法。在可能的情况下，步骤描述均为通用性说明，可在其他软件中实施。本论文所用示例数据的处理是依据 Newton 等人所述方法，使用特定厂商软件（Software 1 和 Software 2）完成的。31.
	<ol>
		<li>使用多种开源软件包之一对化学特征进行分子特征提取32,33 或使用厂商软件来鉴定化学特征的单同位素质量、保留时间以及积分峰面积。
		<ol>
			<li>在软件1中选择 添加/移除样本文件 &#62; 添加文件 并选择非靶向实验的原始数据，然后点击 好的.</li>
			<li>在软件1中选择 批量递归特征提取 &#62; 开放方法… 加载预设方法，或手动编辑软件设置。特征提取的Profinder设置位于 表6.</li>
			<li>在 软件 1在特征提取后，选择 文件 &#62; 导出为 CSV…，文件 &#62; 导出为 CEF…，或 文件 &#62; 导出为 PFA… 用于进一步处理。在后续描述中均假定使用 CEF 文件。</li>
			<li>在软件2（MPP）中创建一个新实验，类型为 未识别 和工作流程类型 数据导入向导 并点击 好的.</li>
			<li>在 MPP 选择数据文件 并定位到要导入的导出软件1结果（CEF 或 PFA）；然后单击 下一步 直到 对齐参数 选项出现。</li>
			<li>在 MPP 中，将化合物对齐值设置为 0.0（对齐已在软件 1 的特征提取步骤 2.8.1.2 中完成），然后单击 下一步 直至完成所有步骤 完成 是可获得的。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据分析重复性筛选鉴定结果。当存在多个重复样本时，特征应在其中出现 &#62;80% 的独立重复样本，并具有分析变异系数（CV） &#60; 30%
		<ol>
			<li>在 MPP 中选择 实验装置 &#62; 实验分组 为每个原始文件分配一个与其来源样本相对应的组（即，来自相同来源的重复样本应归为同一组）。可根据嵌套变量创建多个组（例如，仪器重复与技术重复）。</li>
			<li>在 MPP 中选择 实验装置 &#62; 创建解读 然后选择实验参数（即分组）并点击 下一步 直到 完成 是可用的。这将创建一个可供后续筛选操作的类别。</li>
			<li>在 MPP 中选择 质量控制 &#62; 按频率筛选. 将实体列表设置为 所有实体 以及在 2.8.2.2 中创建的样本组（非平均值）的解释，然后点击 下一步.</li>
			<li>对于输入参数，将实体保留率设置为在至少一个条件下采样值的80%，然后点击 下一步 直到 完成 可用。将列表命名为频率滤波特征</li>
			<li>在 MPP 中选择 质量控制 &#62; 样本变异性筛选将实体列表设置为2.8.2.4中的频率滤波特征，解释方式设为组别（非平均），然后点击 下一步.</li>
			<li>选择单选按钮 原始数据 感兴趣范围与变异系数 &#60; 30%。点击 下一步 &#62; 完成 并将列表保存为 CV 过滤特征。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>移除所有样本均无显著更高值的特征&#62;3 倍）的丰度高于现场空白（FB）样品。
		<ol>
			<li>在 MPP 中选择 分析 &#62; 倍数变化. 将实体列表设置为 CV 滤波特征 以及对样本组的解释，然后点击“下一步”。选择“倍数变化”选项以 所有对照单一条件 并选择条件 FB 或空白处理样品所在组的名称。</li>
			<li>在下一个界面中，将倍数变化（Fold-Change）阈值设为 3.0，并点击完成后续提示。将该列表保存为 FC 过滤列表.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对感兴趣的单个样本与适当的背景样本进行两两比较（例如点源上游与下游），以确定单个化学特征的倍数变化。
		<ol>
			<li>在 MPP 中选择 分析 &#62; 火山图筛选. 将实体列表设置为 FC 过滤列表 以及对组别的解读。</li>
			<li>对于倍数变化条件配对，选择两个样本进行比较（例如，配对的上游和下游样本），并选择检验方法 曼-惠特尼非配对检验.</li>
			<li>初步分析时，在下一个界面中不要选择多重检验校正的数值，直接点击进入结果图。</li>
			<li>在结果界面中，选择 3.0 的倍数变化阈值和 0.1 的 p 值阈值。然后 完成 并导出列表为 初步结果.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对过滤后保留的每个特征，根据精确质量和复合质谱生成预测的化学分子式。
		<ol>
			<li>在 MPP 中选择 结果解读 &#62; IDBrowser 鉴定 以及 初步结果 实体列表</li>
			<li>在 IDBrowser 中选择 鉴定所有化合物 使用分子式生成器（MFG）作为鉴定方法。</li>
			<li>在“生成分子式”选项中，将 F 添加到元素列，并将最大值设置为 50，然后选择 完成生成公式后选择 保存 和 返回 返回 MPP。</li>
			<li>在 MPP 中，右键单击经过筛选且 MFG 匹配的实体列表，然后选择 导出列表保存结果。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>检查还原后的显著化学特征列表中各物种的单同位素质量，筛选出含有提示氟化修饰的质量偏差的物种；参见 Kind 和 Fiehn34.</li>
		<li>注意含有常见多氟化结构单元（CF2 （m/z 49.9968），CF2O (m/z 65.9917)，CH2CF2O（m/z 80.0074）等，可使用质荷比偏差图或软件算法实现；详见讨论部分，Liu 等人。17，Loos 等35 ，以及 Dimzon 等人36.</li>
		<li>将预测的化学式或中性质量在EPA Chemistry Dashboard数据库和/或其他数据库中进行检索，以获得可能的化学结构。
		<ol>
			<li>打开美国环境保护署（EPA）Comptox 化学品仪表板批量搜索工具（https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search），在选择标识符类型（即 MS-ready Formula 或 Monoisotopic Mass）后，将标识符列表（分子式或质荷比）粘贴至标识符输入框中。</li>
			<li>选择 下载化学数据… 并从下拉菜单中选择所需的物理/化学/毒理学数据，以用于潜在匹配。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>利用化学直觉和可获取的参考数据，根据化学稳定性、电离性或疏水性等物理性质、邻近来源中生产化学品的存在情况等因素，排除各分子式对应的潜在化学结构列表中不合理的匹配项。在缺乏额外数据的情况下，可单纯依据文献中出现的频率对谱图的合理性进行排序；参见 McEachran 等人的研究。37.</li>
		<li>使用可用的标准品和/或通过将碎片离子的靶向高分辨 MS/MS 谱图与数据库中的谱图进行比对，以确认结构。 计算机模拟 理论光谱，或人工审编。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

样品处理与制备 
在任何靶向分析中，加入参考标准品/加标标准品都至关重要，因为它们可用于验证分析结果的有效性。若缺乏质控样品，则无法评估结果的准确性；而氟化学物质普遍存在，现场样品、处理材料或液相色谱-质谱（LC-MS）系统发生偶然污染的情况并不少见，必须予以考虑。此外，使用标准品还有助于验证实验方案，无论日常样品处理过程中存在何种变异，因为许多步骤（尤其是固相萃取（SPE）和样品浓缩步骤）可能具有高度变异性。传统和新型全氟化合物的提取效果会受到浓缩过程中固定相选择以及样品来源中组分（如pH值和盐度46）的显著影响。如果研究特别关注某一类全氟化合物，则应充分考虑样品条件的影响。若实验室具备相应条件，且后续数据分析方法相似，也可采用其他适用于水相提取物的样品制备方案。
靶向数据分析 
对于具有可用标准品且配有匹配的稳定同位素标记内标的化合物，数据分析的主要关注点在于仪器性能，而方法检出限和适宜报告范围可通过标准方法在各实验室内部确定，例如通过低浓度标准加标样品的信噪比47。在缺乏匹配内标的情况下，可能因基质效应不匹配而产生误差，此时可通过加标样品的准确回算来评估测量结果的准确性。当缺少标准品以绘制校准曲线时，可将未知物视为结构相近的标准化合物进行相同处理，从而获得定量估算值，但此类估算的误差可能高达10倍以上，且难以准确量化其不确定性，详见McCord、Newton和Strynar21。在此类情况下，仍可获取趋势性数据，但浓度估算本质上不可靠。
非靶向数据分析 
峰提取参数设置对所鉴定化学特征的数量有显著影响，同时也极大地影响特征选择的质量。峰提取过程中需要关注的决策包括：1）纳入质谱图的单个质荷比信号强度，即离子丰度阈值；2）被认定为特征的提取色谱峰强度，即特征丰度阈值；3）特征检测频率，即重复性阈值；以及 4）分析变异程度，即变异系数（CV）阈值（图10）。
设定过低的峰提取阈值会导致样本分析时间呈指数级增长，以解析丰度越来越低的额外特征（表7）。离子丰度阈值用于过滤质谱特征，排除那些个体同位素丰度未达到阈值的信号。理想情况下，该步骤仅保留具有高质量质谱图的特征，确保其为真实的化学信号而非仪器噪声，从而支持后续的分子式预测。合适的阈值应基于仪器噪声水平设定，理想情况下至少为MS1扫描噪声阈值的3倍。特征丰度阈值则根据提取出的色谱特征的强度或峰面积来过滤化学特征。此步骤可排除低丰度峰，这些峰通常色谱质量较差、变异度高，或由软件提取不佳所致。合适的阈值需根据实验条件和样品基质，结合可接受的低质量特征生成水平（例如，低于阈值的特征表现出不可接受的差色谱行为）进行确定。进一步的分析质量控制可在色谱层面剔除特征，依据包括在分析重复样和/或制备重复样中鉴定结果不一致（重复性阈值），或在重复样之间重现性差（变异系数CV阈值）。合适的阈值水平取决于所用峰积分软件的质量以及待分析化学物质的性质。对于水溶性全氟化合物及经过轻度优化的积分流程，应在80%以上的分析重复样中检测到特征，且预期CV值低于30%，具体如方法部分所述。
非靶向分析检测到的峰无法提供所检测物质浓度的定量估计。此外，由于新颖化合物在公开可用的数据库中不存在，因此很难确认真正未知物的身份。新颖结构的确定需要结合多种方法进行深入分析，并要求在质谱学和化学领域均具备专业知识。然而，对化学特征的峰面积进行归一化处理，可基于已知物种对未知物的浓度提供半定量估计21。如果采用一致的采样和制备步骤，则可以生成单个物种的时间趋势信息，用于监测某种化学物质未来的持续存在情况，因为单个物种的响应在基质无显著变化的情况下应保持一致21。
该方法的主要优势在于样品处理的可扩展性，可同时支持靶向和非靶向分析。虽然靶向分析能够提供等效或更优的定量信息，但在处理新型和新兴材料及其与基质材料关系时，其分析广度明显不足。采用仅基于已知材料和有限数据库的靶向方法，甚至可疑物筛查方法，完全无法识别此前未观察到的物质，即使这些物质可能具有显著的健康影响。随着软件的改进和数据库的不断完善，对未知物鉴定的准确性将持续提高，同时分析该方法所产生的多维数据所需的时间投入和专业知识水平也将相应降低。然而，当前产生的数据具有重要的未来价值，因为数据存档允许使用新开发的软件进行事后分析，并实现跨时间的数据比较，即使目前尚无法确定所检出化合物的身份。

全氟和多氟烷基物质（PFASs）是一类具有显著公共卫生关切的持久性有机污染物。美国环保署（EPA）已为其中特定化合物全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）设定了饮用水健康建议水平1,2，其在美国的主要生产已于2000年代停止3,4。为了深入理解PFAS材料在纺织品和消费品制造领域的性能，数百乃至数千种替代性PFAS化学物质已被开发出来，以满足不同产品的特定需求，包括取代已被淘汰的化合物5,6,7,8。目前仍需持续监测环境中直链全氟羧酸和磺酸类物质（如PFOS、PFOA及其同系物系列）的含量水平，但新兴化学物质往往未被现有方法（如EPA方法537）所覆盖9，且通常缺乏用于传统靶向分析的标准品。因此，本实验方案具有双重目的：一方面提供了一条在分析标准品可用的情况下对水中氟化学物质进行靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析的路径；另一方面详细阐述了一种基于非靶向高分辨质谱的数据分析方法的无缝整合，从而能够在同一样品中检测出未知或意料之外的化合物。
固相萃取（SPE）是一种成熟的技术，用于样品的净化和浓缩，适用于多种分析物和样品基质10,11。在PFAS分析中，已不同程度地应用了多种固相保留相，包括非极性、功能化极性和离子交换柱，用于从多种基质中分离不同亚类的含氟化合物9,12,13,14,15,16。采用在线装置进行SPE样品分析的技术进步显著提高了方法的通量，并改善了样品处理的重现性，但其基本流程保持一致17。一些研究也尝试通过大体积进样来省去离线浓缩步骤，但这些方法需要对色谱条件进行修改，使其超出常规分析的适用范围18,19。本研究的样品分析采用聚合物弱阴离子交换（WAX）保留相，可有效将酸性PFAS物质与传统有机污染物完全分离，同时实现较高的样品浓缩倍数。该WAX相对于捕获短链全氟化合物（如全氟丁烷磺酸盐，PFBS）或全氟醚类化合物（如六氟丙烯氧化物二聚酸，HFPO-DA）尤为重要，这些化合物比长链的传统全氟化合物更具极性20,21。鉴于近年来PFAS化学结构显著向短链含氟化合物和含醚结构转变5，选择该保留相有助于更全面地回收新型化合物，用于质谱分析。
使用经过验证的标准品和稳定同位素标记的内标进行靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析，可为定量检测提供无与伦比的特异性和灵敏度。尽管该方法在许多情况下具有优势，但在实际分析中常常面临不切实际的局限性。靶向分析仅适用于样品中预期存在的化合物，并且前提是已有建立好的检测方法。对于新出现或未知的化合物，该方法甚至无法检测到可能具有重要意义的物质，无论其化学性质或浓度如何；此外，低分辨率质谱仪几乎无法提供足够的信息以对未知化合物做出明确的化学鉴定。因此，非靶向分析领域应运而生，利用现代高分辨率质谱仪的强大能力，在无需预先假设的情况下对样品进行全面分析，并对样品中可检测到的特征峰进行回溯性的化学物质鉴定。该方法已在生物学22,23,24和环境科学25,26,27领域广泛应用于多种类别的化学物质研究。全氟化合物由于具有独特的质谱图谱特征，在此方法中尤为易于识别，仅在过去几年中就已报道了数百种此类化合物5,28。
本文讨论的方案旨在将靶向的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）全氟和多氟烷基物质（PFAS）定量分析与识别及半定量监测新兴关注化合物的需求相结合。固相萃取（SPE）填料的选择和样品前处理技术旨在确保从水中有效富集极性更强的新兴PFAS酸类化合物，但可能对长链聚合物类及非离子型化合物的适用性较低。此外，非靶向分析所产生的数据具有高密度和高维度的特点，因此必须借助数据分析软件进行处理。此类软件通常具有仪器厂商特异性，且在不同仪器平台之间使用时常需进行调整。在可能的情况下，本文以通用方式描述了分析流程，并引用了开源或免费软件的替代方案，但任何软件方法的效率与准确性均需根据具体情况进行独立评估。

<table><tbody><tr><td>Acqity 超高效液相色谱系统&amp;nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>经PFCs分析套件（176001744）改装；若经检测并确认PFAS背景值较低，其他等效UPLC系统亦可接受</td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Fluka</td><td>17836</td><td>质谱级，&gt;99%纯度</td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler</td><td>AB204S</td><td></td></tr><tr><td>BEH C18反相UPLC色谱柱，2.1&amp;times;50&amp;nbsp;mm，1.7&amp;nbsp;&amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186002350</td><td></td></tr><tr><td>双活塞注射泵&amp;nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>SPC10-C</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>玻璃微纤维滤膜</td><td>Whatman</td><td>1820-070</td><td></td></tr><tr><td>高密度聚乙烯样品瓶&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>2189-0032&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>高分辨质谱仪</td><td>Various</td><td></td><td>质谱仪应能提供优于&amp;lt;10 ppm的精确质量测定，并可采集MS/MS数据。&amp;nbsp;本研究中使用了Agilent 6530 qTOF和Thermo Fisher Orbitrap Fusion</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸（35% w/w）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SVCN-5-1</td><td>可使用浓硝酸与试剂水自行配制</td></tr><tr><td>聚丙烯布氏漏斗</td><td>ACE Glass</td><td>12557-09&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯离心管及管盖</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯真空抽滤瓶（1 L）</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td></td></tr><tr><td>Quattro Premier XE三重四极杆质谱仪&amp;nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>可使用等效或更高级别的三重四极杆系统，应具备高灵敏度和稳定性，适用于靶向分析</td></tr><tr><td>试剂水</td><td></td><td></td><td>任何经确认不含PFAS的水源</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406</td><td></td></tr><tr><td>TurboVap氮吹浓缩仪&amp;nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>103198</td><td>可使用等效系统或旋转真空浓缩仪替代</td></tr><tr><td>弱阴离子交换固相萃取小柱（Oasis WAX Plus）</td><td>Waters Corporation</td><td>186003519</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;标准溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,3,3-四氟-2-(1,1,2,2,3,3,3-七氟丙氧基)丙酸（HFPO-DA）</td><td>Wellington</td><td>HFPO-DA</td><td></td></tr><tr><td>其他目标化合物标准品</td><td></td><td></td><td>根据初步分析结果及标准品可获得性确定</td></tr><tr><td>同位素标记HFPO-DA</td><td>Wellington</td><td>M2HFPO-DA</td><td></td></tr><tr><td>天然PFCA/PFAS混合标准溶液（2 µg/mL）</td><td>Wellington</td><td>PFAC-MXA</td><td>或PFAC-MXB；或根据目标化合物自行配制的混合溶液</td></tr><tr><td>稳定同位素标记PFCA/PFAS混合标准溶液（2 µg/mL）</td><td>Wellington</td><td>MPFAC-MXA</td><td>或MPFAC-MXB；或根据天然PFAS种类适当配制的含目标化合物的混合溶液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass Profiler Professional</td><td>Agilent</td><td></td><td>或开源软件包</td></tr><tr><td>Profinder</td><td>Agilent</td><td></td><td>或开源软件包</td></tr></tbody></table>

采用靶向与非靶向筛查相结合的高分辨质谱工作流程鉴定全氟和多氟化合物

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

长期以来，全氟和多氟烷基物质（PFASs）作为一类历史性和新兴污染物，已引起从地方到联邦各级政府机构及公众的广泛关注。PFAS化学物质的持续演变给环境监测带来了挑战，因为针对新发现化学化合物的靶向分析方法的开发往往滞后于其发现进程。因此，亟需具备前瞻性的方法学手段，以检测新出现且未预期的化合物，实现对这些物质的长期监测，并解析其化学结构细节，从而为未来的人类健康研究奠定基础。为此，高分辨质谱非靶向分析提供了一种广泛的检测策略，可与几乎任何样品前处理方案相结合，并在检测后显著提升化合物的鉴定能力。本文介绍了一种基于固相萃取（SPE）的样品富集方法，该方法针对短链且更具亲水性的PFAS化学物质（如全氟醚酸和磺酸盐类）进行了优化，并描述了以此方式制备的样品在靶向与非靶向两种模式下的分析流程。当有标准参考物质时，靶向方法可实现更优的定量性能，但在分析过程中本质上仅限于预期中的化合物。相比之下，非靶向分析方法能够识别未知化合物的存在，并提供部分化学结构信息。这些化学特征信息可用于关联不同采样点的化合物，并追踪其丰度与出现频率随时间的变化规律。

本文介绍了一种通过质谱法对水中氟化物进行顺序靶向定量和非靶向分析的实验方案。该方法可提供已知氟代化学物质的定量水平，并对相关样品中的未知化学物质进行鉴定，同时对其丰度进行半定量估算。

历史性和新兴的全氟和多氟烷基物质（PFASs）已引起公众和政府机构的广泛关注，从……

与仅针对已知目标物的分析方法相比，该方法能够在同一样品中实现对已知全氟和多氟烷基物质（PFAS）的定量，并发现新的化合物，从而避免遗漏新出现的关注物质。本方案针对更广泛种类的PFAS化合物，这些化合物代表了最新出现的化学物质。若根据目标化合物调整浓缩步骤，此处使用的检测方法可适用于任何一类化学物质。采集野外样品时，应佩戴腈手套，使用洁净的高密度聚乙烯（HDPE）或聚丙烯瓶从野外采样点收集 500 至 1,000 毫升水样。向样品瓶和现场空白样中各加入 5 毫升 35% 硝酸防腐剂，并将样品运送回实验室。将每个样品分别倒入预先清洗过的 1 升高密度聚丙烯量筒中，并记录样品的准确体积。在每个已倒空的样品瓶中加入10毫升甲醇，盖紧瓶盖后剧烈振荡，以冲洗瓶内壁吸附的全氟和多氟烷基物质（PFAS）。随后，将量取的水样连同甲醇冲洗液一并返回至已冲洗的样品瓶中。为获得定量用的标准曲线，取八个空的1升样品瓶，装入无PFAS的去离子水，并标记八个覆盖所需定量范围的等间距浓度梯度。接下来，向每个瓶子中加入适量的天然PFAS混合物，以获得相应的PFAS浓度，并向每个样品中加入内标PFAS混合物，其浓度应接近校准曲线的中点。然后，在温和真空条件下，通过玻璃纤维A滤膜将样品过滤至各自预先清洗过的1升高密度聚丙烯真空滤瓶中。如果瓶中仍有颗粒物残留，用额外的去离子水冲洗，并将洗涤液过滤至滤瓶中。进行固相萃取时，将过滤后的水样倒回样品瓶中，用25毫升甲醇和另外25毫升去离子水对弱阴离子交换（WAX）小柱进行活化。将泵的抽吸管置于过滤后的样品瓶中，并用相应的样品名称标记固相萃取（SPE）小柱。以每分钟10毫升的稳定流速，将每份样品500毫升通过各自的小柱，弃去流出液。从活塞泵上取下WAX SPE小柱，将SPE小柱转移至配有外置玻璃储液瓶的真空 manifold 上。在轻柔的真空条件下，用4毫升25毫摩尔、pH为4的醋酸钠缓冲液冲洗每个SPE小柱，随后用4毫升中性甲醇洗涤。洗涤结束后，在每个SPE小柱下方放置一个15毫升聚丙烯离心管以收集洗脱液，并用4毫升含0.1%氢氧化铵的甲醇溶液洗脱样品。然后，取下洗脱管，在40摄氏度水浴中用干燥氮气流吹干，将洗脱液体积浓缩至500至1,000微升。对于靶向液相色谱-串联质谱分析，取100微升样品提取物，加入300微升含2毫摩尔醋酸铵的缓冲液，置于高压液相色谱样品瓶中稀释，并制备分析工作列表，包括标准曲线、样品以及额外的一份标准曲线重复样，以评估运行过程中仪器的漂移情况。采用针对目标化合物建立的标准液相色谱-质谱分析方法进行样品分析。分析结束后，使用分析物与内标物的峰面积比值对分析物浓度绘制标准曲线，并采用1/x加权法生成二次回归方程，用于浓度预测。利用制备的标准曲线及每次测定时的峰面积比值，对各样品中的目标分析物进行定量。若浓度超出校准范围，需用添加适当浓度内标物的去离子水稀释原始样品，重新提取，使浓度落入合适范围内。对于非靶向液相色谱-串联质谱分析，取100微升样品提取物，加入300微升2毫摩尔的乙酸铵缓冲液，稀释至高效液相色谱样品瓶中。设置工作列表后，使用仪器软件以数据依赖模式进行宽扫描，采集液相色谱-质谱数据。对于非靶向数据处理，打开相应的分子特征提取软件包，选择“添加/移除样品文件”中的“添加文件”，并选择来自非靶向实验的原始数据。单击“确定”，然后选择“批量递归特征提取”并打开方法，以加载预设方法或手动编辑软件设置。针对过滤后保留的每个特征，根据精确质量和复合质谱生成预测的化学式，并打开美国环境保护署（EPA）CompTox化学品仪表板批量搜索工具。为针对预测的化学式或中性质量进行搜索以获得潜在的化学结构，请选择标识符类型，并将标识符列表粘贴到标识符输入框中。从下拉菜单中选择下载化学数据，以及所需的物理、化学或毒理学数据，用于潜在匹配。然后，利用可用的标准物质和/或通过将碎片的高分辨串联质谱与数据库中的谱图、计算机模拟的理论谱图进行比对，或通过人工校验，确认结构。定量液相色谱串联质谱结果以离子色谱图形式呈现，包括总离子色谱图以及所测化学品特定化学跃迁的提取离子色谱图。化学跃迁的积分峰面积与化合物的丰度相关，可通过相对于内标物归一化的校准曲线来计算其精确浓度。使用全扫描质谱进行非靶向分析可获得样品的总离子色谱图，从而能够事后生成各个离子的提取离子色谱图。由于含氟原子比例较高，全氟和多氟烷基物质（PFAS）化合物具有负的质量偏差，而多氟化合物的质量偏差为正值，但显著小于相应有机同系物的质量偏差。第二种过滤方法是利用适当的软件包，识别含有全氟和多氟烷基物质（PFAS）常见重复单元的同系物系列。根据高分辨质谱数据，可将一个或多个假定的化学式与质谱图的同位素指纹进行匹配并评分。通过串联质谱数据可进一步确认化学式，并获得部分结构信息。进一步的质谱实验可用于确认新化合物的结构，样品间的比较可提供有关化学物质存在情况及其相对含量的信息。为验证定量和非靶向检测结果，设置适当的空白样品和质量控制样品以匹配基质极为重要。上述策略通过实现未知物的发现及其结构预测，已成为全氟和多氟烷基物质（PFAS）环境筛查的新方法。

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环境

利用目标筛选和非靶向筛选高分辨率质谱相结合的工作流程识别跨氟和多氟化学物种

采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱型分析是研究代谢的重要手段。本文概述了用于血清非靶向代谢物谱型分析的典型工作流程，包括样本组织与制备、数据采集、数据分析、质量控制以及代谢物鉴定。...

大规模非靶向血清代谢组学分析：超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

质子转移反应飞行时间质谱法可实现对挥发性有机化合物的高灵敏度、快速且无创的分析。为展示其应用潜力，本文提供三个示例：酸奶的乳酸发酵过程（在线生物过程监测）、不同苹果基因型（大规模筛查）以及饮用咖啡后经鼻腔空间的分析（鼻腔空间分析）。...

PTR-ToF-MS 联用自动采样系统及定制化数据分析在食品研究中的应用：生物过程监测、筛选与鼻腔空间分析

本文描述了一种通过液相色谱/质谱法改进的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，用于河豚物种的基因分型。该方法采用反相硅胶整体柱分离经酶切后的扩增产物。此技术可解析寡核苷酸的单一同位素质量，有助于碱基组成的鉴定。...

通过液相色谱/质谱法改进河豚毒素鱼类的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性基因分型

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。...

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

本文描述了一种蛋白质组学工作流程，用于从细胞核亚细胞组分中鉴定特定目标蛋白的相互作用蛋白伙伴。该流程采用免疫亲和富集结合无标记质谱分析技术，包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、滤膜辅助样品制备、离线纯化、质谱分析以及后续的生物信息学分析流程。...

无需标记的免疫沉淀质谱工作流程用于大规模核相互作用组分析

本实验方案的目的是采用半靶向色谱-质谱联用方法检测血浆中的酚类代谢物。...

老年人血浆中酚类代谢物的半靶向超高效液相色谱-质谱联用分析

我们构建了一个整合了XY-Meta和metaX的非靶向代谢组学工作流程。在本方案中，我们展示了如何使用XY-Meta从开放获取的谱图参考数据库中生成诱饵谱图库，随后进行错误发现率（FDR）控制，并在完成代谢组学谱图鉴定后，利用metaX对代谢物进行定量分析。...

基于FDR控制的非靶向代谢组学鉴定与定量一体化工作流程

本实验方案描述了一种在小麦中进行全氟烷基酸长距离运输的简单高效方法。...

研究全氟烷基酸在小麦中的长距离转运 通过 一种分根暴露技术

一种基于保留时间、迁移率和质谱碎裂模式对芬太尼类似物进行筛查的方法。...

使用液相色谱-迁移谱-飞行时间质谱联用技术筛查芬太尼类似物

学习利用高分辨率质谱结合目标筛选和非靶向筛选的工作流程，识别水样中的全氟和多氟烷基物质。该方法可同时定量已知PFAS并发现新型化合物，为环境监测提供全面分析方案。

采用靶向与非靶向筛查相结合的高分辨质谱工作流程鉴定全氟和多氟化合物

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